本发明属于抑制药物技术领域，尤其涉及一种对人乳腺癌mda-mb-231细胞的抑制药物及其制备方法。
背景技术：
近年来，恶性肿瘤已经成为人类健康杀手之一。世界卫生组织国际癌症研究中心(circ)2012年发布的数据显示，全球每年癌症新发病例为1400多万，其中乳腺癌有新增病例167.1万，死亡为52.2万，与2008年的发病率相比，增长超过20％，病死率增长超过14％。在中国，人口基数大，每年新增乳腺癌病例占全球比例的12.2％，而病死率则占全球比例的9.6％。因中国乳腺癌每年诊断新增病例167.1万，死亡为52.2万，与2008年的发病率率比较低，只有欧美等国的一半左右，到2021年，中国乳腺癌总数将超过250万。根据我国肿瘤疾病预防控制中心的统计显示，乳腺癌已成为城市女性死亡的第一大杀手，在农村为第四大威胁女性生命的因素，发病率高，亦导致高致死人数。目前临床上常用化疗药物(如紫衫醇、环磷酰胺)因严重的毒副作用，且易出现耐药现象，亦是导致乳癌病死率增高的原因之一。因此，开发研制抗乳腺癌的新药，是广大研究工作者的奋斗目标，具有重大意义。
苦蘵(physalisangulatal.)为茄科酸浆属植物，全世界均有分布，主产美洲热带及温带地区，在我国长江以南广泛分布，别名炮仔灯、灯笼草、天泡子、天泡草、黄姑娘、小酸浆、打额泡等，全株供药用，性味苦、寒，功能清热解毒、利尿消肿、消肿散结、凉血止血，主治感冒、肺热咳嗽、咽喉肿痛、牙龈肿痛、湿热黄疸、小便不利、外用治脓泡疮等，作为民间常用中药，在广东常用治咽喉肿痛等疾病。目前，国内对苦蘵的研究甚少，国外对该种植物的化学成分研究主要是酸浆苦素类化合物，此类化合物具有抗炎、抗菌、镇痛、细胞毒、抗肿瘤等多种活性。
(1)目前化疗药物如环磷酰胺、阿霉素等，由于不仅抑制肿瘤细胞的增殖，同时亦能抑制正常细胞的增殖，如骨髓细胞、表皮细胞，从而造成严重毒性反应，如骨髓抑制、严重贫血、免疫力下降、凝血功能障碍、脱发等，使得患者极度痛苦时还提高了死亡率。因骨髓抑制引起的出血、感染以及心脏、血管毒性造成的心肌梗死、心脏骤停、颅脑损伤已成为增加国内病死率的重要原因之一。
(2)天然药用植物是抗肿瘤药物开发的重要来源，与化学合成药物研发周期长、开发费用昂贵、毒副作用较大相比，从天然药用植物分离获得的抗肿瘤活性成分具有作用机制广泛、更具安全性和实用性等优势。从天然药物中提取的抗肿瘤成分能减轻癌症治疗中的不良反应和毒副作用。由于这类成分具有疗效突出、不良反应小等特点，在治疗肿瘤的药物使用中，选择天然产物来源的药物治疗是肿瘤防治的一种有效方式。因此，国内外学者越来越重视天然药物的研发。近年来从植物来源的药物使用率越来越高。我国天然药物资源丰富，历代医药名家在肿瘤防治的实践过程中积累了大量宝贵的临床用药经验。据经典古籍和论著专著记载，治疗肿瘤及肿瘤相关症状的草药达700～800种，但目前已完成抗肿瘤有效部位和活性成分系统研究的药物仅几十种。因此，从天然药用植物筛选抗肿瘤活性有效成分具有非常广阔的研发前景。若能将天然药物中抗肿瘤有效成分分离出来，明确其抗肿瘤作用及机理，为癌症的治疗提供新的药物，对于抗肿瘤药物的研发和肿瘤的治疗意义重大。已有研究表明，植物类抗肿瘤药物如长春花、红豆杉、喜树碱、汉防己等多种植物药中，分离提取抗肿瘤活性成分，开发出抗肿瘤药物。
苦蘵为茄科酸浆属植物，别名炮仔灯、灯笼草、天泡子、天泡草、黄姑娘、小酸浆、打额泡等，全世界均有分布。虽然药源很丰富，但从苦蘵中提取有效成分酸浆苦味素b(pb)的工艺流程不统一，pb的提取分离比较困难，研究者获得的pb样品不多。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前临床上常用化疗药物(如顺铂、阿霉素、环磷酰胺)因严重的毒副作用，且易出现耐药现象，亦是导致乳癌病死率增高的原因之一；同时对苦蘵的研究甚少。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对人乳腺癌mda-mb-231细胞的抑制药物及其制备方法。
本发明是这样实现的，所述对人乳腺癌mda-mb-231细胞的抑制药物，提取的酸浆苦味素b为经x射线衍射分析后，为纯pb，即pb的纯度为100％。
一种对人乳腺癌mda-mb-231细胞的抑制药物的服用方法为：
在体外进行实验，临用时取适量pb，配制成二甲基亚砜溶解，20mmol/l的贮存液，－20℃保存，实验前用1640培养基稀释至所需不同浓度使用。
所述对人乳腺癌mda-mb-231细胞的抑制药物的制备方法包括以下步骤：
步骤一，取苦蘵全株植物8kg研磨，用85％的乙醇冷浸提取3次，提取液减压浓缩得粗乙醇提取物；
步骤二，将醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇揑溶，减压浓缩得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
步骤三，将乙酸乙酯萃取物拌样，充分干燥，上中压制备色谱系统分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，经薄层检查合并为10个流分，其中流分7再拌样上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯，洗脱得到无色透明晶体。
所述酸浆苦味素b提取与分离步骤如下：
苦蘵全株植物2.6kg切碎，用体积分数为75％的乙醇冷浸提取3次，提取液减压浓缩得346.5g墨绿色干浸膏状提取物；将醇提取物分别用1倍体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇揑溶，直至各揑溶提取有机溶剂接近无色为止，分别合并数次萃取液，减压浓缩得石油醚萃取物a(36.4g)，乙酸乙酯萃取物b(21.6g)，正丁醇萃取物c(15.5g)；
取b部分浸膏加硅胶(200～300目)拌样，充分干燥，上中压制备色谱系统分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，经薄层检查合并为10个流分，流分2再拌样上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯(50∶1)洗脱，得化合物2(50mg)。
化合物2：无色柱状针晶(甲醇)，mp253～254℃。1h-nmr[400mhz，(cd3)2co]δ：6.92(1h，m，h-3)，6.50(1h，s，13-oh)，5.86(1h，dd，j＝10.4，2hz，h-2)，5.61(1h，brd，j＝6hz，h-6)，4.56(1h，brs，h-22)，4.40(1h，dd，j＝13.6，4.6hz，h-27)，3.76(1h，d，j＝13.6hz，h-27)，1.88(3h，s，ch3-21)，1.31(3h，s，ch3-28)，1.19(3h，s，ch3-19)。碳谱数据见表1。
表1苦蘵中化合物2碳谱数据(100mhz)
本发明采用四甲基偶氮唑盐比色法(mtt)检测pb对人乳腺癌mda-mb-231细胞的抑制作用，荧光显微镜观察吖啶橙(ao)染色细胞的变化，流式细胞术检测6，6'-四氯-1，1'，3，3'-四甲基咪唑并羰花青碘化物(jc-1)染色细胞凋亡；采用2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐(dcfh-da)法检测细胞活性氧(ros)含有量的变化；免疫印迹法(westernblot)检测pb对mda-mb-231细胞凋亡相关蛋白表达。结果pb可显著抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，呈剂量依赖性；随着pb浓度的增加，ao染色细胞形态与对照组相比，呈现凋亡特征；pb作用于mda-mb-231细胞后，与对照组比较，细胞线粒体膜电位明显下降；细胞内ros水平上升，具有显著性差异(p＜0.05)；pb作用人mda-mb-231细胞24h后，能促进促细胞凋亡蛋白bax的表达，提高激活型半胱氨酸蛋白酶-3(cleavedcaspase-3)的表达，降低抗细胞凋亡蛋白bcl-2、pro-caspase-3(半胱氨酸蛋白酶-3前体)蛋白表达水平(p＜0.05)。pb能降低细胞线粒体的膜电位，提升细胞ros水平，促进细胞凋亡，具有良好的抗肿瘤作用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的对人乳腺癌mda-mb-231细胞的抑制药物的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的酸浆苦素b的结构示意图。
图3是本发明实施例提供的pb对mda-mb-231细胞增殖的抑制作用示意图。
图4是本发明实施例提供的pb对mda-mb-231细胞凋亡的影响(×200)示意图。
图5是本发明实施例提供的pb对mda-mb-231细胞膜电位的影响示意图。
图6是本发明实施例提供的pb对mda-mb-231细胞ros水平的影响示意图。
图7是本发明实施例提供的pb对mda-mb-231细胞bcl-2、bax、pro-caspase-3、cleavedcaspase-3蛋白表达的影响(x±s，n＝3)示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的对人乳腺癌mda-mb-231细胞的抑制药物
如图1所示，本发明深蓝色提供的对人乳腺癌mda-mb-231细胞的抑制药物的制备方法包括以下步骤：
s101：取苦蘵全株植物8kg研磨，用85％的乙醇冷浸提取3次，提取液减压浓缩得粗乙醇提取物；
s102：将醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇揑溶，减压浓缩得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
s103：将乙酸乙酯萃取物拌样，充分干燥，上中压制备色谱系统分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，经薄层检查合并为10个流分，其中流分7再拌样上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯，洗脱得到无色透明晶体。
下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1、实验材料为：
(1)细胞；
人mda-mb-231细胞株，引自中山大学实验动物中心，加入5％的胎牛血清培养。
(2)药物；
pb由本实验制备，取苦蘵全株植物8kg研磨，用85％的乙醇冷浸提取3次，提取液减压浓缩得粗乙醇提取物(1067g)。将醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇揑溶，减压浓缩得石油醚萃取物(101g)、乙酸乙酯萃取物(49g)和正丁醇萃取物(48g)。将乙酸乙酯萃取物拌样，充分干燥，上中压制备色谱系统分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，经薄层检查合并为10个流分，其中流分7再拌样上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯(5:1)洗脱得到无色透明晶体，并经x射线衍射分析为纯pb(见图2)。临用时配制成贮存液(dmso溶解，20mmol/l)，－20℃保存。实验前，用1640培养基稀释至所需不同浓度。
(3)主要试剂；
甲基噻唑蓝(mtt，sigma公司)；吖啶橙(ao)试剂盒(北京斯百汇公司)；5，5'，6，6'-四氯-1，1'，3，3'-四乙基苯并咪唑羰花菁碘化物(jc-1)试剂盒、活性氧(ros)检测试剂盒(2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐，dcfh-da)、细胞裂解液(上海碧云天生物技术研究所)；b淋巴细胞瘤-2(bcl-2)、bcl-2相关x蛋白(bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和β-actin抗体(上海碧云天生物技术研究所)；胎牛血清(杭州四季青)；双抗(江苏凯基生物技术公司)；1640培养基(gibco公司)。
(4)仪器；
cell150二氧化碳培养箱(thermo)；w-cj-2f超净工作台(苏州净化)；eclipseti-fl倒置相差显微镜；荧光倒置显微镜(nikon)；epics-xl流式细胞仪(beck-man)；unique-20r多功能超纯水系统(厦门锐思捷)；imark多功能酶标仪；mini-protean垂直凝胶电泳；电转系统(bio-rad)等。
2、方法
2.1细胞培养；mda-mb-231细胞株，在37、5％co2培养箱中以1640高糖培养基培养，含5％胎牛血清、100ku/l青霉素、100mg/l链霉素，传3～4代进行后续实验。
2.2细胞增殖抑制实验；取对数生长mda-mb-231细胞，调整细胞密度为7×104/ml，以每孔100μl细胞悬液种于96孔板，培养24h后去培养基。再加入配置好的pb，终浓度为0.375、0.78、1.57、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/l，每组设置5个复孔，对照组加等量的培养基不加药物，同时设置空白组，不加细胞和药物，37、5％co2培养24h。去上清，每孔加入100μlmtt(5％，pbs配制)，孵育4h后弃上清，加入dmso(150μl/孔)，振荡5min于490nm处测定吸光度(od)，根据公式:细胞存活率＝[(实验组od－空白组od)/(对照组od－空白组od)]×100％计算。
2.3形态学观察；将密度为5×105/ml的mda-mb-231细胞悬液接种于12孔板，24h后弃去培养基。分为对照组、pb各处理组(根据mtt法测定结果，确定pb终浓度为1.5、3、6μmol/l)，加入相应药物和培养基，24h后观察细胞形态。
2.4吖啶橙染色观察结果；细胞接种方法同“2.3”项，24h后去除培养基，加入相应浓度pb干预，继续培养24后，再加入10μl(质量浓度为30mg/l)的ao染色液，避光，迅速在荧光显微镜下观察。
2.5线粒体膜电位的变化(jc-1染色)；药物处理细胞24后，收集细胞。每个样本加入1ml预先配制好的jc-1染色液(即按照jc-12.5：1000比例配制，边加边振荡，混匀，于37培养箱中温育)。孵育20min后，2mlpbs洗涤细胞2次，再以0.3mlpbs重悬细胞，迅速上机流式细胞仪检测，注意细胞流速不超过300个/s。
2.6细胞内活性氧(ros)水平检测；细胞经药物处理24h后，用培养基洗涤细胞，胰酶消化、离心收集细胞，加入预先配制好的染色液(含1：1000dcfh-da的无血清培养基)，混匀后37避光孵育30min，期间隔5min混匀1次，无血清细胞培养基洗涤细胞，上流式细胞仪检测荧光强度。
2.7westernblot法检测凋亡指标；收集6孔板细胞，用预冷的pbs洗3次，加入80μl细胞裂解液，冰上裂解1h后，收集细胞于ep管中。4℃12000r/mim离心20min，收集上清，用bio-rad法定量测定蛋白浓度。取30μg样品经sds-page电泳后转膜，5％脱脂奶粉封闭2h，加入一抗稀释液(bcl-2、bax、caspase-3，1：1000)，4过夜，pbst洗膜3次，每次10min。加入二抗工作液(1：5000)，2h后pbst洗膜，浸于含ecl化学发光试剂中，x光胶片压片曝光，显示结果。
2.8统计学处理；应用spss19.0统计软件分析，实验结果以
3、结果
3.1pb对mda-mb-231细胞增殖抑制作用pb在0.375～50μmol/l的范围内作用mda-mb-231细胞24h后，具有显著的抑制作用；随着pb浓度增加，细胞存活率逐渐降低。见图3。
3.2pb对mda-mb-231细胞生长形态、凋亡的影响倒置显微镜下可见，mda-mb-231细胞经pb作用24h后，细胞体积变小，细胞变圆、皱缩、松散、易脱落，随着药物浓度的增加，培养液中脱落细胞增多，可见细胞生长状态受到抑制，细胞密度逐渐减少。
ao染色观察：对照组可见，细胞核染色质为绿色荧光，均匀一致；pb作用于24h后，可见细胞呈现凋亡特征，为圆状、固缩状或团块状，可见凋亡小体(核染色质着绿色呈固缩状)，皱缩明显，见图4。
3.3pb对jc-1染色法检测pb对mda-mb-231细胞线粒体膜电位的影响对照组细胞线粒体膜电位正常，pb干预后，细胞出现明显的细胞分群现象，随着药物剂量增加，绿色荧光增强，表明pb能导致mda-mb-231细胞线粒体膜电位的降低。见图5。
3.4pb对mda-mb-231细胞ros水平的影响对照组细胞荧光强度值较低，给予药物pb干预24h后，细胞内ros水平升高显著，明显高于对照组(p＜0.05，表明pb能诱导mda-mb-231细胞内ros水平的升高(见表1、图6)。
3.5westemblot法检测pb对mda-mb-231细胞bcl-2、bax、pro-caspase-3、cleavedcaspase-3蛋白表达的影响与对照组比较，不同浓度的pb作用于mda-mb-231细胞24h后，mda-mb-231细胞bcl-2、pro-caspase-3蛋白表达下降，差异显(p＜0.05，p＜0.01)；而mda-mb-231细胞bax、cleavedcaspase-3蛋白表达上升，与对照组比较，具有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)。见图7。
表1pb对mda-mb-231细胞ros水平的影响(
注：与对照组比较，*p＜0.05，＊＊p＜0.01
根据实验结果，pb能明显抑制mda-mb-231细胞增殖，存在着剂量依赖关系；通过光镜观察、吖啶橙染色荧光观察可见，pb能明显诱导mda-mb-231细胞凋亡，随着药物浓度的增加，细胞凋亡现象亦明显。pb对mda-mb-231细胞的促凋亡作用，采用jc-1染色流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化。jc-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mmp)δψm的理想荧光探针，当线粒体膜电位较高时，体的基质中产生红色荧光；电位较低时，线粒体的基质中产生绿色荧光。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件，本实验显示，对照组细胞线粒体膜电位正常，经过pb干预后，细胞内绿色荧光增加明显，细胞出现分群现象，表明pb诱导了mda-mb-231细胞线粒体膜电位的下降，细胞出现凋亡。pb能导致人结肠癌细胞中的ros水平升高。本发明表明，pb作用于mda-mb-231细胞24h，dcfh-da染色流式检测可见细胞内ros水平升高，尤以中高剂量组ros水平升高显著。肿瘤细胞内由于抗氧化酶活性比较低，清除ros的效率也降低，当ros含有量升高时，能对肿瘤细胞具有良好的杀伤作用。
本发明证实了pb对mda-mb-231细胞抑制增殖、促凋亡的作用，为pb抗乳腺癌的活性提供了实验依据。其能降低mda-mb-231细胞的线粒体膜电位，升高ros水平，调节相关凋亡蛋白的表达，但pb抗肿瘤的作用机制仍未阐明。诸多信号通路如p53-ros、丝裂原活化蛋白激酶(mapk)等参与了肿瘤的发生发展。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。