本发明涉及一种没食子中抑制牙周疾病致病菌有效部位的生产方法及用途。
背景技术
没食子是没食子蜂(cynipsgallae-tinctoriaeoliv.)的幼虫寄生于没食子(quercusinfectoriaoliv.)幼枝上产生的虫瘿。含有没食子含鞣质50～70％，没食子酸2～4％及并没食子酸、树脂等。没食子药用历史悠久，始记于《唐本草》，后续医学著作《海药本草》、《开宝本草》等亦多有论述。《现代实用中药》亦有记述用于治慢性支气管炎。药理学研究表明没食子具有抗炎、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、杀虫、降糖和创伤修复等多种药理活性。西帕依固龈液系传统维吾尔族验方，由没食子单方制备而成，是国家基本药品目录中收录的维药，载于部颁标准维吾尔药分册。西帕依固龈液可健齿固龈，清血止痛。用于牙周疾病引起的牙齿酸软，咀嚼无力，松动移位，牙龈出血以及口舌生疮，咽喉肿痛，口臭烟臭。明确西帕依固龈液中的抗口腔致病菌有效部位就尤为重要。
技术实现要素：
本发明的第一目的是提供一种没食子中具有抑制牙周疾病致病菌有效部位。
本发明的第二目的是提供一种没食子中抑制牙周疾病致病菌有效部位的生产方法。
本发明的第三目的是提供一种没食子中抑制牙周疾病致病菌有效部位的用途。
本发明的第一目的实现如下：
本发明没食子中具有抑制牙周疾病致病菌有效部位为：没食子酸、没食子酸甲酯、双没食子酸、一-o-没食子酰基葡萄糖、二-o-没食子酰基葡萄糖、三-o-没食子酰基葡萄糖和四-o-没食子酰基葡萄糖中的一种及以上。
本发明的第二目的实现如下：
第一步：选用没食子为药材，粉碎，过10～80目筛；
第二步：将没食子药材粉末质量与水体积为1/2～1/5混合，水煎提取1～3次，每次1～3小时，合并滤液后浓缩收干准备后续分离；
第三步：将第二步所得样品利用c18色谱柱、聚酰胺色谱柱或大孔吸附树脂柱进行有效部位富集：5％以下的乙醇或甲醇除去杂质后，用10～40％的乙醇或甲醇洗脱后收集洗脱液，进行浓缩收干，得到的浓缩液或干燥的固体即为没食子抗炎提取物，提取物中含有没食子酸、没食子酸甲酯、双没食子酸、一-o-没食子酰基葡萄糖、二-o-没食子酰基葡萄糖、三-o-没食子酰基葡萄糖和四-o-没食子酰基葡萄糖中的一种及以上。
通过质谱引导的制备液相分离系统制备得到一-o-没食子酰基葡萄糖、没食子酸、二-o-没食子酰基葡萄糖、双没食子酸、没食子酸甲酯、三-o-没食子酰基葡萄糖、四-o-没食子酰基葡萄糖、五-o-没食子酰基葡萄糖和六-o-没食子酰基葡萄糖的流分，对各流分的口腔致病菌抑菌效果进行测定，其结果如表1所示。
表1没食子中各种多酚类成分对牙龈卟啉单胞菌和粘性放线菌的抑制作用
注：ic50，抑菌浓度，单位：mg/ml；mic，最小抑菌浓度，单位：mg/ml。
本发明的第三目的是将生产的没食子酸、没食子酸甲酯、双没食子酸、一-o-没食子酰基葡萄糖、二-o-没食子酰基葡萄糖、三-o-没食子酰基葡萄糖和四-o-没食子酰基葡萄糖中的一种及以上用于治疗抑制牙周疾病致病菌。
本发明利用色谱分离后通过体内体外研究确定了没食子的有效部位，并确定了有效部位的化学组成。本发明的没食子提取物的制备方法工艺简单、设计合理，环境污染小。该方法对乙醇用量少，成本较低，收率较高，适宜工业化生产。本发明开展了体内外活性评价是适合工业化生产有效部位的方法。
具体实施方式
实施例1
没食子中具有抑制牙周疾病致病菌有效成分为：没食子酸、没食子酸甲酯、双没食子酸、一-o-没食子酰基葡萄糖、二-o-没食子酰基葡萄糖、三-o-没食子酰基葡萄糖和四-o-没食子酰基葡萄糖。
其生产步骤如下：
第一步：选用没食子为药材，粉碎，过10目筛；
第二步：将没食子药材粉末质量与水体积为1/2混合，水煎提取1次，每次1小时，合并滤液后浓缩收干准备后续分离；
第三步：将第二步所得样品利用聚酰胺色谱进行有效部位富集：用水洗脱除去杂质，用30％的乙醇或甲醇洗脱后收集洗脱液，进行浓缩收干，得到的浓缩液或干燥的固体即为没食子抗炎提取物，提取物中含有没食子酸、没食子酸甲酯、双没食子酸、一-o-没食子酰基葡萄糖、二-o-没食子酰基葡萄糖、三-o-没食子酰基葡萄糖和四-o-没食子酰基葡萄糖。
将生产的没食子酸、没食子酸甲酯、双没食子酸、一-o-没食子酰基葡萄糖、二-o-没食子酰基葡萄糖、三-o-没食子酰基葡萄糖和四-o-没食子酰基葡萄糖用于治疗抑制牙周疾病致病菌。
通过质谱引导的制备液相分离系统制备一-o-没食子酰基葡萄糖、没食子酸、二-o-没食子酰基葡萄糖、双没食子酸、没食子酸甲酯、三-o-没食子酰基葡萄糖、四-o-没食子酰基葡萄糖、五-o-没食子酰基葡萄糖和六-o-没食子酰基葡萄糖的流分，对各流分的口腔致病菌抑菌效果进行测定，其结果如表2所示。
表2没食子中各种多酚类成分对牙龈卟啉单胞菌和粘性放线菌的抑制作用
注：ic50，抑菌浓度，单位：mg/ml；mic，最小抑菌浓度，单位：mg/ml。
实施例2
与实施例1的不同之处在于其生产步骤如下：
第一步：选用没食子为药材，粉碎，过50目筛；
第二步：将没食子药材粉末质量与水体积为1/3混合，水煎提取2次，每次2小时，合并滤液后浓缩收干准备后续分离；
第三步：将第二步所得样品利用c18色谱柱进行有效部位富集：用5％甲醇洗脱除去杂质，再用30％的甲醇洗脱，收集洗脱液，进行浓缩收干，得到的浓缩液或干燥的固体即为没食子抗炎提取物，提取物中含有二-o-没食子酰基葡萄糖和三-o-没食子酰基葡萄糖。
实施例3
与实施例1的不同之处在于其生产步骤如下：
第一步：选用没食子为药材，粉碎，过80目筛；
第二步：将没食子药材粉末质量与水体积为1/5混合，水煎提取3次，每次3小时，合并滤液后浓缩收干准备后续分离；
第三步：将第二步所得样品利用c18色谱柱进行有效部位富集：用5％甲醇洗脱除去杂质，再用40％的甲醇洗脱，收集洗脱液，进行浓缩收干，得到的浓缩液或干燥的固体即为没食子抗炎提取物，提取物中含有三-o-没食子酰基葡萄糖。
实施例4
与实施例1的不同之处在于其生产步骤如下：
第一步：选用没食子为药材，粉碎，过30目筛；
第二步：将没食子药材粉末质量与水体积为1/2混合，水煎提取1次，每次3小时，合并滤液后浓缩收干准备后续分离；
第三步：将第二步所得样品利用聚酰胺色谱进行有效部位富集：用水洗脱除去杂质，再用20％的乙醇洗脱后收集洗脱液，进行浓缩收干，得到的浓缩液或干燥的固体即为没食子抗炎提取物，提取物中含有没食子酸、没食子酸甲酯、双没食子酸、一-o-没食子酰基葡萄糖。
实施例5
与实施例1的不同之处在于其生产步骤如下：
第一步：选用没食子为药材，粉碎，过50目筛；
第二步：将没食子药材粉末质量与水体积为1/4混合，水煎提取2次，每次2小时，合并滤液后浓缩收干准备后续分离；
第三步：将第二步所得样品利用bs-45大孔吸附树脂柱进行有效部位富集：用水洗脱除去杂质，再用30％的乙醇或甲醇洗脱后收集洗脱液，进行浓缩收干，得到的浓缩液或干燥的固体即为没食子抗炎提取物，提取物中含有二-o-没食子酰基葡萄糖、三-o-没食子酰基葡萄糖和四-o-没食子酰基葡萄糖。
实施例6
与实施例1的不同之处在于其生产步骤如下：
第一步：选用没食子为药材，粉碎，过80目筛；
第二步：将没食子药材粉末质量与水体积为1/3混合，水煎提取3次，每次3小时，合并滤液后浓缩收干准备后续分离；
第三步：将第二步所得样品利用s-8大孔吸附树脂柱进行有效部位富集：用水洗脱除去杂质，用40％的乙醇或甲醇洗脱后收集洗脱液，进行浓缩收干，得到的浓缩液或干燥的固体即为没食子抗炎提取物，提取物中含有一-o-没食子酰基葡萄糖、二-o-没食子酰基葡萄糖、三-o-没食子酰基葡萄糖和四-o-没食子酰基葡萄糖。
实施例7
与实施例1的不同之处在于其生产步骤如下：
第一步：选用没食子为药材，粉碎，过20目筛；
第二步：将没食子药材粉末质量与水体积为1/2混合，水煎提取1次，每次3小时，合并滤液后浓缩收干准备后续分离；
第三步：将第二步所得样品利用nka-9大孔吸附树脂柱进行有效部位富集：用水洗脱除去杂质，用20％的乙醇或甲醇洗脱后收集洗脱液，进行浓缩收干，得到的浓缩液或干燥的固体即为没食子抗炎提取物，提取物中含有没食子酸、没食子酸甲酯、双没食子酸、一-o-没食子酰基葡萄糖、二-o-没食子酰基葡萄糖和三-o-没食子酰基葡萄糖。