本发明属于生物医药领域，涉及基因表达抑制剂及应用，具体涉及一种抑制ciapin1基因表达的中药药对及在肿瘤治疗方面的应用。
背景技术：
：细胞因子诱导的凋亡抑制分子1(ciapin1)是受体依赖性激酶ras信号通路中的效应分子。ciapin1广泛分布于胎儿和成人的正常组织中，但表达水平在不同组织间有差异。此外，ciapin1在恶性肿瘤中也有表达，如肝癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、白血病等。研究证实，ciapin1在肿瘤的增殖、凋亡、分化、血管生成及多药耐药等过程中均发挥重要的作用，抑制ciapin1的表达有助于抑制肿瘤的增殖、逆转耐药性(参考文献：adenovirus-deliveredciapin1smallinterferingrnainhibitshccgrowthinvitroandinvivo.carcinogenesis,2008,29:1587-1593；ciapin1基因对k562细胞增殖能力的影响，中国实验血液学杂志2014年22卷3期；ciapin1对hepg2细胞增殖和细胞周期的影响，实用肝脏病杂志2018年21卷1期；敲除ciapin1基因提高白血病k562细胞对伊马替尼的敏感性，中国肿瘤生物治疗杂志2018年25卷3期)。技术实现要素：本发明目的在于提供一种抑制ciapin1基因表达的中药药对及在肿瘤治疗方面的应用。本发明通过如下技术方案得以实现：药对1：一种抑制ciapin1基因表达的中药药对，包括垂盆草和巴戟天。优选地，垂盆草和巴戟天的重量份比为1:1。上述中药药对在治疗白血病方面的应用。一种抑制ciapin1基因表达的药物制剂，活性成分为垂盆草和巴戟天药对的提取物，辅料为药学上可以接受的载体或赋形剂。优选地，垂盆草和巴戟天的重量份比为1:1。上述药物制剂在治疗白血病方面的应用。药对2：一种抑制ciapin1基因表达的中药药对，包括垂盆草和伸筋草。优选地，垂盆草和伸筋草的重量份比为1:1。上述中药药对在治疗白血病方面的应用。一种抑制ciapin1基因表达的药物制剂，活性成分为垂盆草和伸筋草药对的提取物，辅料为药学上可以接受的载体或赋形剂。优选地，垂盆草和伸筋草的重量份比为1:1。上述药物制剂在治疗白血病方面的应用。药对3：一种抑制ciapin1基因表达的中药药对，包括垂盆草和白茅根。优选地，垂盆草和白茅根的重量份比为1:1。上述中药药对在治疗白血病方面的应用。一种抑制ciapin1基因表达的药物制剂，活性成分为垂盆草和白茅根药对的提取物，辅料为药学上可以接受的载体或赋形剂。优选地，垂盆草和白茅根的重量份比为1:1。上述药物制剂在治疗白血病方面的应用。本发明有益效果：本发明提供的中药药对可以有效抑制ciapin1基因表达，该中药药对通过抑制ciapin1基因表达可以在体内外有效抑制白血病k562细胞的增殖，可以用于治疗白血病。附图说明图1为中药药对对移植瘤生长的影响；图2为中药药对对移植瘤中ciapin1表达水平的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容。实施例1：中药药对对ciapin1基因表达的影响一、实验材料垂盆草、巴戟天、伸筋草、白茅根购自亳州中药材市场，并与《中国药典》2015版第一部药材和饮片中收载的药材性状进行比对确认。将巴戟天、伸筋草、白茅根分别与垂盆草按照重量份比1:1混合作为药对1、药对2和药对3。分别将垂盆草、巴戟天、伸筋草、白茅根、药对1、药对2和药对3用10倍体积水煮沸并维持沸腾状态15分钟，煮3次，合并3次药液，浓缩冷冻干燥分别得到垂盆草、巴戟天、伸筋草、白茅根、药对1、药对2和药对3的提取物，以该提取物进行后续试验。rpmi1640培养液及胎牛血清fbs为美国gibco公司产品；ciapin1基因特异性干扰载体pgpu6/gfp/neoshciapin1由上海吉玛公司合成；lipofectaminetm2000为美国invitrogen公司产品；胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自天根生物科技有限公司；sybrgreen实时定量试剂盒为罗氏公司产品；抗ciapin1抗体为美国abcam公司产品。二、实验方法1、细胞培养k562细胞复苏后，置于含10％胎牛血清的rpmi1640培养液中，于37℃、5％co2培养箱内培养，收集对数期细胞用于试验。2、细胞转染根据ncbi基因库中ciapin1的核苷酸序列(genbank:nm020313.2)，设计ciapin1特异性干扰序列，由上海吉玛公司分别合成ciapin1干扰载体pgpu6-shrna-ciapin1。取对数生长期的k562细胞，调整细胞密度为1×106/ml，接种6孔板中，1ml/孔。按照lipofectaminetm2000说明书转染细胞，转染成功后的k562细胞命名为k562-shrna，备用。3、分组及处理方法试验组别包括：空白对照组、阳性对照组、垂盆草组、巴戟天组、伸筋草组、白茅根组和药对1～3组。处理方法如下：垂盆草、巴戟天、伸筋草、白茅根组：取对数生长期的k562细胞，调整细胞密度为1×106/ml，接种24孔板中，1.0ml/孔；分别加入垂盆草、巴戟天、伸筋草、白茅根提取物至终浓度为10μg/ml；药对1～3组：取对数生长期的k562细胞，调整细胞密度为1×106/ml，接种24孔板中，1.0ml/孔；分别加入药对1～3提取物至终浓度为10μg/ml；阳性对照组：取对数生长期的k562-shrna细胞，调整细胞密度为1×106/ml，接种24孔板中，1.0ml/孔；使用空白培养基培养；空白对照组：取对数生长期的k562细胞，调整细胞密度为1×106/ml，接种24孔板中，1.0ml/孔；使用空白培养基培养。4、real-timepcr检测各组细胞于37℃、5％co2培养箱内培养24h后，收集细胞，trizol法提取细胞总rna，分光光度计测出总rna的浓度，取2μgrna逆转录成cdna，按照sybrgreenpcr试剂盒说明书加入各个反应物，用abi7500系统进行扩增反应。反应条件为：95℃，10s；95℃，5s；60℃，40s；40个循环。以gapdh为内参照物。ciapin1上游引物为5'-agtggtctgggataagtc-3'，下游引物为5'-cctgggactaaacctgac-3'；gapdh上游引物为5'-gaaggtgaaggtcggagtc-3'，下游引物为5'-gaagatggtgatgggatttc-3'。5、westernblot检测各组细胞于37℃、5％co2培养箱内培养24h后，收集细胞，ripa裂解液裂解细胞提取总蛋白，bca定量试剂盒测定蛋白浓度，并将蛋白裂解液进行10％sds-page凝胶电泳。使用湿转法转移蛋白至硝酸纤维素膜，用含10％脱脂奶粉的tbs封闭液室温封闭1h，加入一抗(ciapin1、gapdh兔抗体，1:1000)孵育过夜，再加入hrp标记的抗兔二抗(1:5000)室温孵育1h，使用ecl化学发光法显色，扫描结果。6、统计学方法以均值±sd表示，spss19.0软件进行单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。三、实验结果1、中药药对对ciapin1mrna表达的影响与空白对照组相比，药对1～3组ciapin1mrna相对表达水平显著降低，接近于阳性对照组；垂盆草、巴戟天、伸筋草、白茅根组ciapin1mrna相对表达水平与空白对照组无明显差异。结果见表1。该结果表明，垂盆草、巴戟天、伸筋草、白茅根单独不能抑制ciapin1的表达，但是将垂盆草与巴戟天、伸筋草、白茅根分别组成药对后可以显著抑制ciapin1的表达。因此，可以将药对1～3用作ciapin1基因表达的抑制剂。表1中药药对对ciapin1mrna表达的影响组别ciapin1/gapdh组别ciapin1/gapdh空白对照组1.00±0.05阳性对照组0.38±0.03垂盆草组0.96±0.06药对1组0.41±0.03巴戟天组0.93±0.05药对2组0.44±0.05伸筋草组0.98±0.05药对3组0.39±0.04白茅根组0.95±0.042、中药药对对ciapin1蛋白表达的影响与空白对照组相比，药对1～3组ciapin1蛋白相对表达水平显著降低，接近于阳性对照组；垂盆草、巴戟天、伸筋草、白茅根组ciapin1蛋白相对表达水平与空白对照组无明显差异。结果见表2。该结果表明，垂盆草、巴戟天、伸筋草、白茅根单独不能抑制ciapin1的表达，但是将垂盆草与巴戟天、伸筋草、白茅根分别组成药对后可以显著抑制ciapin1的表达。因此，可以将药对1～3用作ciapin1基因表达的抑制剂。表2中药药对对ciapin1蛋白表达的影响组别ciapin1/gapdh组别ciapin1/gapdh空白对照组1.01±0.06阳性对照组0.41±0.04垂盆草组0.96±0.05药对1组0.46±0.04巴戟天组0.94±0.05药对2组0.49±0.06伸筋草组0.99±0.07药对3组0.45±0.05白茅根组0.95±0.05实施例2：中药药对对白血病k562细胞体外增殖的影响一、实验材料mtt为美国sigma公司产品，其他同实施例1。二、实验方法1、mtt法检测取对数生长期的k562、k562-shrna细胞，调整至浓度1×106/ml，将100μl细胞悬液加入96孔培养板中，按照实施例1分组及处理方法于37℃、5％co2培养24h后，加入5mg/mlmtt溶液10μl继续孵育4h。离心，去上清，加入二甲基亚砜100μl，振荡溶解10min。用酶联免疫检测仪测定570nm波长下的吸光度(a)值，计算细胞增殖抑制率(％)。2、统计学方法以均值±sd表示，spss19.0软件进行单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。三、实验结果与空白对照组比，阳性对照组细胞增殖显著被抑制，药对1～3组细胞也显著被抑制，抑制率显著高于垂盆草、巴戟天、伸筋草、白茅根组。结果见表3。表3中药药对对k562细胞增殖的影响组别抑制率(％)组别抑制率(％)阳性对照组72.5±6.3垂盆草组9.6±4.7药对1组54.2±5.9巴戟天组11.8±5.4药对2组63.8±6.1伸筋草组10.3±5.1药对3组57.8±6.6白茅根组12.6±5.5实施例3：中药药对对白血病k562细胞体内增殖的影响一、实验材料雄性balb/c裸鼠，8周龄。所有裸鼠分笼饲养于spf级动物房，采用标准化光照及饮食，适应期1周，处死前12h开始禁食。中药药对提取物制备方法同实施例1。二、实验方法1、移植瘤模型的建立收集对数生长期的k562细胞，调整浓度为5×107/ml，用一次性注射器将细胞注射至balb/c裸鼠右侧腋窝皮下，0.1ml/只，连续10d，瘤块长至约5mm×5mm×5mm认为建模成功，成瘤率为100％。2、分组及给药试验组别包括：空白对照组和药对1～3组，每组5只。药对1～3组分别ip给药50mg/kg/d，对照组ip等体积生理盐水1ml；连续给药28d。3、瘤体体积的测定每4天测量肿瘤长、短径，计算瘤体体积。第28天处死全部裸鼠，称定瘤质量，计算瘤体积和瘤体积抑制率。瘤体体积＝长径×短径2。瘤体积抑制率＝(对照组平均瘤体积-给药组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积。4、westernblot检测瘤体ciapin1表达水平取瘤体，pbs磷酸盐缓冲液洗涤3～5次，手术剪剪碎后用ripa裂解液裂解肿瘤细胞提取总蛋白，bca定量试剂盒测定蛋白浓度，并将蛋白裂解液进行10％sds-page凝胶电泳。使用湿转法转移蛋白至硝酸纤维素膜，用含10％脱脂奶粉的tbs封闭液室温封闭1h，加入一抗(ciapin1、gapdh兔抗体，1:1000)孵育过夜，再加入hrp标记的抗兔二抗(1:5000)室温孵育1h，使用ecl化学发光法显色，扫描结果。5、统计学方法以均值±sd表示，spss19.0软件进行单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。三、实验结果1、中药药对对移植瘤生长的影响与空白对照组相比，药对1～3组移植瘤生长显著被抑制，结果见表4和图1。表4中药药对对移植瘤生长的影响组别瘤体积抑制率(％)药对1组57.3药对2组58.9药对3组62.42、中药药对对移植瘤中ciapin1表达水平的影响与空白对照组相比，药对1～3组移植瘤中ciapin1表达水平显著降低，结果见图2。综上可见，本发明提供的中药药对可以有效抑制ciapin1基因表达，该中药药对通过抑制ciapin1基因表达可以在体内外有效抑制白血病k562细胞的增殖，可以用于治疗白血病。上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。当前第1页12