阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂及制备方法与流程

本发明涉及医药领域，具体涉及阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂及制备方法。

背景技术：

青光眼是视网膜神经节细胞和视神经轴突的缓慢进行性退化，如果未被诊断或未经治疗，则可能导致不可逆的失明。青光眼是全球第二大失明原因，占全部失明的12.3％。现代研究表明盐酸毛果芸香碱具有明显的降低眼压、控制炎症的效果，能够治疗原发性青光眼，包括开角型与闭角型青光眼，是临床治疗青光眼的一线用药。

盐酸毛果芸香碱的常用剂型是滴眼剂，这种剂型具有眼部滞留时间短，角膜透过性差等缺点。

药物递送的进展旨在通过增加角膜表面上的药物滞留时间和角膜透过性来提高生物利用度。

为了延长盐酸毛果芸香碱的作用时间，亟需一种增加盐酸毛果芸香碱的角膜透过性和生物利用度，降低药物使用频率，降低眼部刺激性的新的制剂。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂。

本发明的第二个目的是提供一种阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的制备方法。

本发明的技术方案概述如下:

阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将卵磷脂和胆固醇放在氯仿中，超声3-5min，得混悬液；将盐酸毛果芸香碱和渗透促进剂溶于甲醇中得溶液一；

(2)将所述混悬液和溶液一混匀，在35-50℃旋转蒸发除去有机溶剂，直至容器的底部形成均匀的脂质薄膜；

(3)将柔顺剂溶于纯水中得溶液二，将所述脂质薄膜溶解于溶液二中，得到混合初乳液；

(4)在功率100-200w的条件下，将混合初乳液超声10-60min，25-60℃温浴0.5-2h，得到盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂；

(5)将阳离子材料溶于纯水中得到溶液三，以转速为200-400rpm条件下搅拌所述盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂，将所述溶液三滴加至所述盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂中，搅拌0.5-2h，即得到阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂。

所述卵磷脂、胆固醇、盐酸毛果芸香碱、渗透促进剂、柔顺剂和阳离子材料的质量比为：400:20:(5-25):(0.1-0.5):(12-25):(12-20)；

所述卵磷脂与氯仿的比为40mg:1-3ml。

渗透促进剂优选为gelucire44/14(月桂酸聚乙二醇甘油酯peg-32)、labrasol(辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯peg-8)和transcutolp(二乙二醇单乙基醚)、transcutolhp(二乙二醇单乙基醚)中的一种或几种混合物。

柔顺剂优选为去氧胆酸钠，胆酸钠，乙醇和丙二醇中的一种或几种混合物。

阳离子材料优选为n-三甲基壳聚糖(季铵化程度≥60％)，羧甲基壳聚糖(取代度≥80％)，羟丙基壳聚糖(取代度≥80％)和羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐(取代度≥90％)中的一种或几种混合物。

上述方法制备的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂。

本发明的优点：

(1)本发明的制剂具有巨大的膜表面积，高度的粘附性，能改变药物理化性质，增加药物的透过性。

(2)能持续释放被包封的药物，具有长效缓释作用，降低药物的消除速率，从而降低给药频率，提高患者用药的依从性。

(3)本发明的制剂眼部刺激性弱，提高了制剂的安全性，适合长期使用。

(4)盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体属于自稳定分散体系，制剂的长期稳定性较高。

(5)能够采用传统方法灭菌,制备工艺相对简单。

附图说明

图1为阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂粒径结果图。

图2为用苏木精-伊红染色的兔的角膜(a，b)，结膜(c，d)和虹膜(e，f)的组织切片结果图。图中，ep：上皮细胞，st：基底细胞。其中a，c，e滴加磷酸盐缓冲溶液，b，d，f滴加阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂。

图3为阳离子修饰的罗丹明b柔性纳米脂质体制剂和罗丹明b溶液在不同时间点的眼部滞留结果图。其中a为罗丹明b溶液；b为罗丹明b柔性纳米脂质体制剂，1：眼部，2：内眼角和鼻泪管区。

图4为阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂(图中为制剂)及盐酸毛果芸香碱溶液(盐酸毛果芸香碱的ph为6.8的磷酸缓冲盐溶液，图中为溶液)，在泪液中的药时曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将400mg卵磷脂和20mg胆固醇放在20ml氯仿中，超声4min，得混悬液；将20mg盐酸毛果芸香碱和0.5mggelucire44/14(月桂酸聚乙二醇甘油酯peg-32)溶于10ml甲醇中得溶液一；

(2)将混悬液和溶液一混匀，在40℃旋转蒸发除去有机溶剂，直至容器的底部形成均匀的脂质薄膜；

(3)将25mg去氧胆酸钠溶于纯水中得溶液二，将所述脂质薄膜溶解于溶液二中，得到混合初乳液；

(4)在功率150w的条件下，将混合初乳液超声60min，60℃温浴0.5h，得到盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂；

(5)将20mgn-三甲基壳聚糖(季铵化程度≥60％)溶于纯水中得到溶液三，以转速为300rpm条件下搅拌所述盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂，将所述溶液三滴加至所述盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂中，搅拌1h，得到阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂。

取实施例1制备的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂通过粒径测定仪测定粒径分布，平均粒径为123nm。见图1。

实施例2

阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将400mg卵磷脂和20mg胆固醇放在20ml氯仿中，超声3min，得混悬液；将10mg盐酸毛果芸香碱和0.3mglabrasol(辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯peg-8)溶于10ml甲醇中得溶液一；

(2)将混悬液和溶液一混匀，在45℃旋转蒸发除去有机溶剂，直至容器的底部形成均匀的脂质薄膜；

(3)将25mg胆酸钠溶于纯水中得溶液二，将所述脂质薄膜溶解于溶液二中，得到混合初乳液；

(4)在功率200w的条件下，将混合初乳液超声10min，25℃温浴2h，得到盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂；

(5)将20mg羟丙基壳聚糖(取代度≥80％)溶于纯水中得到溶液三，以转速为300rpm条件下搅拌所述盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂，将所述溶液三滴加至所述盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂中，搅拌1h，得到阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂。

经检测，平均粒径为135nm。

实施例3

阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将400mg卵磷脂和20mg胆固醇放在10ml氯仿中，超声4min，得混悬液；将5mg盐酸毛果芸香碱和0.1mgtranscutolhp(二乙二醇单乙基醚)溶于10ml甲醇中得溶液一；

(2)将混悬液和溶液一混匀，在35℃旋转蒸发除去有机溶剂，直至容器的底部形成均匀的脂质薄膜；

(3)将12mg1，2丙二醇溶于纯水中得溶液二，将所述脂质薄膜溶解于溶液二中，得到混合初乳液；

(4)在功率100w的条件下，将混合初乳液超声50min，30℃温浴1h，得到盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂；

(5)将15mg羧甲基壳聚糖(取代度≥80％)溶于纯水中得到溶液三，以转速为200rpm条件下搅拌所述盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂，将所述溶液三滴加至所述盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂中，搅拌2h，得到阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂。

经检测，平均粒径为129nm。

实施例4

阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将400mg卵磷脂和20mg胆固醇放在30ml氯仿中，超声5min，得混悬液；将25mg盐酸毛果芸香碱、0.5mg渗透促进剂(质量比为1：1的gelucire44/14和transcutolp(二乙二醇单乙基醚))溶于10ml甲醇中得溶液一；

(2)将混悬液和溶液一混匀，在50℃旋转蒸发除去有机溶剂，直至容器的底部形成均匀的脂质薄膜；

(3)将20mg柔顺剂(体积比为1：1的乙醇和1，2-丙二醇)溶于纯水中得溶液二，将所述脂质薄膜溶解于溶液二中，得到混合初乳液；

(4)在功率150w的条件下，将混合初乳液超声30min，30℃温浴1h，得到盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂；

(5)将6mg羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐(取代度≥90％和6mg羟丙基壳聚糖(取代度≥80％)溶于纯水中得到溶液三，以转速为400rpm条件下搅拌所述盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂，将所述溶液三滴加至所述盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体制剂中，搅拌0.5h，得到阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂。

经检测，平均粒径为120nm。

实施例5

阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的体外释放考察

取实施例1制备得到的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂进行考察。本实验采用的释放介质为ph6.8的磷酸盐缓冲溶液，采用膜透析法考察阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的体外释药性能。

具体实验步骤为：

(1)精密称取盐酸毛果芸香碱2mg，加入适量ph为6.8的磷酸缓冲盐溶液溶解后，定容至10ml，为盐酸毛果芸香碱溶液。

(2)分别精密量取2.0ml阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂和盐酸毛果芸香碱溶液置于透析袋中，两端用透析袋夹夹紧，将透析袋浸入60ml新鲜制备的磷酸盐缓冲液中，设置磁力搅拌器转速为200rpm，温度为34±0.5℃。分别于0.25，0.5，1，2，4，6，8，10和12h取样1ml，同时补加等温的同体积的释放介质。用hplc法测定药物释放量，每个样品平行实验三次。

(3)累计释放量(qn)和累积释放百分率(f％)分别由公式(1)和公式(2)求得：

其中qn是每个时间点的累积释放量；f％是每个时间点的累积释放百分比；c1是第一个时间点测量的药物浓度；v0是溶出介质的总体积；ci是在第i个采样时间点测量的药物浓度；c0是总药物浓度。

阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂体外释放拟合结果见表1。

表1阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂外释放拟合结果

将实施例1的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的释放数据进行零级、一级、higuchi扩散方程拟合并进行回归分析，比较各回归方程的相关系数。所得的拟合方程中以higuchi方程和ritger-peppas方程的r值最高，说明阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂具有缓释作用。

实施例6

阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的安全性考察

取实施例1制备得到的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂进行考察。采用改良的draize实验和组织切片实验考察阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的安全性。

具体实验步骤为：

(1)改良的draize实验：每只兔子的右眼下结膜囊每天滴加100μl实施例1制备得到的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂，持续7天，而相应的左眼每天滴加相同量的磷酸盐缓冲溶液(ph6.8)作为对照。在最后一次滴加结束后的0.5，1，2，3，6，12，24，32和48小时观察每只兔子眼睛。在每次观察时计算和评估刺激指数(iirr)。

(2)组织切片实验：眼睛刺激性研究完成后，所有的兔子静脉注射空气致死。然后，立即分离其角膜、虹膜和结膜并分别固定在4％甲醛中。从石蜡块切割5μm厚度的切片，并用苏木精和伊红(h&e)染色。用光学显微镜(bx51w1，olympusopticalco.，ltd，tokyo，japan)进行组织学检查，以检查上皮细胞和基底细胞的变化。

(3)改良的draize实验中阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂对角膜，虹膜和结膜的刺激指数(iirr)分别为0，0，0。兔眼角膜，结膜和虹膜的上皮(ep)和基质(st)结构如图2所示。与对照组相比，阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂组在三组织中无显着差异。结果表明，角膜结构和完整性不受影响。

实施例2、3、4的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂替代本实施例的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体，结果表明，角膜结构和完整性不受影响。

实施例7

阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的滞留时间考察

取实施例1制备得到的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂进行考察。采用小动物成像法考察阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的眼内滞留性能。

具体实验步骤为：

(1)将实施例1的盐酸毛果芸香碱等量替换为罗丹明b，同法制备阳离子修饰的罗丹明b柔性纳米脂质体制剂；将罗丹明b2mg溶解于10mlph为6.8的磷酸缓冲盐溶液中制成罗丹明b溶液作为对照。进行小动物活体成像，考察处方的滞留性能。

(2)实验前先观察并记录每只家兔眼球的情况，已有病变或炎症者，剔除不用。在成像之前，用水合氯醛(注射2.5ml·kg^-1)经耳缘静脉注射麻醉。精确地将20μl的阳离子修饰的罗丹明b柔性纳米脂质体制剂直接注入右眼结膜囊，左眼用作对照(罗丹明b溶液)。手动闭合眼睑10s使药物在角膜分布。并在0，30，90，150min时进行成像观察。

结果如图3所示，表明阳离子修饰的罗丹明b柔性纳米脂质体制剂在眼部的滞留时间明显延长。

实施例8

阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的药代动力学考察

取实施例1制备得到的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂进行考察。采用改良的泪液条实验考察阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂的生物利用度。

具体实验步骤为：

(1)取实施例1制备得到的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂100ml，滴入每只兔子右眼下结膜囊，而每只兔子的左眼接受相同体积的盐酸毛果芸香碱溶液进行比较。眼睛手动关闭10秒，然后在0.25，0.5，0.75，1，3，6，9，12h收集泪液样品。

(2)将干燥的滤纸条(40mm×5mm)轻轻地插入兔子的下眼皮中保持10s收集样品。将每个泪液条称重，并计算收集的泪液量。

(3)将条带放入离心管中，向管中加入1ml甲醇，通过涡旋90秒从条带中提取盐酸毛果芸香碱，然后将管以10000rpm离心10分钟。通过hplc测定上清液中盐酸毛果芸香碱的浓度，每个样品平行实验三次。

(4)研究采用非房室模型计算药动学参数，盐酸毛果芸香碱结果见表2。

表2盐酸毛果芸香碱局部给药后药动学参数

tmax，达峰时间；cmax，盐酸毛果芸香碱的最大浓度；auc，曲线下面积；t1/2，半衰期；mrt，平均滞留时间

*：相对于pn溶液，p<0.05；**：相对于pn溶液，p<0.01

表2中阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体的auc为对照溶液的4.55倍。表明阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂能够提高药物在房水中的溶解度，从而提高生物利用度。阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂及盐酸毛果芸香碱溶液的药时曲线见图4。

实施例2、3、4的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体眼用制剂替代本实施例的阳离子修饰的盐酸毛果芸香碱柔性纳米脂质体，其效果与本实施例的结果相似。