本发明属于植物活性物质提取技术领域，具体涉及一种人工林枝叶黄酮类化合物酶处理与超声波辅助耦合高效提取方法。
背景技术：
我国是世界上最大的人工林种植面积国家之一。人工林是采用人工播种、栽植或扦插等方法和技术措施营造培育而成的森林，由人工造林或人工重新造林建立。人工林可以是引进新品种或是对本土树种的加强管理，按树种分为人工桉树林、人工马尾松林、人工杨树林、人工红豆杉等。人工林速生树种生长快、发展迅速、创汇多、同时兼有生态效益。
我国人工林非木质资源丰富，但对该资源的利用率低，未得到很好的利用。如桉树枝叶是桉树工业加工中的一种废弃物，通常直接扔掉，造成环境污染。桉树枝叶中含有丰富高附加值的生物活性成分，如酚类化合物、黄酮类化合物、多糖及皂苷等，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗衰老和抗病毒等生物活性作用，具有广泛的应用前景，但目前未得到很好的利用。黑荆树(acaciamearnsii)是含羞草科金合欢属树种，速生、常绿乔木，原产于澳大利亚，1950年后在中国广东、广西、福建、云南等地开始引种。黑荆树枝叶中含有多酚类化合物、原花色素、黄酮类化合物等活性物质。具有抗糖尿病、抗炎、抗氧化、抗癌、防治心脑血管疾病等生物活性作用，黑荆树枝叶是一种可制备附加值高的天然生物活性制剂的原料。红豆杉中所含的紫杉醇具有独特的抗癌作用和显著的疗效，常被用来治疗乳腺癌、卵巢癌、肺癌、食管癌等恶性肿瘤。但红豆杉种紫杉醇含量极低，而其中还含有如黄酮类化合物，多糖等生物活性较强的物质，如只利用红豆杉中的紫杉醇，则严重降低了红豆杉资源的利用率。所以对红豆杉枝叶中的黄酮类化合物提取和分离，提高红豆杉资源的综合利用率。
目前国内对黄酮类化合物提取方法主要为有机溶剂提取法、超声波辅助提取法和超临界流体萃取法。超临界流体萃取法设备费用高，生产能力低。传统的溶剂提取法具有溶剂耗量大，提取温度高，提取时间长，提取率低，有效成分损失大以及生产成本高等缺点，在工业化生产中的可行性差。
技术实现要素：
针对我国人工林枝叶资源利用率低，活性物质黄酮类化合物提取率不高的问题，本发明提出一种人工林枝叶黄酮类化合物耦合提取的方法，提高活性成分黄酮类化合物的提取效率。
本发明的技术方案如下：
一种人工林枝叶黄酮类化合物耦合提取方法，包括如下步骤：
(1)将人工林枝叶粉碎原料按照料液比1:8～16与果胶酶水溶液混合，在40～70℃水浴条件下酶解30～60min，过滤后得到酶解滤渣和酶解滤液；
(2)将步骤(1)得到的酶解滤渣按照料液比1:6～14与体积百分含量为50％～80％的乙醇混合，在40～60℃下超声提取30～80min，过滤后取滤液；
(3)合并步骤(1)和步骤(2)的滤液，得到的总滤液中含有黄酮类化合物。
优选的，所述果胶酶的质量占所述枝叶粉碎原料干重的0.05～0.5％。
优选的，所述果胶酶水溶液的质量浓度为0.005～0.025％。
优选的，所述步骤(2)超声的功率独立地为120～240w。
优选的，所述枝叶为桉树枝叶、黑荆树枝叶或红豆杉枝叶。
优选的，所述总滤液经减压浓缩，液-液萃取，再经大孔吸附树脂分离，得黄酮类化合物。
现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种人工林枝叶中黄酮类化合物耦合提取方法，包括如下步骤：将人工林枝叶粉碎原料按照料液比1:8～16与果胶酶水溶液混合，在40～70℃水浴条件下浸泡处理30～60min，过滤后得到滤渣和滤液；将得到的滤渣按照料液比1:6～14与体积百分含量为50％～80％的乙醇混合，在40～60℃下超声提取30～80min，过滤后取滤液；合并前两次得到的滤液。本发明的果胶酶处理与超声辅助耦合提取，提取的活性成分得率最高，比传统的有机溶剂提取得率高20％以上，比超声波辅助提取高6％以上。本发明是一种低温、绿色、高效提取方法。解决了有效成分的提取率受胞内外平衡浓度的限制、提取时间长、耗费的溶剂多，提取效率低、活性成分易变性等缺点，且具有原料普适性强等特点，在人工林枝叶活性成分黄酮类化合物提取加工生产中具有广泛的应用前景。
具体实施方式
本发明提供了人工林枝叶中黄酮类化合物耦合提取方法，包括如下步骤：
(1)将人工林枝叶粉碎原料与果胶酶水溶液按照料液比1:8～16混合，在40～70℃水浴条件下酶解30～60min，过滤后得到酶解滤渣和酶解滤液；
(2)将步骤(1)得到的酶解滤渣按照料液比1:6～14与体积百分含量为50％～80％的乙醇混合，在40～60℃下超声提取30～80min，过滤后取超声滤液；
(3)合并步骤(1)和步骤(2)的滤液，得到的总滤液中含有黄酮类化合物。
本发明对人工林枝叶的种类没有特殊限定，本领域中人工林种植的树种枝叶都可以用本发明的提取方法进行黄酮类化合物活性成分的提取。在本发明具体实施例中，优选以桉树、黑荆树、红豆杉3种人工林为例，对该枝叶中的黄酮类化合物活性成分进行了果胶酶处理与超声辅助耦合提取。需要说明的是，本发明的提取方法也可以用于自然条件下生长的林木枝叶中黄酮类化合物的提取。
本发明对人工林枝叶粉碎的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员的常规粉碎方法即可。优选将采集的人工林枝叶风干，用粉碎机粉碎，得到人工林枝叶粉碎原料。本发明对人工林枝叶粉碎的颗粒大小没有特殊限定，原则上粒度小有利于枝叶中活性物质的溶出。本发明中，优选将所述人工林枝叶粉碎为1～20mm，更优选为2～10mm。
本发明中，将人工林枝叶粉粹后的物料与果胶酶水溶液混合，得到混合物料。本发明所述人工林枝叶粉碎料与果胶酶水溶液的料液比优选为优选为1:10～14，进一步优选为1:12～13。本发明所述果胶酶水溶液的质量浓度优选为0.005～0.025％，更优选为0.010～0.015％。本发明的果胶酶为本领域技术人员众所周知的果胶酶，在本发明具体实施例中，优选采用p15果胶酶，康地恩生物公司本发明果胶酶对植物细胞的细胞壁结构中的果胶成分进行酶解，进而减少传质阻力，使植物细胞中的活性物质充分释放，且活性物质的活性可以得到较好的保护，从而提高活性物质的提取效率和提取率。本发明中，所述果胶酶的质量占所述人工林枝叶粉碎物料干重的0.05～0.5％，更优选为0.1～0.3％，ph值为6～6.5。本发明将所述人工林枝叶粉碎原料与果胶酶水溶液的混合物料进行水浴处理，对人工林枝叶中的果胶进行充分酶解，使人工林枝叶中的黄酮类活性物质充分溶出。本发明所述水浴的温度优选为50～60℃，水浴的时间优选为40～50min。由于人工林枝叶中含有较多的果胶及黏树脂，本发明在实验中发现采用酶处理过程时同时超声，溶液过滤时非常困难，同时黄酮的提取得率降低。
本发明将水浴酶解处理后的物料液过滤，过滤得到酶解滤渣和酶解滤液。本发明对过滤的方式没有特殊限定，采用本领域中的常规过滤方式即可。
本发明中，将酶解滤渣在乙醇溶液中进行超声提取。利用超声波空化作用以及机械震动等次级效应来改善目标成分在溶剂中的扩散与混合，提高萃取效率，缩短提取时间短，同时黄酮类活性化合物的物质结构和生物活性不受影响。本发明所述滤渣与乙醇溶液的质量体积比1:6～14，优选为1:8～14，更优选为1:10～12。本发明所述的乙醇的体积浓度优选为60％～70％。本发明所述超声温度优选为45～55℃，超声的时间优选为50～70min，更优选为60min。所述超声的功率优选120～240w，更优选为140～180w。将再次超声处理后的物料过滤，得到滤液和滤渣。
合并两次得到滤液，总滤液中含有黄酮类化合物。滤液合并后，总滤液经减压浓缩，液-液萃取，再经大孔吸附树脂分离，得黄酮类化合物。测定合并滤液中的黄酮类化合物含量，计算黄酮的得率。
本发明对黄酮类化合物含量的检测方法没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的检测方法。在本发明具体实施例中，优选采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定黄酮的含量，计算黄酮的提取得率。结果表明：本发明的方法提取桉树、黑荆树、红豆杉等人工林枝叶黄酮类化合物提取得率最高，比传统的有机溶剂提取得率高20％以上，比超声波辅助提取高6％以上，是一种低温、绿色高效提取人工林枝叶活性成分的方法。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
桉树枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)桉树枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:14加入0.1mg/mlp15果胶酶溶液，在50℃的水浴条件下浸泡处理40min，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，滤渣中再按照料液比为1:14加入60％乙醇溶液，在50℃下超声提取40min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。测定总黄酮的含量，计算黄酮类化合物的得率。
对比例1-1
桉树枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)桉树枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:14加入0.1mg/mlp15果胶酶溶液，在50℃下超声处理40min(超声功率144w)，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料再按照料液比为1:14加入60％乙醇溶液在50℃下超声提取40min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。测定总黄酮的含量，计算黄酮类化合物的得率。
对比例1-2
桉树枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)桉树枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:14加入水，在50℃的下水浴浸泡处理40min，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料再按照料液比为1:14加入60％乙醇溶液在50℃下水浴提取40min，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。测定总黄酮的含量，计算黄酮类化合物的得率。
对比例1-3
桉树枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)桉树枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:14加入水，在50℃下水浴浸泡处理40min，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料再按照料液比为1:14加入60％乙醇溶液在50℃下超声提取40min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。测定总黄酮的含量，计算黄酮类化合物的得率。
对比例1-4
桉树枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)桉树枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:14加入60％乙醇溶液，在50℃下超声处理40min(超声功率144w)，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料再按照料液比1:14加入60％乙醇溶液在50℃下超声提取40min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。测定总黄酮的含量，计算黄酮类化合物的得率。
实施例2
以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定实施例1及对比例1-1至对比例1-5得到滤液中的黄酮含量，计算黄酮的提取得率。具体测定方法如下：
本发明采用nano2-al(no3)3比色法测定桉枝叶提取液中总黄酮含量的方法如下：
称取105℃干燥至质量恒定的20mg芦丁标准品，置于50ml容量瓶中，用60％乙醇溶液溶解并定容，配制成质量浓度为0.4g.l-1芦丁标准溶液。准确移取芦丁标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4ml，置于10ml容量瓶中，分别加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8和0.6ml60％乙醇溶液，加入5％的nano2溶液0.5ml，摇匀，放置6min，加入10％的al(no3)3溶液0.5ml,摇匀，放置6min，加入4％的naoh溶液4ml，用60％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15min。以相应试剂为空白对照，在510nm波长处测定其吸光度。以吸光度(a)为纵坐标，以芦丁质量浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，得到总黄酮标准曲线回归方程为a＝2.7014x-0.0518，相关系数r2＝0.9998,线性范围为0～0.06g.l-1。
得率的计算：将提取得到的提取液稀释一定倍数，取稀释液1ml，按采用nano2-al(no3)3比色法测定吸光度，根据标准曲线计算总黄酮得率，按式计算总黄酮得率。
根据标准曲线计算总黄酮得率，按式(1)计算总黄酮得率。
式中：y―总黄酮得率，％；c―总黄酮质量浓度，mg/l；v―待测提取溶液的总体积，ml；m―原料的质量，g；w―原料含水率，％；n―稀释倍数。
总黄酮得率的结果见表1。
表1桉树枝叶中黄酮类化合物不同提取方法比较结果
由表1可以看出：通过对桉树枝叶中黄酮类化合物果胶酶与超声波辅助耦合提取方法比较，采用果胶酶水溶液先水浴浸泡处理后再用60％乙醇溶液超声提取，提取总黄酮的得率最高，为2.85％。此种耦合提取方法比对比例1-3传统的溶剂提取法(水溶液浸泡处理+60％乙醇溶液水浴提取)得率高21.28％；比对比例1-4超声辅助提取得率高12.20％。由于人工林枝叶中含有较多的果胶及黏树脂，实验中发现采用酶处理过程时同时超声，溶液过滤时非常困难，对比例1-1比对比例1提取得率低4.40％。所以，对比例1即果胶酶水溶液对桉树枝叶粉末原料先水浴浸泡处理再用60％乙醇溶液超声提取方法为较佳的桉树枝叶中黄酮类化合物果胶酶与超声波辅助耦合提取方法。
实施例3
黑荆树枝叶中总黄酮的提取
取3份3g(精确到0.001)黑荆树枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:12加入0.2mg/mlp15果胶酶溶液，在40℃下酶处理50min，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，滤渣中再按照料液比1:12加入60％乙醇溶液在45℃下超声提取30min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。测定总黄酮的含量，计算黄酮类化合物的得率。
对比例3-1
黑荆树枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)黑荆树枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:12加入0.2mg/mlp15果胶酶溶液，在40℃下超声处理50min(超声功率144w)，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料再按照料液比1:12加入60％乙醇溶液在45℃下超声提取30min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。
对比例3-2
黑荆树枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)黑荆树枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:12加入水，在40℃的条件下水浴浸泡处理50min，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料再按照料液比1:12加入60％乙醇溶液在45℃下水浴提取30min，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。
对比例3-3
黑荆树枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)黑荆树枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:12加入水，在40℃下水浴浸泡处理50min，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料再按照料液比1:12加入60％乙醇溶液在45℃下超声提取30min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。
对比例3-4
黑荆树枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)黑荆树枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:12加入60％乙醇溶液，在40℃下超声处理50min(超声功率144w)，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料再按照料液比1:12加入60％乙醇溶液在45℃下超声提取30min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。
实施例4
以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定实施例3及对比例3-1至对比例3-4得到滤液中的黄酮含量，计算黄酮的提取得率。具体测定方法同
实施例2。总黄酮得率的结果见表2。
表2黑荆树叶中黄酮类化合物不同提取方法比较结果
由表2可以看出：通过对黑荆树枝叶中黄酮类化合物果胶酶与超声波辅助耦合提取方法比较，实施例3采用果胶酶水溶液先水浴浸泡处理后，再用60％乙醇溶液超声提取，提取总黄酮的得率最高，为2.83％。此种耦合提取方法比对比例3-2传统的溶剂提取法(水溶液浸泡处理+60％乙醇溶液水浴提取)得率高24.12％；比对比例3-4超声辅助提取(60％乙醇溶液超声处理+60％乙醇溶液超声提取)得率高6.79％。所以，果胶酶水溶液先水浴处理后再用60％乙醇溶液超声提取方法为较佳的黑荆树枝叶中黄酮类化合物果胶酶与超声波辅助耦合提取方法。
实施例5
红豆杉树枝叶中总黄酮的提取
取3份3g(精确到0.001)红豆杉枝叶粉碎原料于锥形瓶中，按照料液比1:10加入0.3mg/mlp15果胶酶溶液，在60℃下处理30min，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，滤渣再按照料液比1:10加70％乙醇在60℃下超声提取70min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。
对比例5-1
红豆杉枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)红豆杉枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:10加入0.3mg/mlp15果胶酶溶液，在60℃下超声处理30min(超声功率144w)，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料再按照料液比1:10加入70％乙醇溶液在60℃下超声提取70min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。
对比例5-2
红豆杉枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)红豆杉枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:10加入水，在60℃的条件下水浴浸泡处理30min，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料按照料液比1:10加入70％乙醇溶液在60℃下水浴提取70min，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。
对比例5-3
红豆杉枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)红豆杉枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:10加入水，在60℃下水浴浸泡处理30min，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料再按照料液比1:10加入70％乙醇溶液在60℃下超声提取70min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。
对比例5-4
红豆杉枝叶中总黄酮的提取
分别取3份3g(精确到0.001)红豆杉枝叶粉碎原料于100ml锥形瓶中，按照料液比1:10加入70％乙醇溶液，在60℃下超声处理30min(超声功率144w)，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，过滤后的物料再按照料液比1:10加入70％乙醇溶液在60℃下超声提取70min(超声功率144w)，过滤，合并两次的滤液，定容至100ml。
实施例6
以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定实施例5及对比例5-1至对比例5-4得到滤液中的黄酮含量，计算黄酮的提取得率。具体测定方法同
实施例2。总黄酮得率的结果见表3。
表3红豆杉枝叶中黄酮类化合物不同提取方法比较结果
由表3可以看出：通过对红豆杉枝叶中黄酮类化合物果胶酶与超声波辅助耦合提取方法比较，采用果胶酶水溶液先水浴处理后再用70％乙醇溶液超声提取，提取总黄酮的得率最高，为5.16％。此种耦合提取方法比对比例5-2传统的溶剂提取法(水溶液浸泡处理+70％乙醇溶液水浴提取)得率高26.47％；比对比例5-4超声辅助提取(70％乙醇溶液超声处理+70％乙醇溶液超声提取)得率高6.17％。由于红豆杉枝叶中含有较多的果胶及黏树脂，实验时采用酶处理同时超声，溶液过滤时很困难，同时提取得率低了3.61％。所以，本发明实施例5果胶酶水溶液先浸泡处理后再用70％乙醇溶液超声提取方法为较佳的红豆杉枝叶中黄酮类化合物果胶酶与超声波辅助耦合提取方法。
用本发明对桉树、黑荆树、红豆杉3种人工林枝叶活性成分黄酮类化合物进行了果胶酶处理与超声辅助耦合提取，结果表明：桉树、黑荆树、红豆杉3种人工林枝叶活性成分黄酮类化合物的提取得率最高，比传统的有机溶剂提取得率高20％以上，比超声波辅助提取高6％以上。本发明的技术是一种低温、绿色高效提取方法。解决了有效成分的提取率受胞内外平衡浓度的限制、提取时间长、耗费的溶剂多，生产效率低、有效成分损失大以及生产成本高等缺点，在工业上具有工艺简单且成本低，可工业化，具有普适性等特点，在工业化生产中具有广泛的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。