细胞组装介导的癌症免疫治疗检查点抑制剂的递送的制作方法

本申请要求2019年4月6日提交的美国临时申请号62/653,843的权益，该临时申请全文以引用方式并入本文。

背景技术：

急性髓系白血病(aml)是包含骨髓中成纤维细胞的增加的克隆性恶性肿瘤，其传统治疗包括基于蒽环类和阿糖胞苷的化疗方案。但是，传统的化疗对aml的疗效远不能令人满意，因为由于白血病细胞的清除不完全，大多数达到完全缓解的患者最终都会复发。复发性白血病患者的预后欠佳。尽管复发性白血病可以通过造血干细胞移植得以潜在治愈，但这种移植的费用通常与感染或移植物抗宿主病引起的高死亡率有关。工程t细胞的新兴技术为治疗aml提供了潜在的新方法。可以将患者自身的t细胞从血液循环中去除，并进行基因修饰以在体外表达人工t细胞受体(称为嵌合抗原受体)，该受体被设计为特异性识别与肿瘤相关的抗原。嵌合抗原受体修饰的t细胞(car-t)可以重定向t细胞特异性，并在临床上实现令人印象深刻的抗血癌治疗效果。然而，t细胞的基因工程通常涉及复杂且昂贵的离体操作。另外，减轻诸如细胞因子风暴和b细胞发育不良等副作用在临床上仍然具有挑战性。因此，迫切需要开发能够有效消除白血病细胞并避免副作用的新治疗方法，以增强aml患者的治疗效果和预后。

技术实现要素：

本文公开了与治疗剂递送载体有关的方法和组合物，该治疗剂递送载体包含药物或药物载体(例如，修饰的血小板)和可用于向目标部位递送治疗剂(例如抗体、小分子、肽、多肽、聚合物、模拟肽、核酸或药物组合)的靶向部分。

因此，在一个方面中，本文公开了包含药物或药物载体(诸如例如，修饰的血小板)和靶向部分的治疗剂递送载体；其中药物或药物载体(诸如例如修饰的血小板)已被修饰以包含治疗剂货物和化学键；其中血小板化学缀合至靶向部分。

在一个方面中，本文公开了任何前述方面的治疗剂递送载体，其中药物或药物载体可以缀合在靶向部分的表面或靶向部分的内部。在一个方面中，药物或药物载体包括修饰的血小板、合成纳米颗粒、合成微粒和细胞来源的囊泡。例如，在一个方面中，血小板已被修饰以包含治疗剂货物和化学键；其中血小板化学缀合至靶向部分。

本文还公开了任何前述方面的治疗剂递送载体，其中靶向部分是肽、多肽、模拟肽、聚合物、小分子、核酸、抗体、糖或细胞。应当理解并且在本文中预期，可以设计或改造靶向部分以靶向骨髓、肝、脾、胰腺、前列腺、膀胱、心脏、肺、脑、皮肤、肾、卵巢、睾丸、淋巴结、小肠、大肠或胃。

在一个方面中，本文公开了任何前述方面的治疗剂递送载体，其中靶向部分靶向骨髓，并且该部分选自由以下项组成的组：造血干细胞、包含asp或glu重复序列的肽或骨髓靶向制剂。

本文还公开了任何前述方面的治疗剂递送载体，其中血小板通过铜(i)催化的[3+2]叠氮化物-炔烃环加成(cuaac)、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(spaac)、应变促进的炔烃-硝酮环加成(spanc)或二苯并环辛基(dbco)无铜环加成(例如，二苯并环辛基(dbco)-聚乙二醇(peg)4nhs酯)化学缀合至靶向部分。

在一个方面中，本文公开了任何前述方面的治疗剂递送载体，其中靶向部分用活化的叠氮化物分子(诸如例如，四酰基化的n-叠氮乙酰基半乳糖胺(ac4galnaz))处理。

本文还公开了任何前述方面的治疗剂递送载体，其中治疗剂货物包含抗体、小分子、肽、多肽、模拟肽、聚合物或核酸(例如，免疫检查点抑制剂，如pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂或ctla-4抑制剂，如纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、bms-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。

在一个方面中，本文公开了任何前述方面的治疗剂递送载体，其中免疫检查点抑制剂经由磺基琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(sulfo-smcc)接头连接至修饰的血小板的表面。

本文还公开了治疗受试者癌症的方法，其包含向受试者施用任何前述方面的治疗剂递送载体。

在一个方面中，本文公开了治疗受试者癌症的方法，该方法包含向受试者施用包含修饰的血小板和靶向部分的治疗剂递送载体；其中血小板已被修饰以包含治疗剂货物和化学键；其中化学键包含二苯并环辛基(dbco)-聚乙二醇(peg)4nhs酯；并且其中血小板化学缀合至靶向部分。

本文还公开了治疗任何前述方面的癌症的方法，其中靶向部分包含用四酰基化的n-叠氮乙酰基半乳糖胺(ac4galnaz)标记的造血干细胞。

在一个方面中，本文公开了治疗任何前述方面的癌症的方法，其中治疗剂货物包含抗体、小分子、肽、多肽、模拟肽、聚合物或核酸(例如，免疫检查点抑制剂，如pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂或ctla-4抑制剂，如纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、bms-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。

本文还公开了治疗任何前述方面的癌症的方法，其中癌症选自由以下项组成的组：：淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、霍奇金病、髓系白血病(包括急性髓系白血病)、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌、咽鳞状细胞癌、喉鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、结肠癌、宫颈癌、子宫颈癌、乳腺癌、上皮癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食管癌、头颈癌、大肠癌、造血癌、睾丸癌、结肠癌和直肠癌。

本文还公开了任何前述方面的药物组合物，其进一步包含施用化学治疗剂，诸如例如，小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-mt)、去甲哈尔满、迷迭香酸、艾卡哚司他、navooximod、阿霉素、泰莫西芬、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)，sirna、肽、模拟肽、聚合物或抗体(诸如例如以及抗pdl-1抗体，包括但不限于阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。

在一个方面中，本文公开了任何前述方面的治疗受试者的癌症的方法，其中将治疗剂递送载体或药物组合物至少每12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时一次，每3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天一次，每2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月一次施用给患者。

本文还公开了任何前述方面的治疗受试者的癌症的方法，其中治疗剂递送载体或药物组合物每周施用至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次。

在一个方面中，本文公开了任何前述方面的治疗受试者的癌症的方法，其中施用的治疗剂递送载体或药物组合物的施用剂量为约10mg/kg至约100mg/kg。

本文还公开了任何前述方面的治疗受试者的癌症的方法，其进一步包括施用化学治疗剂。

附图说明

并入本说明书并构成本说明书一部分的附图示出了几个实施例，并且与说明书一起示出了所公开的组合物和方法。

图1a、1b、1c、1d和1e显示了s-p-apd1递送系统的特征。图1a显示了hsc-血小板组装辅助的有效apd1递送的示意图。静脉内递送后，s-p-apd1可以回到骨髓，血小板可以被局部激活并释放apd1以结合t细胞，从而增强免疫反应。pmp：血小板来源的微粒。图1b显示了s-p-apd1缀合物的共聚焦(上部)和sem表征(下部)。用罗丹明标记血小板以进行共聚焦观察。白色箭头表明存在血小板。图1c显示了被0.5u/ml凝血酶激活后，来自s-p-apd1的pmp的tem表征。图1d显示了血小板与hsc的不同比例下s-p-apd1的荧光成像。图1e显示了hsc上缀合的血小板的定量分析。定量基于在共聚焦显微镜下对s-p-apd1计数(数量＝200)。重复三次实验(n＝3)。

图2显示了通过点击反应在hsc上的血小板缀合示意图。

图3a、3b和3c显示了血小板上apd1的缀合量的定量。图3a显示了血小板表面上的缀合的apd1的定量。误差条指示s.d.(n＝3)。在以下研究中使用0.2pgapd1/血小板。图3b显示了孵育24小时后天然血小板和缀合了apd1的血小板的完整性。误差条指示s.d.(n＝3)。图3c显示了从天然血小板和活化的血小板在体外累积的apd1释放。误差条指示s.d.(n＝3)。

图4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i和4j显示了s-p-apd1的体内治疗功效。图4a显示了在apd1剂量为1mg/kg时，游离apd1和s-p-apd1的体内药代动力学(n＝3)。图4b显示了用cy5.5标记的游离apd1(1)、p-apd1(2)、s-apd1(3)、s+p-apd1(4)和s-p-apd1(5)治疗的小鼠的骨组织的荧光图像。图4c显示了骨组织的荧光强度的感兴趣区域分析。误差条指示s.d.(n＝3)。***p<0.001(双尾学生氏t检验)。图4d显示了构建c1498白血病模型和治疗计划的示意图。图4e显示了用pbs、游离apd1、s-apd1、p-apd1、s+p-apd1和s-p-apd1治疗的小鼠的生物发光图像(hsc/血小板：在100μlpbs中为5×10⁷细胞，apd1：0.5mg/kg)。图4f显示了来自整个小鼠身体的生物发光强度的感兴趣区域分析。图4g显示了外周血中c1498细胞数量的流式细胞仪分析。图4h显示了治疗的和对照小鼠的存活曲线(n＝8)。通过时序检验计算统计显著性(***p<0.001)。图4i显示了接受不同治疗的小鼠的脾脏形态(1：盐水；2：游离apd1；3：s-apd1；4：p-apd1；5：s+p-apd1；6：s-p-apd1)。图4j显示了脾脏的重量。误差条指示s.d.(n＝8)。***p<0.001(双尾学生氏t检验)。

图5a、5b、5c、5d和5e显示了细胞因子和趋化因子以及t细胞分析。图5a显示了外周血中cd3+t细胞的流式细胞仪分析。图5b显示了外周血中cd8+t细胞(门控于cd3+t细胞)的流式细胞仪分析。图5c显示了cd3+t细胞数量的定量分析。误差条指示s.d.(n＝8)。***p<0.001(双尾学生氏t检验)。图5d显示了cd8+t细胞数量的定量分析。误差条指示s.d.(n＝8)。***p<0.001(双尾学生氏t检验)。图5e显示了基于luminex的细胞因子和趋化因子的定量。

图6a和6b显示了粒酶b+(gzmb+)t细胞的分析。图6a显示了来自不同治疗组(n＝5)的骨髓的cd8+gzmb+t细胞的流式细胞仪分析。图6b显示了骨髓中cd8+gzmb+t细胞的定量分析。误差条指示s.d.(n＝5)。***p<0.001(单向方差分析，然后进行tukeyhsd事后比较检验)。

图7a、7b、7c、7d、7e和7f显示了s-p-apd1诱导持久的免疫应答。图7a显示了cd44⁺cd62l⁺t细胞(门控于cd8+t细胞)的流式细胞仪分析。图7b显示了在3周时用1×10⁶个c1498细胞再次激发的天然小鼠和治疗的小鼠的生物发光图像。图7c显示了c1498细胞再次激发后，治疗的小鼠和天然小鼠的存活曲线(n＝8)。通过时序检验计算统计显著性(***p<0.001)。图7d显示了用0.5mg/kg的apd1剂量的pbs、游离apd1和s-p-apd1治疗的rag^-/-小鼠的存活曲线(n＝8)。图7e显示了用0.5mg/kg的apd1剂量的pbs、游离apd1和s-p-apd1治疗的cd8+t细胞耗尽的小鼠的存活曲线(n＝8)。图7f显示了用0.5mg/kg的apd1剂量的pbs、游离apd1和s-p-apd1治疗的pd^-/-小鼠的存活曲线(n＝8)。

具体实施方式

在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另有规定，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或者除非另有规定，否则它们不限于特定的试剂，因而，当然也可有所变化。另外应当了解，本文使用的术语只是出于描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。

a.定义

如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”“一种”“该”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定不是这样。因此，例如，对“药物载体”的提及包括两个或更多这样的载体的混合物等。

范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，在利用前词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。还应当理解，每个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解，当公开了“小于或等于”值、“大于或等于”值以及时，也公开了如本领域技术人员适当理解的值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应理解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及介于10和15之间。还应理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

对受试者的“给药”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。可通过任何合适的途径进行给药/施用，包括口服、局部、静脉、皮下、经皮、穿皮、肌肉内、关节内(intra-joint)、肠外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹腔内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入的存贮器、肠外(例如，皮下、静脉、肌肉内、关节内(intra-articular)、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹腔内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用，“并行给药”、“联合给药”、“同时给药(simultaneousadministration或administeredsimultaneously)”意指化合物在同一时间点给药或基本上紧接着给药。在后一种情况下，该两种化合物的给药时间足够接近，以至于观察到的结果与在同一时间点给予化合物时获得的结果不可区分。“全身给药”是指通过将药剂引入或递送到受试者身体的广泛区域(例如，超过身体的50％)的途径，例如通过进入循环或淋巴系统，将药剂引入或递送给受试者。相比之下，“局部给药”是指通过一条途径向受试者引入或递送药剂，该途径将该药剂引入或递送到紧邻给药点的一个或多个区域，并且在治疗上不系统地大量引入该药剂。例如，局部给药的药剂在给药点的局部附近很容易被检测到，但在受试者身体的远侧部分不可检测到或检测到的量可以忽略不计。给药包括自我给药和他人给药。

“生物相容的”通常是指材料及其任何代谢物或降解产物通常对受试者无毒并且不对受试者造成显著的副作用。

“包含”意指组合物、方法等包括所提到的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应指包括所提到的元素，但不包括对组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由...组成”应指排除多于其他成分的痕量元素和用于给予本发明的组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每个所定义的实施例都在本发明的范围内。

“对照”是在实验中用于比较目的的替代受试者或样本。对照可为“阳性对照”或“阴性对照”。

“控释”或“缓释”是指为了在体内达到所需的药代动力学曲线，以可控的方式从给定剂型释放药剂。“控释”药剂递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以建立所需的药剂释放动力学的能力。

药剂的“有效量”是指药剂提供所需的效果的足够数量。“有效的”药剂的量将在不同受试者之间变化，取决于受试者的年龄和一般情况、特定的一种或多种药剂等许多因素。因此，并不总是能够指定量化的“有效量”。然而，任何受试者病例中的适当的“有效量”可由本领域的普通技术人员使用常规实验方法确定。此外，如本文所用，并且除非另外特别说明，否则药剂的“有效量”也可以指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。实现治疗效应所需的药剂的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可每天给予若干分开的剂量，或者可按照治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。

“药学上可接受的”组分可指并非生物学上或以其他方式不可取的组分，即该组分可掺入本发明的药物制剂中并给予如本文所述的受试者，而不引起显著的不良生物效应或以有害的方式与包含该组分的制剂的任何其他组分相互作用。当用于提及对人体的给药时，该术语通常意味着该组分已达到毒理学和制造试验的要求标准，或者它包括在美国食品药品监督管理局所制定的非活性成分指南中。

“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药用或治疗用的药物可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或本领域中熟知的用于药物制剂的其他材料，并且如本文中进一步描述。

“药理活性”(或仅“活性”)，正如在“药理活性”衍生物或类似物中所用的那样，可指具有与母体化合物相同类型的药理活性并且程度大致相等的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。

“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体表示。聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、橡胶、纤维素。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。术语“聚合物”包括所有形式的聚合物，包括但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加成聚合物等。

“治疗剂”是指任何具有有益生物效应的组合物。有益的生物效应包括治疗效应和预防效应，其中治疗效应例如治疗障碍或其他不希望的生理病症，预防效应例如预防疾病或其他不良生理症状(例如，非免疫原性癌症)。该术语还涵盖本文中具体提及的有益剂在药学上可接受的药理活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或者当明确标识特定的药剂时，应当理解，该术语包括药剂本身以及在药学上可接受的药理活性盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。

组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效地达到所需的治疗结果的量。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制i型糖尿病。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制肥胖。给定治疗剂的治疗有效量通常将根据诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。术语还可指有效促进所需的治疗效应(如疼痛缓解)的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间推移的量)。精确所需的治疗效应将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待给予的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中的药剂浓度等)，以及本领域中的普通技术人员所理解的各种其他因素而变化。在一些情况下，在向受试者连续几天、几周或几年给予多种剂量的该组合物后，可获得所需的生物或医学反应。

在本说明书及随后的权利要求书中，将引用多个术语，将其定义为具有以下含义：

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。

在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的全部公开内容据此以引用方式并入本申请，以便更全面地描述本申请所涉及的技术现状。所公开的参考文献也单独并且具体地以引用方式并入本文，参考文献中包含的材料在参考文献所依据的句子中予以讨论。

b.组合物

本发明公开了用于制备本发明所公开的组合物，以及在本文所公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当本发明公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能未明确公开这些化合物的各种不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但是其中每个在本文中均得到特别考虑和描述。因此，如果公开了一类分子a、b和c以及一类分子d、e和f以及组合分子的实例，则公开了a-d，那么即使未单独引用其中每一项，也认为公开了个体和集体考虑的含义组合a-e、a-f、b-d、b-e、b-f、c-d、c-e和c-f。同样，还公开了这些组合的任何子集或组合。因此，例如，将认为公开了a-e、b-f和c-e的子组。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用本发明所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每个均可用本发明所公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行。

可以理解和预期，诸如检查点抑制剂阻断剂之类的免疫治疗可以有效地治疗癌症或肿瘤手术切除之后的复发。然而，在这些阻断剂中使用的抗体会对许多患者造成限制，并对更多患者无效。程序性死亡1(pd-1)是在多种免疫细胞(诸如t细胞、b细胞和自然杀伤细胞)上表达的一种免疫抑制共受体。当被其配体pd-l1/pd-l2结合时，pd-1通过抑制活化的t细胞反应发挥功能。肿瘤细胞响应炎症上调pd-l1，从而抑制抗肿瘤免疫反应。pd-1(apd1)单克隆抗体阻断剂可抑制肿瘤介导的免疫抑制，并已被证明可改善多种癌症的预后。临床前研究表明，阻断pd-1途径可改善急性髓系白血病(aml)的预后。因此，抗pd-1代表了aml治疗武器库中的一种有前途的策略。本文描述了一种hsc-血小板组装递送系统，该系统可通过原位血小板活化促进apd1转运至骨髓以及apd1的随后释放(图1a)。hsc-血小板组装体的构建是通过点击反应将血小板向hsc质膜的缀合介导的(图2)。免疫检查点抑制剂apd1共价修饰在血小板表面。此外，可以通过在血小板活化后生成血小板来源的微粒(pmp)来促进apd1的释放，这进一步增强了apd1与t细胞的结合。在静脉内注射后，本文证明了hsc-血小板-apd1组装体(称为s-p-apd1)可以有效地积聚在骨髓中，残留白血病细胞经过传统治疗后就位于骨髓中。使用患有c1498白血病的小鼠作为aml模型，发现s-p-apd1可通过激活t细胞并产生多种细胞因子和趋化因子来诱导有效的免疫反应，从而完全消除白血病细胞。此外，这种免疫应答是持久的，可以显著诱导对再次激发的白血病细胞的抗性。因此，在一个方面中，本文公开了包含修饰的血小板和靶向部分的治疗剂递送载体；其中血小板已被修饰以包含治疗剂货物和化学键；其中血小板化学缀合至靶向部分。

应当理解并且在本文中考虑了治疗剂输送载体被设计成将治疗剂货物靶向特定的组织或器官部位。例如，可以设计或改造靶向部分以靶向骨髓、肝、脾、胰腺、前列腺、膀胱、心脏、肺、脑、皮肤、肾、卵巢、睾丸、淋巴结、小肠、大肠或胃。应当理解并在本文中考虑到有许多方法可以将本文所公开的治疗剂递送载体靶向靶组织或器官。因此，本文中特别考虑的是治疗剂递送载体，其可以包含可与修饰的血小板连接以靶向特定组织或器官的任何分子，包括但不限于肽、多肽、聚合物、核酸、抗体、糖或细胞。在一个方面中，例如，靶向部分靶向骨髓，并且该部分选自由以下项组成的组：造血干细胞、包含asp或glu重复序列的肽或骨髓靶向制剂。

应当理解并且在本文中预期的是，可以将所公开的治疗剂递送载体的药物或药物载体(诸如例如，修饰和/或工程化的血小板合成微粒、合成纳米颗粒和/或细胞来源的颗粒)通过化学键或缀合与靶向部分连接起来。在一个方面中，本文公开了任何前述方面的治疗剂递送载体，其中血小板通过铜(i)催化的[3+2]叠氮化物-炔烃环加成(cuaac)、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(spaac)、应变促进的炔烃-硝酮环加成(spanc)或二苯并环辛基(dbco)无铜环加成(例如，二苯并环辛基(dbco)-聚乙二醇(peg)4nhs酯)化学缀合至靶向部分。为了促进缀合，也可以修饰靶向部分以完成与血小板的连接。因此，本文公开了任何前述方面的治疗剂递送载体，其中靶向部分用活化的叠氮化物分子(诸如例如，四酰基化的n-叠氮乙酰基半乳糖胺(ac4galnaz))处理。

在一个方面中，应当理解，本文所公开的治疗剂递送载体旨在施用给受试者以治疗、预防、抑制或减少癌症或转移，或治疗、预防、抑制或减少手术切除(即，切除)之后的复发或转移。因此，本文公开了任何前述方面的治疗剂递送载体，其中治疗剂货物包括抗体、小分子、肽、多肽、模拟肽、聚合物或核酸。例如，治疗剂货物可包含免疫检查点抑制剂，诸如例如pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂或ctla-4抑制剂(诸如例如，纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、bms-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗)。

本文所考虑的是用于将治疗剂货物连接至所公开的治疗剂递送载体的血小板的接头。应当理解并且在本文中预期的是，接头可以包含足以将治疗货物连接至血小板的任何接头，包括4-巯基戊酸、6-马来酰亚胺基己酸、磺基琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(sulfo-smcc)、聚甘氨酸(例如3、4或5甘氨酸)、聚丝氨酸(例如3、4或5丝氨酸)或甘氨酸和丝氨酸的组合，包括重复组合。例如，接头可以是甘氨酸和丝氨酸接头，例如g4s、gsg4、g2sg3sg2、g2sg、g3s接头或本领域已知的任何其他接头，其中碱基接头序列可以任选地重复2、3、4或更多次。因此，在一个方面中，本文公开了任何前述方面的治疗剂递送载体，其中免疫检查点抑制剂经由磺基琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(sulfo-smcc)接头连接至修饰的血小板的表面。

1.药物载体/药品的递送

在一个方面中，应当理解，本文所公开的治疗剂递送载体旨在施用给受试者以治疗、预防、抑制或减少癌症或转移，或治疗、预防、抑制或减少手术切除(即，切除)之后的复发或转移。因此，本文公开了包含本文公开的治疗剂递送载体的药物组合物。例如，本文公开了包含治疗剂递送载体的药物组合物，该治疗剂递送载体包含修饰的血小板和靶向部分；其中血小板已被修饰以包含治疗剂货物和化学键；并且其中血小板化学缀合至靶向部分。

一种或多种治疗剂可与治疗剂递送载体一起提供于药物组合物中。因此，在一个方面中，本文公开了包含治疗剂递送载体的药物组合物，该治疗剂递送载体包含修饰的血小板和靶向部分；其中血小板已被修饰以包含治疗剂货物和化学键；并且其中化学键包含二苯并环辛基(dbco)-聚乙二醇(peg)4nhs酯；其中血小板化学缀合至靶向部分；其中一种或多种治疗性货物制剂包含小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-mt)、去甲哈尔满、迷迭香酸、艾卡哚司他、navooximod、阿霉素、泰莫西芬、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)，sirna、肽、聚合物、模拟肽和/或抗体(诸如例如以及抗pdl-1抗体，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、bms-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。

由于所公开的包含所公开的治疗剂递送载体的药物组合物可以用于治疗癌症，因此在其中进一步考虑到所公开的药物组合物可以进一步包含本领域已知的任何已知的任何化学治疗剂，包括但不限于abemaciclib、醋酸阿比特龙、abitrexate(甲氨蝶呤)、abraxane(紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒配制剂)、abvd、abve、abve-pc、ac、ac-t、adcetris(本妥昔单抗)、ade、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、阿霉素(盐酸多柔比星)、马来酸阿法替尼、飞尼妥(依维莫司)、akynzeo(奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼)、艾达乐(咪喹莫特)、阿地白介素、alecensa(阿雷替尼)、阿雷替尼、阿伦单抗、爱宁达(培美曲塞二钠)、aliqopa(库潘尼西盐酸盐)、爱克兰针剂(盐酸美法仑)、爱克兰片剂(美法仑)、阿乐喜(盐酸帕洛诺司琼)、布吉他滨(布加替尼)、ambochlorin(苯丁酸氮芥)、ambochlorin(苯丁酸氮芥)、阿米福汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、阿可达(帕米膦酸二钠)、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、arzerra(奥法木单抗)、天冬酰胺酶欧文氏菌绿原酸、阿特珠单抗、阿瓦斯丁(贝伐单抗)、阿维鲁单抗、阿西替尼、阿扎胞苷、阿维单抗(阿维鲁单抗)、beacopp、becenum(卡莫司汀)、beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、bep、besponsa(依托珠单抗)、贝伐珠单抗、蓓萨罗丁、百克沙(托西莫单抗和碘i131托西莫单抗)、比卡鲁胺、bicnu(卡莫司汀)、博来霉素、博纳吐单抗、blincyto(博纳吐单抗)、硼替佐米、bosulif(伯舒替尼)、伯舒替尼、本妥昔单抗、布吉替尼、bumel、白消安、busulfex(白消安)、卡巴他赛、卡博替尼(苹果酸卡博替尼)、苹果酸卡博替尼、caf、campath(阿伦单抗)、camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、capox、carac(氟尿嘧啶-局部)、卡铂、卡铂-紫杉醇、卡非佐米、carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、cem、色瑞替尼、cerubidine(盐酸柔红霉素)、希瑞适(重组hpv二价疫苗)、西妥昔单抗、cev、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-强的松、chop、顺铂、克拉屈滨、克拉芬(环磷酰胺)、氯法拉滨、clofarex(氯法拉滨)、科罗拉(氯法拉滨)、cmf、考比替尼、cometriq(苹果酸卡博替尼)、库潘尼西盐酸盐、copdac、copp、copp-abv、更生霉素(放线菌素d)、cotellic(考比替尼)、克唑替尼、cvp、环磷酰胺、cyfos(异环磷酰胺)、cyramza(雷莫芦单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、赛德萨-u(阿糖胞苷)、cytoxan(环磷酰胺)、达拉菲尼、达卡巴嗪、达克金(地西他滨)、放线菌素d、达雷木单抗、达拉他滨(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素、地诺单抗、depocyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右雷佐生、地努图希单抗、多西他赛、doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、dox-sl(盐酸多柔比星脂质体)、dtic-dome(达卡巴嗪)、德瓦鲁单抗、efudex(氟尿嘧啶-局部)、埃立特(拉布立酶)、ellence(盐酸表柔比星)、埃罗妥珠单抗、乐沙定(奥沙利铂)、艾曲波帕、emend(阿瑞匹坦)、empliciti(埃罗妥珠单抗)、恩西地平甲磺酸盐、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、epoch、爱必妥(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林、erivedge(维莫德吉)、盐酸埃罗替尼、erwinaze(天冬酰胺酶欧文氏菌绿原酸)、ethyol(氨磷汀)、凡毕复(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、evacet(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、evista(盐酸雷洛昔芬)、evomela(盐酸美法仑)、依西美坦(exemestane)、5-fu(氟尿嘧啶注射液)、5-fu(氟尿嘧啶-局部用)、法乐通(托瑞米芬)、farydak(帕比司他)、芙仕得(氟维司群)、fec、氟隆(来曲唑)、非格司亭、福达华(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、fluoroplex(氟尿嘧啶-局部)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-局部、氟他胺、folex(甲氨蝶呤)、folexpfs(甲氨蝶呤)、伊立替康、伊立替康-贝伐单抗、伊立替康-西妥昔单抗(folfiri-cetuximab)、folfinox、folfox、folotyn(普拉曲沙)、fu-lv、氟维司群、加德西(重组hpv四价疫苗)、加德西9(重组hpv九价疫苗)、gazyva(阿托珠单抗)、吉非替尼(gefitinib)、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥珠单抗奥佐米星、健择(盐酸吉西他滨)、gilotrif(马来酸阿法替尼)、格列卫(甲磺酸伊马替尼)、gliadel(卡莫司汀植入物)、gliadelwafer(卡莫司汀植入物)、谷卡匹酶、醋酸戈舍瑞林、halaven(甲磺酸艾日布林)、hemangeol(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、hpv二价疫苗、重组hpv九价疫苗、重组hpv四价疫苗、重组美新(盐酸拓扑替康)、hydrea(羟基脲)、羟基脲、hyper-cvad、ibrance(帕博西尼)、替伊莫单抗、依鲁替尼、ice、iclusig(盐酸帕纳替尼)、idamycin(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉里斯(idelalisib)、idhifa(恩西地平甲磺酸盐)、ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、匹服平(异环磷酰胺)、il-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、imbruvica(依鲁替尼)、imfinzi(德瓦鲁单抗)、咪喹莫特(imiquimod)、imlygic(talimogenelaherparepvec)、inlyta(阿西替尼)、依托珠单抗、干扰素α-2b、重组白介素-2(阿地白介素)、introna(重组干扰素α-2b)、碘i131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹单抗、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、柠檬酸艾莎佐米、ixempra(伊沙匹隆)、jakafi(磷酸鲁索替尼)、jeb、jevtana(卡巴他赛)、kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、kepivance(帕利夫明)、keytruda(派姆单抗)、kisqali(瑞博西尼)、kymriah(tisagenlecleucel)、kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、lartruvo(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、瘤可宁(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、leustatin(克拉屈滨)、levulan(氨基乙酰丙酸)、linfolizin(苯丁酸氮芥)、lipodox(盐酸多柔比星脂质体)、洛莫司汀、lonsurf(三氟尿苷和盐酸替吡嘧啶)、lupron(醋酸亮丙瑞林)、luprondepot(醋酸亮丙瑞林)、luprondepot-ped(醋酸亮丙瑞林)、lynparza(奥拉帕尼)、marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、甲基苄肼(盐酸丙卡巴肼)、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、mekinist(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、mesnex(美司钠)、methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤lpf(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、mexate(甲氨蝶呤)、mexate-aq(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素c、盐酸米托蒽醌、mitozytrex(丝裂霉素c)、mopp、mozobil(普乐沙福)、mustargen(盐酸氮芥)、mutamycin(丝裂霉素c)、马利兰(白消安))、mylosar(阿扎胞苷)、mylotarg(吉妥珠单抗奥佐米星)、紫杉醇纳米颗粒(紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒配制剂)、诺维本(酒石酸长春瑞滨)、耐昔妥珠单抗、奈拉滨、neosar(环磷酰胺)、马来酸来那替尼、nerlynx(马来酸来那替尼)、奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼、neulasta(培非格司亭)、neupogen(非格司亭)、nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、nilandron(尼鲁他胺)、尼罗替尼、尼鲁米特、ninlaro(枸橼酸艾莎佐米)、尼拉帕尼对甲苯磺酸盐单水合物、纳武单抗、nolvadex(枸橼酸他莫昔芬)、nplate(罗米司亭)、奥滨尤妥珠单抗、odomzo(索尼吉布)、oepa、奥法木单抗、off、奥拉帕尼、olaratumab(奥拉单抗)、高三尖杉酯碱、oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、onivyde(盐酸伊立替康脂质体)、ontak(地尼白介素)、opdivo(纳武单抗)、oppa、奥斯替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒配制剂、pad、帕博西尼、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、帕比司他、paraplat(卡铂)、伯尔定(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、pcv、peb、培门冬酶、聚乙二醇非格司亭、聚乙二醇干扰素α-2b、peg-intron(聚乙二醇干扰素α-2b)、派姆单抗、培美曲塞二钠、perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、普拉汀诺(顺铂)、普拉汀诺-aq(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、portrazza(耐昔妥珠单抗)、普拉曲沙、强的松、盐酸丙卡巴肼、proleukin(阿地白介素)、prolia(地诺单抗)、promacta(艾曲波帕)、盐酸普萘洛尔、普罗文奇(sipuleucel-t)、purinethol(巯嘌呤)、purixan(巯嘌呤)、镭223二氯、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、r-chop、r-cvp、重组人乳头瘤病毒(hpv)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(hpv)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(hpv)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼、relistor(溴化甲基纳曲酮)、r-epoch、雷利米得(来那度胺)、rheumatrex(甲氨蝶呤)、瑞博西尼、r-ice、rituxan(利妥昔单抗)、利妥昔单抗(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉吡坦、罗米地辛、罗米司亭、红比霉素(盐酸柔红霉素)、rubraca(瑞卡帕布樟脑磺酸盐)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐、磷酸鲁索替尼、雷德帕斯(米哚妥林)、司兰索胸膜内气雾剂(滑石粉)、西妥昔单抗、sipuleucel-t、somatulinedepot(醋酸兰瑞肽)、索尼吉布、甲苯磺酸索拉非尼、施达赛(达沙替尼)、stanfordv、无菌滑石粉末(滑石粉)、steritalc(滑石粉)、stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、索坦(苹果酸舒尼替尼)、sylatron(聚乙二醇干扰素α-2b)、sylvant(西妥昔单抗)、synribo(高三尖杉酯碱)、tabloid(硫鸟嘌呤)、tac、tafinlar(达拉菲尼)、tagrisso(奥斯替尼)、滑石粉、talimogenelaherparepvec、枸橼酸他莫昔芬、tarabinepfs(阿糖胞苷)、特罗凯(盐酸厄洛替尼)、targretin(蓓萨罗丁)、泰息安(尼罗替尼)、紫杉醇(paclitaxel)、泰索帝(多西他赛)、tecentriq(阿特珠单抗)、temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、替西罗莫司、沙利度胺、thalomid(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、噻替派、tisagenlecleucel、tolak(氟尿嘧啶-局部)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、驮瑞赛尔(替西罗莫司)、托西莫单抗和碘i131托西莫单抗、totect(盐酸右雷佐生)、tpf、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、treanda(盐酸苯达莫司汀)、三氟尿苷和盐酸替吡嘧啶、trisenox(三氧化二砷)、泰立莎(二甲苯磺酸拉帕替尼)、unituxin(地努图希单抗)、尿苷三乙酸酯、vac、凡德他尼、vamp、varubi(盐酸罗拉吡坦)、vectibix(帕尼单抗)、veip、velban(硫酸长春花碱)、万珂(硼替佐米)、velsar(硫酸长春花碱)、维莫非尼、venclexta(维奈妥拉)、维奈妥拉、verzenio(玻玛西林)、viadur(醋酸亮丙瑞林)、维达扎(阿扎胞苷)、硫酸长春花碱、vincasarpfs(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、vip、维莫德吉、vistogard(尿苷三乙酸酯)、voraxaze(谷卡匹酶)、伏立诺他、votrient(盐酸帕唑帕尼)、vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、wellcovorin(亚叶酸钙)、xalkori(克唑替尼)、希罗达(卡培他滨)、xeliri、xelox、xgeva(地诺单抗)、xofigo(镭223二氯)、xtandi(恩杂鲁胺)、yervoy(伊匹单抗)、yondelis(曲贝替定)、zaltrap(ziv-阿柏西普)、zarxio(非格司亭)、zejula(尼拉帕尼对甲苯磺酸盐单水合物)、zelboraf(维莫非尼)、zevalin(替伊莫单抗)、zinecard(盐酸右雷佐生)、ziv-阿柏西普、枢复宁(盐酸昂丹司琼)、诺雷德(醋酸戈舍瑞林)、唑来膦酸、zolinza(伏立诺他)、择泰(唑来膦酸)、zydelig(艾代拉里斯)、zykadia(色瑞替尼)、和/或zytiga(醋酸阿比特龙)。

如上所述，这些组合物也可以药学上可接受的载体施用到体内。“药学上可接受”意指非生物学上或其他方面不良的材料，即，该材料可与核酸或载体一起施用给受试者，不会造成任何不良生物效应或以有害方式与含其的药物组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知，该载体将自然地被选择，以最小化该活性成分的任何降解，并最小化该受试者中的任何不利副作用。

可经口服、肠外(例如静脉)、肌肉注射、腹腔注射、经皮、体外、局部等方式给药，包括局部鼻内给药或通过吸入剂给药。如本文所用，“局部鼻内给药”意指通过一个或两个鼻孔将该组合物递送至鼻腔和鼻腔通道，且可包括通过喷雾机制或液滴机制递送，或通过核酸或载体的喷雾化递送。通过吸入剂的组合物的给药是通过鼻腔或口腔、通过喷雾或液滴机制递送。通过插管，递送也可以直接到达呼吸系统的任何区域(例如肺)。所需组合物的确切数量因受试者而异，具体取决于受试者的物种、年龄、体重和一般情况、所治疗过敏性障碍的严重程度、所使用的特定核酸或载体、其给药方式等。因此，不可能为每种组合物指定确切数量。然而，适当的量可以由本领域的普通技术人员通过仅使用本文给出教导的常规实验来确定。

该组合物的肠外给药(如果使用)通常以注射为特征。注射剂可以制备成常规形式，可以是液体溶液或悬浮液，也可以是适于在注射前在液体中溶解悬浮液的固体形式，或者是乳剂。最近修订的肠外给药方法包括使用缓释或缓释系统，以保持恒定剂量。参见，例如，美国专利号3,610,795，其通过引用并入本文。

材料可以是溶液、悬浮液(例如，并入微粒、脂质体或细胞中)。它们可能通过抗体、受体或受体配体靶向于特定的细胞类型。以下参考文献是利用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(senter等人，bioconjugatechem.，2:447-451，(1991)；bagshawe、k.d.，br.j.cancer，60:275-281，(1989)；bagshawe等人，br.j.cancer，58:700-703，(1988)；senter等人，bioconjugatechem.，4:3-9，(1993)；battelli等人，cancerimmunol.immunother.，35:421-425，(1992)；pietersz和mckenzie，immunolog.reviews，129:57-80，(1992)；以及roffler等人，biochem.pharmacol，42:2062-2065，(1991))。“隐形”和其他抗体缀合的脂质体(包括脂质介导的针对结肠癌的药物)、通过细胞特异性配体的受体介导的dna靶向、淋巴细胞介导的肿瘤靶向和体内小鼠胶质瘤细胞的高特异性治疗性逆转录病毒靶向等载体。以下参考文献是利用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(hughes等人，cancerresearch，49:6214-6220，(1989)；以及litzinger和huang，biochimicaetbiophysicaacta，1104:179-187，(1992))。一般来说，受体参与内吞作用的途径，无论是组成性的还是配体诱导的。这些受体聚集在网格蛋白所包被的小窝中，通过网格蛋白所包被的囊泡进入细胞，通过对受体进行分类的酸化的核内体，然后循环到细胞表面、在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，如营养吸收、活化蛋白去除、大分子清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的解离和降解、以及受体水平的调节等。根据细胞类型、受体浓度、配体类型、配体价态和配体浓度，许多受体遵循不止一个细胞内途径。综述了受体介导的内吞作用的分子和细胞机制(brown和greene，dnaandcellbiology10:6，399-409(1991))。

a)药学上可接受的载体

所述组合物包括抗体，可在治疗上与药学上可接受的载体结合使用。

合适的载体及其制剂在以下文献中有所描述：remington:thescienceandpracticeofpharmacy(第19版)，a.r.gennaro,mackpublishingcompany,easton,pa1995。通常，在该制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使该制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生理盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。该溶液的ph值优选为约5至约8，且更优选为约7至约7.5。进一步的载体包括缓释制剂，如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透膜基质，其基质为成型制品的形式，例如，膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，某些载体可能更可取，例如取决于给药途径和给药组合物的浓度。

本领域技术人员已知药物载体。这些通常是给人类给予药物的标准载体，包括无菌水、生理盐水和生理ph下的缓冲液等溶液。这些组合物可以肌肉注射或皮下注射。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序给予。

药物组合物可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等以及所选择的分子。药物组合物还可包括一种或多种活性成分，如抗菌剂、抗炎剂、麻醉剂等。

根据是否需要局部或全身治疗以及治疗区域的不同，药物组合物可以多种方式给予。给药可以是局部(包括眼、阴道、直肠、鼻内)、口服、吸入或肠外，例如静脉滴注、皮下、腹腔或肌肉注射。所公开的抗体可经静脉、腹腔、肌肉、皮下、腔内或经皮给予。

用于肠外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水载体包括水、酒精/水溶液、乳剂或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或固定油。静脉注射载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，诸如例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

局部给药制剂可包括软膏、乳液、面霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。传统的药物载体、水、粉末或油性碱、增稠剂等可能是必要的或可取的。

口服给药组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、袋剂或片剂。增稠剂、香料、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是可取的。

一些组合物可潜在地作为药学上可接受的酸或碱加成盐给予，并通过无机酸(如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和延胡索酸)反应形成，或无机碱(如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(如一、二、三烷基和芳基胺及取代乙醇胺)反应形成。

b)治疗用途

可以凭经验确定给予组合物的有效剂量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。组合物的给药剂量范围应足够大，以产生所需的效果，从而影响障碍的症状。剂量不应太大以致引起不利副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、病症、性别和疾病程度、给予途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可以通过本领域技术人员来确定。如果有任何禁忌症，也可以由个体医生来调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天一剂量或多剂量施用，持续一天或几天。对于给定类别的药品，可以在文献中找到针对适当剂量的指南。例如，在抗体治疗用途的文献中可以找到选择适当剂量抗体的指南，例如，handbookofmonoclonalantibodies，ferrone等人编，nogespublications，parkridge,n.j.，(1985)第22章和第303-357页；smith等人，antibodiesinhumandiagnosisandtherapy，haber等人编，ravenpress，newyork(1977)，第365-389页。根据上述因素，单独使用的抗体的典型每日剂量可能在每天约1μg/kg至100mg/kg体重或以上的范围内。

2.治疗癌症的方法

如本文所述，所公开的治疗剂递送载体和/或药物组合物可用于治疗发生不受控制的细胞增殖的任何疾病，诸如癌症。因此，在一个方面中，本文公开了治疗、减少、抑制或预防受试者的癌症(包括但不限于黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)；癌症(包括但不限于黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)的增殖；癌症(包括但不限于黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)的转移；和/或治疗、减少、抑制或预防肿瘤(包括，但不限于黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)手术切除之后癌症的复发、增殖或转移，其包括向癌症患者施用本文所公开的治疗剂递送载体和/或药物组合物。因此，在一个方面中，本文公开了治疗、减少、抑制或预防癌症、癌症增殖、癌症转移的方法；和/或治疗、减少、抑制或预防受试者手术切除肿瘤后癌症的复发、增殖或转移，包含向受试者施用治疗剂递送载体，该治疗剂递送载体包含修饰的血小板和靶向部分(或包含其的药物组合物)。可以理解，在所公开的方法中使用的治疗剂递送载体和/或药物组合物可进一步包括一种或多种治疗剂，以增强该治疗剂递送载体和/或药物组合物的免疫治疗效果。例如，在所公开的方法中使用的治疗剂递送载体和/或药物组合物可进一步包括小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-mt)、去甲哈尔满、迷迭香酸、艾卡哚司他、navooximod、阿霉素、泰莫西芬、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)，sirna、肽、模拟肽或抗体(诸如例如以及抗pdl-1抗体，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、bms-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。可以将一种或多种治疗剂封装在治疗剂递送载体中或与之化学连接，或与治疗剂递送载体一起提供在药物组合物中。因此，本文公开了治疗、减少、抑制或预防受试者的癌症；癌症的增殖；癌症的转移；和/或治疗、减少、抑制或预防肿瘤手术切除之后癌症的复发、增殖或转移，其包括向受试者施用包含修饰的血小板和靶向部分的治疗剂递送载体(或包含其的药物组合物)可在癌症免疫治疗中用作检查点阻断剂，其中治疗剂货物包含小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-mt)、去甲哈尔满、迷迭香酸、艾卡哚司他、navooximod、阿霉素、泰莫西芬、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)，sirna、肽、模拟肽或抗体(诸如例如以及抗pdl-1抗体，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、bms-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。

应理解并在本文中预期，在所公开的癌症治疗、抑制、减少和/或预防方法中使用的化学治疗剂可包括本领域已知的任何化学治疗剂，包括但不限于abemaciclib、醋酸阿比特龙、abitrexate(甲氨蝶呤)、abraxane(紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒配制剂)、abvd、abve、abve-pc、ac、ac-t、adcetris(本妥昔单抗)、ade、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、阿霉素(盐酸多柔比星)、马来酸阿法替尼、飞尼妥(依维莫司)、akynzeo(奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼)、艾达乐(咪喹莫特)、阿地白介素、alecensa(阿雷替尼)、阿雷替尼、阿伦单抗、爱宁达(培美曲塞二钠)、aliqopa(库潘尼西盐酸盐)、爱克兰针剂(盐酸美法仑)、爱克兰片剂(美法仑)、阿乐喜(盐酸帕洛诺司琼)、布吉他滨(布加替尼)、ambochlorin(苯丁酸氮芥)、ambochlorin(苯丁酸氮芥)、阿米福汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、阿可达(帕米膦酸二钠)、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、arzerra(奥法木单抗)、天冬酰胺酶欧文氏菌绿原酸、阿特珠单抗、阿瓦斯丁(贝伐单抗)、阿维鲁单抗、阿西替尼、阿扎胞苷、阿维单抗(阿维鲁单抗)、beacopp、becenum(卡莫司汀)、beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、bep、besponsa(依托珠单抗)、贝伐珠单抗、蓓萨罗丁、百克沙(托西莫单抗和碘i131托西莫单抗)、比卡鲁胺、bicnu(卡莫司汀)、博来霉素、博纳吐单抗、blincyto(博纳吐单抗)、硼替佐米、bosulif(伯舒替尼)、伯舒替尼、本妥昔单抗、布吉替尼、bumel、白消安、busulfex(白消安)、卡巴他赛、卡博替尼(苹果酸卡博替尼)、苹果酸卡博替尼、caf、campath(阿伦单抗)、camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、capox、carac(氟尿嘧啶-局部)、卡铂、卡铂-紫杉醇、卡非佐米、carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、cem、色瑞替尼、cerubidine(盐酸柔红霉素)、希瑞适(重组hpv二价疫苗)、西妥昔单抗、cev、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-强的松、chop、顺铂、克拉屈滨、克拉芬(环磷酰胺)、氯法拉滨、clofarex(氯法拉滨)、科罗拉(氯法拉滨)、cmf、考比替尼、cometriq(苹果酸卡博替尼)、库潘尼西盐酸盐、copdac、copp、copp-abv、更生霉素(放线菌素d)、cotellic(考比替尼)、克唑替尼、cvp、环磷酰胺、cyfos(异环磷酰胺)、cyramza(雷莫芦单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、赛德萨-u(阿糖胞苷)、cytoxan(环磷酰胺)、达拉菲尼、达卡巴嗪、达克金(地西他滨)、放线菌素d、达雷木单抗、达拉他滨(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素、地诺单抗、depocyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右雷佐生、地努图希单抗、多西他赛、doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、dox-sl(盐酸多柔比星脂质体)、dtic-dome(达卡巴嗪)、德瓦鲁单抗、efudex(氟尿嘧啶-局部)、埃立特(拉布立酶)、ellence(盐酸表柔比星)、埃罗妥珠单抗、乐沙定(奥沙利铂)、艾曲波帕、emend(阿瑞匹坦)、empliciti(埃罗妥珠单抗)、恩西地平甲磺酸盐、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、epoch、爱必妥(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林、erivedge(维莫德吉)、盐酸埃罗替尼、erwinaze(天冬酰胺酶欧文氏菌绿原酸)、ethyol(氨磷汀)、凡毕复(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、evacet(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、evista(盐酸雷洛昔芬)、evomela(盐酸美法仑)、依西美坦(exemestane)、5-fu(氟尿嘧啶注射液)、5-fu(氟尿嘧啶-局部用)、法乐通(托瑞米芬)、farydak(帕比司他)、芙仕得(氟维司群)、fec、氟隆(来曲唑)、非格司亭、福达华(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、fluoroplex(氟尿嘧啶-局部)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-局部、氟他胺、folex(甲氨蝶呤)、folexpfs(甲氨蝶呤)、伊立替康、伊立替康-贝伐单抗、伊立替康-西妥昔单抗(folfiri-cetuximab)、folfinox、folfox、folotyn(普拉曲沙)、fu-lv、氟维司群、加德西(重组hpv四价疫苗)、加德西9(重组hpv九价疫苗)、gazyva(阿托珠单抗)、吉非替尼(gefitinib)、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥珠单抗奥佐米星、健择(盐酸吉西他滨)、gilotrif(马来酸阿法替尼)、格列卫(甲磺酸伊马替尼)、gliadel(卡莫司汀植入物)、gliadelwafer(卡莫司汀植入物)、谷卡匹酶、醋酸戈舍瑞林、halaven(甲磺酸艾日布林)、hemangeol(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、hpv二价疫苗、重组hpv九价疫苗、重组hpv四价疫苗、重组美新(盐酸拓扑替康)、hydrea(羟基脲)、羟基脲、hyper-cvad、ibrance(帕博西尼)、替伊莫单抗、依鲁替尼、ice、iclusig(盐酸帕纳替尼)、idamycin(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉里斯(idelalisib)、idhifa(恩西地平甲磺酸盐)、ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、匹服平(异环磷酰胺)、il-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、imbruvica(依鲁替尼)、imfinzi(德瓦鲁单抗)、咪喹莫特(imiquimod)、imlygic(talimogenelaherparepvec)、inlyta(阿西替尼)、依托珠单抗、干扰素α-2b、重组白介素-2(阿地白介素)、introna(重组干扰素α-2b)、碘i131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹单抗、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、柠檬酸艾莎佐米、ixempra(伊沙匹隆)、jakafi(磷酸鲁索替尼)、jeb、jevtana(卡巴他赛)、kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、kepivance(帕利夫明)、keytruda(派姆单抗)、kisqali(瑞博西尼)、kymriah(tisagenlecleucel)、kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、lartruvo(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、瘤可宁(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、leustatin(克拉屈滨)、levulan(氨基乙酰丙酸)、linfolizin(苯丁酸氮芥)、lipodox(盐酸多柔比星脂质体)、洛莫司汀、lonsurf(三氟尿苷和盐酸替吡嘧啶)、lupron(醋酸亮丙瑞林)、luprondepot(醋酸亮丙瑞林)、luprondepot-ped(醋酸亮丙瑞林)、lynparza(奥拉帕尼)、marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、甲基苄肼(盐酸丙卡巴肼)、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、mekinist(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、mesnex(美司钠)、methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤lpf(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、mexate(甲氨蝶呤)、mexate-aq(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素c、盐酸米托蒽醌、mitozytrex(丝裂霉素c)、mopp、mozobil(普乐沙福)、mustargen(盐酸氮芥)、mutamycin(丝裂霉素c)、马利兰(白消安))、mylosar(阿扎胞苷)、mylotarg(吉妥珠单抗奥佐米星)、紫杉醇纳米颗粒(紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒配制剂)、诺维本(酒石酸长春瑞滨)、耐昔妥珠单抗、奈拉滨、neosar(环磷酰胺)、马来酸来那替尼、nerlynx(马来酸来那替尼)、奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼、neulasta(培非格司亭)、neupogen(非格司亭)、nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、nilandron(尼鲁他胺)、尼罗替尼、尼鲁米特、ninlaro(枸橼酸艾莎佐米)、尼拉帕尼对甲苯磺酸盐单水合物、纳武单抗、nolvadex(枸橼酸他莫昔芬)、nplate(罗米司亭)、奥滨尤妥珠单抗、odomzo(索尼吉布)、oepa、奥法木单抗、off、奥拉帕尼、olaratumab(奥拉单抗)、高三尖杉酯碱、oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、onivyde(盐酸伊立替康脂质体)、ontak(地尼白介素)、opdivo(纳武单抗)、oppa、奥斯替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒配制剂、pad、帕博西尼、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、帕比司他、paraplat(卡铂)、伯尔定(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、pcv、peb、培门冬酶、聚乙二醇非格司亭、聚乙二醇干扰素α-2b、peg-intron(聚乙二醇干扰素α-2b)、派姆单抗、培美曲塞二钠、perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、普拉汀诺(顺铂)、普拉汀诺-aq(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、portrazza(耐昔妥珠单抗)、普拉曲沙、强的松、盐酸丙卡巴肼、proleukin(阿地白介素)、prolia(地诺单抗)、promacta(艾曲波帕)、盐酸普萘洛尔、普罗文奇(sipuleucel-t)、purinethol(巯嘌呤)、purixan(巯嘌呤)、镭223二氯、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、r-chop、r-cvp、重组人乳头瘤病毒(hpv)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(hpv)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(hpv)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼、relistor(溴化甲基纳曲酮)、r-epoch、雷利米得(来那度胺)、rheumatrex(甲氨蝶呤)、瑞博西尼、r-ice、rituxan(利妥昔单抗)、利妥昔单抗(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉吡坦、罗米地辛、罗米司亭、红比霉素(盐酸柔红霉素)、rubraca(瑞卡帕布樟脑磺酸盐)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐、磷酸鲁索替尼、雷德帕斯(米哚妥林)、司兰索胸膜内气雾剂(滑石粉)、西妥昔单抗、sipuleucel-t、somatulinedepot(醋酸兰瑞肽)、索尼吉布、甲苯磺酸索拉非尼、施达赛(达沙替尼)、stanfordv、无菌滑石粉末(滑石粉)、steritalc(滑石粉)、stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、索坦(苹果酸舒尼替尼)、sylatron(聚乙二醇干扰素α-2b)、sylvant(西妥昔单抗)、synribo(高三尖杉酯碱)、tabloid(硫鸟嘌呤)、tac、tafinlar(达拉菲尼)、tagrisso(奥斯替尼)、滑石粉、talimogenelaherparepvec、枸橼酸他莫昔芬、tarabinepfs(阿糖胞苷)、特罗凯(盐酸厄洛替尼)、targretin(蓓萨罗丁)、泰息安(尼罗替尼)、紫杉醇(paclitaxel)、泰索帝(多西他赛)、tecentriq(阿特珠单抗)、temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、替西罗莫司、沙利度胺、thalomid(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、噻替派、tisagenlecleucel、tolak(氟尿嘧啶-局部)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、驮瑞赛尔(替西罗莫司)、托西莫单抗和碘i131托西莫单抗、totect(盐酸右雷佐生)、tpf、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、treanda(盐酸苯达莫司汀)、三氟尿苷和盐酸替吡嘧啶、trisenox(三氧化二砷)、泰立莎(二甲苯磺酸拉帕替尼)、unituxin(地努图希单抗)、尿苷三乙酸酯、vac、凡德他尼、vamp、varubi(盐酸罗拉吡坦)、vectibix(帕尼单抗)、veip、velban(硫酸长春花碱)、万珂(硼替佐米)、velsar(硫酸长春花碱)、维莫非尼、venclexta(维奈妥拉)、维奈妥拉、verzenio(玻玛西林)、viadur(醋酸亮丙瑞林)、维达扎(阿扎胞苷)、硫酸长春花碱、vincasarpfs(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、vip、维莫德吉、vistogard(尿苷三乙酸酯)、voraxaze(谷卡匹酶)、伏立诺他、votrient(盐酸帕唑帕尼)、vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、wellcovorin(亚叶酸钙)、xalkori(克唑替尼)、希罗达(卡培他滨)、xeliri、xelox、xgeva(地诺单抗)、xofigo(镭223二氯)、xtandi(恩杂鲁胺)、yervoy(伊匹单抗)、yondelis(曲贝替定)、zaltrap(ziv-阿柏西普)、zarxio(非格司亭)、zejula(尼拉帕尼对甲苯磺酸盐单水合物)、zelboraf(维莫非尼)、zevalin(替伊莫单抗)、zinecard(盐酸右雷佐生)、ziv-阿柏西普、枢复宁(盐酸昂丹司琼)、诺雷德(醋酸戈舍瑞林)、唑来膦酸、zolinza(伏立诺他)、择泰(唑来膦酸)、zydelig(艾代拉里斯)、zykadia(色瑞替尼)、和/或zytiga(醋酸阿比特龙)。因此，本文公开了治疗、减少、抑制或预防癌症、癌症增殖、癌症转移的方法，和/或治疗、减少、抑制或预防受试者的肿瘤手术切除后癌症的复发、增殖或转移，包含向受试者施用包含修饰的血小板和靶向部分的治疗剂；其中血小板已被修饰以包含治疗剂货物和化学键；其中血小板化学缀合至靶向部分；还包含分别以与本领域已知的任何化学治疗剂相同的组合物对受试者施用，该化学治疗剂包括但不限于abemaciclib、醋酸阿比特龙、abitrexate(甲氨蝶呤)、abraxane(紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒配制剂)、abvd、abve、abve-pc、ac、ac-t、adcetris(本妥昔单抗)、ade、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、阿霉素(盐酸多柔比星)、马来酸阿法替尼、飞尼妥(依维莫司)、akynzeo(奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼)、艾达乐(咪喹莫特)、阿地白介素、alecensa(阿雷替尼)、阿雷替尼、阿伦单抗、爱宁达(培美曲塞二钠)、aliqopa(库潘尼西盐酸盐)、爱克兰针剂(盐酸美法仑)、爱克兰片剂(美法仑)、阿乐喜(盐酸帕洛诺司琼)、布吉他滨(布加替尼)、ambochlorin(苯丁酸氮芥)、ambochlorin(苯丁酸氮芥)、阿米福汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、阿可达(帕米膦酸二钠)、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、arzerra(奥法木单抗)、天冬酰胺酶欧文氏菌绿原酸、阿特珠单抗、阿瓦斯丁(贝伐单抗)、阿维鲁单抗、阿西替尼、阿扎胞苷、阿维单抗(阿维鲁单抗)、beacopp、becenum(卡莫司汀)、beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、bep、besponsa(依托珠单抗)、贝伐珠单抗、蓓萨罗丁、百克沙(托西莫单抗和碘i131托西莫单抗)、比卡鲁胺、bicnu(卡莫司汀)、博来霉素、博纳吐单抗、blincyto(博纳吐单抗)、硼替佐米、bosulif(伯舒替尼)、伯舒替尼、本妥昔单抗、布吉替尼、bumel、白消安、busulfex(白消安)、卡巴他赛、卡博替尼(苹果酸卡博替尼)、苹果酸卡博替尼、caf、campath(阿伦单抗)、camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、capox、carac(氟尿嘧啶-局部)、卡铂、卡铂-紫杉醇、卡非佐米、carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、cem、色瑞替尼、cerubidine(盐酸柔红霉素)、希瑞适(重组hpv二价疫苗)、西妥昔单抗、cev、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-强的松、chop、顺铂、克拉屈滨、克拉芬(环磷酰胺)、氯法拉滨、clofarex(氯法拉滨)、科罗拉(氯法拉滨)、cmf、考比替尼、cometriq(苹果酸卡博替尼)、库潘尼西盐酸盐、copdac、copp、copp-abv、更生霉素(放线菌素d)、cotellic(考比替尼)、克唑替尼、cvp、环磷酰胺、cyfos(异环磷酰胺)、cyramza(雷莫芦单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、赛德萨-u(阿糖胞苷)、cytoxan(环磷酰胺)、达拉菲尼、达卡巴嗪、达克金(地西他滨)、放线菌素d、达雷木单抗、达拉他滨(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素、地诺单抗、depocyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右雷佐生、地努图希单抗、多西他赛、doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、dox-sl(盐酸多柔比星脂质体)、dtic-dome(达卡巴嗪)、德瓦鲁单抗、efudex(氟尿嘧啶-局部)、埃立特(拉布立酶)、ellence(盐酸表柔比星)、埃罗妥珠单抗、乐沙定(奥沙利铂)、艾曲波帕、emend(阿瑞匹坦)、empliciti(埃罗妥珠单抗)、恩西地平甲磺酸盐、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、epoch、爱必妥(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林、erivedge(维莫德吉)、盐酸埃罗替尼、erwinaze(天冬酰胺酶欧文氏菌绿原酸)、ethyol(氨磷汀)、凡毕复(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、evacet(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、evista(盐酸雷洛昔芬)、evomela(盐酸美法仑)、依西美坦(exemestane)、5-fu(氟尿嘧啶注射液)、5-fu(氟尿嘧啶-局部用)、法乐通(托瑞米芬)、farydak(帕比司他)、芙仕得(氟维司群)、fec、氟隆(来曲唑)、非格司亭、福达华(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、fluoroplex(氟尿嘧啶-局部)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-局部、氟他胺、folex(甲氨蝶呤)、folexpfs(甲氨蝶呤)、伊立替康、伊立替康-贝伐单抗、伊立替康-西妥昔单抗(folfiri-cetuximab)、folfinox、folfox、folotyn(普拉曲沙)、fu-lv、氟维司群、加德西(重组hpv四价疫苗)、加德西9(重组hpv九价疫苗)、gazyva(阿托珠单抗)、吉非替尼(gefitinib)、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥珠单抗奥佐米星、健择(盐酸吉西他滨)、gilotrif(马来酸阿法替尼)、格列卫(甲磺酸伊马替尼)、gliadel(卡莫司汀植入物)、gliadelwafer(卡莫司汀植入物)、谷卡匹酶、醋酸戈舍瑞林、halaven(甲磺酸艾日布林)、hemangeol(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、hpv二价疫苗、重组hpv九价疫苗、重组hpv四价疫苗、重组美新(盐酸拓扑替康)、hydrea(羟基脲)、羟基脲、hyper-cvad、ibrance(帕博西尼)、替伊莫单抗、依鲁替尼、ice、iclusig(盐酸帕纳替尼)、idamycin(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉里斯(idelalisib)、idhifa(恩西地平甲磺酸盐)、ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、匹服平(异环磷酰胺)、il-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、imbruvica(依鲁替尼)、imfinzi(德瓦鲁单抗)、咪喹莫特(imiquimod)、imlygic(talimogenelaherparepvec)、inlyta(阿西替尼)、依托珠单抗、干扰素α-2b、重组白介素-2(阿地白介素)、introna(重组干扰素α-2b)、碘i131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹单抗、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、柠檬酸艾莎佐米、ixempra(伊沙匹隆)、jakafi(磷酸鲁索替尼)、jeb、jevtana(卡巴他赛)、kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、kepivance(帕利夫明)、keytruda(派姆单抗)、kisqali(瑞博西尼)、kymriah(tisagenlecleucel)、kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、lartruvo(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、瘤可宁(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、leustatin(克拉屈滨)、levulan(氨基乙酰丙酸)、linfolizin(苯丁酸氮芥)、lipodox(盐酸多柔比星脂质体)、洛莫司汀、lonsurf(三氟尿苷和盐酸替吡嘧啶)、lupron(醋酸亮丙瑞林)、luprondepot(醋酸亮丙瑞林)、luprondepot-ped(醋酸亮丙瑞林)、lynparza(奥拉帕尼)、marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、甲基苄肼(盐酸丙卡巴肼)、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、mekinist(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、mesnex(美司钠)、methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤lpf(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、mexate(甲氨蝶呤)、mexate-aq(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素c、盐酸米托蒽醌、mitozytrex(丝裂霉素c)、mopp、mozobil(普乐沙福)、mustargen(盐酸氮芥)、mutamycin(丝裂霉素c)、马利兰(白消安))、mylosar(阿扎胞苷)、mylotarg(吉妥珠单抗奥佐米星)、紫杉醇纳米颗粒(紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒配制剂)、诺维本(酒石酸长春瑞滨)、耐昔妥珠单抗、奈拉滨、neosar(环磷酰胺)、马来酸来那替尼、nerlynx(马来酸来那替尼)、奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼、neulasta(培非格司亭)、neupogen(非格司亭)、nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、nilandron(尼鲁他胺)、尼罗替尼、尼鲁米特、ninlaro(枸橼酸艾莎佐米)、尼拉帕尼对甲苯磺酸盐单水合物、纳武单抗、nolvadex(枸橼酸他莫昔芬)、nplate(罗米司亭)、奥滨尤妥珠单抗、odomzo(索尼吉布)、oepa、奥法木单抗、off、奥拉帕尼、olaratumab(奥拉单抗)、高三尖杉酯碱、oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、onivyde(盐酸伊立替康脂质体)、ontak(地尼白介素)、opdivo(纳武单抗)、oppa、奥斯替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒配制剂、pad、帕博西尼、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、帕比司他、paraplat(卡铂)、伯尔定(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、pcv、peb、培门冬酶、聚乙二醇非格司亭、聚乙二醇干扰素α-2b、peg-intron(聚乙二醇干扰素α-2b)、派姆单抗、培美曲塞二钠、perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、普拉汀诺(顺铂)、普拉汀诺-aq(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、portrazza(耐昔妥珠单抗)、普拉曲沙、强的松、盐酸丙卡巴肼、proleukin(阿地白介素)、prolia(地诺单抗)、promacta(艾曲波帕)、盐酸普萘洛尔、普罗文奇(sipuleucel-t)、purinethol(巯嘌呤)、purixan(巯嘌呤)、镭223二氯、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、r-chop、r-cvp、重组人乳头瘤病毒(hpv)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(hpv)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(hpv)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼、relistor(溴化甲基纳曲酮)、r-epoch、雷利米得(来那度胺)、rheumatrex(甲氨蝶呤)、瑞博西尼、r-ice、rituxan(利妥昔单抗)、利妥昔单抗(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉吡坦、罗米地辛、罗米司亭、红比霉素(盐酸柔红霉素)、rubraca(瑞卡帕布樟脑磺酸盐)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐、磷酸鲁索替尼、雷德帕斯(米哚妥林)、司兰索胸膜内气雾剂(滑石粉)、西妥昔单抗、sipuleucel-t、somatulinedepot(醋酸兰瑞肽)、索尼吉布、甲苯磺酸索拉非尼、施达赛(达沙替尼)、stanfordv、无菌滑石粉末(滑石粉)、steritalc(滑石粉)、stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、索坦(苹果酸舒尼替尼)、sylatron(聚乙二醇干扰素α-2b)、sylvant(西妥昔单抗)、synribo(高三尖杉酯碱)、tabloid(硫鸟嘌呤)、tac、tafinlar(达拉菲尼)、tagrisso(奥斯替尼)、滑石粉、talimogenelaherparepvec、枸橼酸他莫昔芬、tarabinepfs(阿糖胞苷)、特罗凯(盐酸厄洛替尼)、targretin(蓓萨罗丁)、泰息安(尼罗替尼)、紫杉醇(paclitaxel)、泰索帝(多西他赛)、tecentriq(阿特珠单抗)、temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、替西罗莫司、沙利度胺、thalomid(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、噻替派、tisagenlecleucel、tolak(氟尿嘧啶-局部)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、驮瑞赛尔(替西罗莫司)、托西莫单抗和碘i131托西莫单抗、totect(盐酸右雷佐生)、tpf、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、treanda(盐酸苯达莫司汀)、三氟尿苷和盐酸替吡嘧啶、trisenox(三氧化二砷)、泰立莎(二甲苯磺酸拉帕替尼)、unituxin(地努图希单抗)、尿苷三乙酸酯、vac、凡德他尼、vamp、varubi(盐酸罗拉吡坦)、vectibix(帕尼单抗)、veip、velban(硫酸长春花碱)、万珂(硼替佐米)、velsar(硫酸长春花碱)、维莫非尼、venclexta(维奈妥拉)、维奈妥拉、verzenio(玻玛西林)、viadur(醋酸亮丙瑞林)、维达扎(阿扎胞苷)、硫酸长春花碱、vincasarpfs(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、vip、维莫德吉、vistogard(尿苷三乙酸酯)、voraxaze(谷卡匹酶)、伏立诺他、votrient(盐酸帕唑帕尼)、vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、wellcovorin(亚叶酸钙)、xalkori(克唑替尼)、希罗达(卡培他滨)、xeliri、xelox、xgeva(地诺单抗)、xofigo(镭223二氯)、xtandi(恩杂鲁胺)、yervoy(伊匹单抗)、yondelis(曲贝替定)、zaltrap(ziv-阿柏西普)、zarxio(非格司亭)、zejula(尼拉帕尼对甲苯磺酸盐单水合物)、zelboraf(维莫非尼)、zevalin(替伊莫单抗)、zinecard(盐酸右雷佐生)、ziv-阿柏西普、枢复宁(盐酸昂丹司琼)、诺雷德(醋酸戈舍瑞林)、唑来膦酸、zolinza(伏立诺他)、择泰(唑来膦酸)、zydelig(艾代拉里斯)、zykadia(色瑞替尼)、和/或zytiga(醋酸阿比特龙)。所述方法还可包括施用本文所公开的任何治疗剂，包括但不限于小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-mt)、去甲哈尔满、迷迭香酸、艾卡哚司他、navooximod、阿霉素、泰莫西芬、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)，sirna、肽、模拟肽或抗体(诸如例如以及抗pdl-1抗体，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、bms-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。

如上所述，所公开的方法或在治疗癌症中有用。所公开的组合物可用于治疗的代表性但不限于以下的癌症列表：淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、霍奇金病、髓系白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、肾脏癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、神经母细胞瘤/胶质母细胞瘤，卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌、咽鳞状细胞癌、喉鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、结肠癌、宫颈癌、子宫颈癌、乳腺癌，以及上皮癌、肾癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食管癌、头颈癌、大肠癌、造血癌、睾丸癌、结直肠癌、前列腺癌或胰腺癌。

在一个方面中，所公开的包括向受试者施用本文所公开的任何治疗剂递送载体或药物组合物的治疗癌症的方法可包括以适合治疗受试者特定癌症的任何频率施用治疗剂递送载体或药物组合物。例如，治疗剂递送载体或药物组合物至少每12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时一次，每3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天一次，每2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月一次施用给患者。在一个方面中，治疗剂递送载体或药物组合物每周施用至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次。

在一个方面中，本文所公开的施用给受试者以供所公开的方法中使用的治疗剂递送载体或药物组合物的量可包括医师所确定的适于治疗受试者的特定癌症的任何量。例如，治疗剂递送载体或药物组合物的量可为约10mg/kg至约100mg/kg。例如，施用的治疗剂递送载体或药物组合物的量可为至少10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg或100mg/kg。因此，在一个方面中，本文公开了治疗受试者的癌症的方法，其中施用的治疗剂递送载体或药物组合物的剂量为约10mg/kg至约100mg/kg。

c.实例

提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评估本文所要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在纯粹地示范并且非旨在限制公开。已经努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，温度为℃或处于环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。

1.实例1：用于癌症免疫治疗的pd-1阻断剂细胞囊泡

a)结果

(1)用apd1装饰的工程血小板

从全小鼠血液中收集血小板，并用前列腺素e1(pge1)处理以抑制血小板活化。通过共价缀合方法，使用磺基琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(smcc)作为接头将apd1与血小板缀合。流式细胞仪分析和共聚焦图像均证实apd1在血小板上的成功修饰。此外，使用酶联免疫吸附测定法(elisa)对apd1在血小板上的缀合量进行了定量，结果表明apd1的最大缀合量达到了约0.3pg/血小板(图3a)。这种偶联显示出可忽略的细胞毒性，并且不诱导血小板溶解，这通过24小时后血小板的完整性得到证实(图3b)。另外，我们通过胶原蛋白结合和血小板聚集表征了血小板的功能。p-apd1与胶原蛋白有效结合，与天然血小板相比差异不明显。活化后血小板和p-apd1均聚集，表明apd1的缀合不会改变血小板的功能。此外，已经证实，活化后，由于pmp的产生，释放了显著量的apd1，其显著高于未活化的血小板，这表明在装饰apd1后良好保留了生物功能(图3c)。

(2)hsc与血小板整合

从c57b6小鼠的股骨和胫骨中分离hsc，并在含有40μmac4galnaz的培养基中培养72小时。已确定ac4galnaz可通过n-乙酰半乳糖胺(galnac)代谢并掺入粘蛋白型o型糖蛋白来标记众多细胞。细胞活力研究证实了在研究浓度下ac4galnaz的细胞毒性不显著。通过添加基于炔基的探针fam炔来确定hsc表面叠氮化物基团的存在。流式细胞仪分析显示，当与fam炔烃通过点击反应与ac4galnaz处理的hsc发生反应时，其荧光信号增加，这明显高于hsc对照。此外，经共聚焦观察，ac4galnaz处理的hsc显示出明亮的荧光，而在hsc对照中未发现荧光信号。

接下来，将血小板与可以与血小板表面上的胺基反应的二苯并环辛炔-peg4-n-羟基琥珀酰亚胺酯(dbco-peg4-nhs酯)缀合。dbco-peg4-nhs酯的成功装饰取决于叠氮基荧光探针azide-fluor488的共价连接。流式细胞仪分析显示，dbco-peg4-nhs酯处理过的血小板的荧光信号比未处理过的血小板和与叠氮化物探针物理混合的血小板更亮。

为了通过点击反应用血小板装饰hsc，将dbco-peg4-nhs酯处理过的血小板置于掺有叠氮化物的hsc中，并孵育45分钟。为了避免血小板-hsc组装的聚集，添加过量的叠氮化物-peg以阻断血小板上的游离dbco基团。从共聚焦和扫描电子显微镜(sem)图像中可以看出，在细胞-细胞界面处可以清楚观察到直接修饰，并且细胞的缀合以1:1的比例(血小板：hsc)精确调整，这可以归因于细胞间位阻(图1b)。另外，缀合后hsc和血小板形态均得到良好维持。血小板功能得到了很好的保存，这可以通过一些关键蛋白的保存以及活化后产生血小板来源的微粒来证明(图1c)。为了进一步研究hsc表面缀合的血小板数量的影响，增加了血小板与hsc的反应比，并定量了结合在hsc上的血小板数量。以1:1(血小板:hsc)的比例，大多数组装体是一个hsc上的一个血小板(约66％)。随着血小板数目的增加，hsc表面缀合的血小板也相应增加。以8:1的比例，超过80％的hsc与三个以上的血小板结合(图1d和1e)。然而，hsc生存力随着缀合的血小板数目的增加而降低。因此，为了进行以下研究，选择了1:1的反应比(血小板:hsc)。

(3)s-p-apd1的体内治疗功效

残留的白血病细胞在骨髓中的保留是aml复发的主要原因之一。因此，药物递送系统在骨髓中的积累以消除白血病细胞对于增强抗白血病作用至关重要。为了研究s-p-apd1的骨髓归巢能力，首先评估了s-p-apd1的体内药代动力学。如图4a所示，s-p-apd1的半衰期比游离apd1的半衰期长得多，这可以归因于具有血小板的hsc的循环时间长。游离apd1的快速清除可以归因于大鼠抗鼠igg的高免疫原性。然后测试了s-p-apd1的骨髓归巢能力。apd1用cy5.5标记并分别与hsc、血小板和hsc-血小板缀合。将游离的apd1、hsc-apd1(称为s-apd1)、血小板-apd1(称为p-apd1)、hsc和血小板-apd1混合物(称为s+p-apd1)和s-p-apd1以相同的apd1剂量静脉注射到c57b6小鼠，6小时后，取出腿骨进行成像。s-apd1和s-p-apd1在骨髓中均显示出比p-apd1、s+p-apd1混合物和游离apd1组更高的荧光信号，这表明hsc的骨髓积累能力更高(图4b)。定量结果显示，用s-apd1和s-p-apd1治疗的小鼠的骨组织的荧光信号比其他组多25倍(图4c)。此外，hsc和p-apd1的简单掺混并没有增强apd1在骨髓的积累。通过荧光成像进一步证实了hsc-血小板组装体在骨髓中的积累，这是由hsc(绿色荧光)和血小板(红色荧光)在骨髓中的共定位所证明的，并表明了hsc和定位在骨髓内的血小板的膜的保存完整性。此外，在用hsc-血小板治疗的骨髓中发现了pmp的荧光信号，而在血小板和pmp组中观察到了无关紧要的pmp。pmp的存在表明，用hsc-血小板治疗后，在骨髓中pmp的原位潜在产生，这可能是由骨髓中的白血病微环境触发的。

为了研究s-p-apd1对aml的治疗效果，将c1498细胞静脉注射到c57b6小鼠中。通过流式细胞仪确认施用后pd-l1在c1498细胞上的表面表达。在以0.5mg/kg的apd1剂量治疗一周后，每隔一天用三倍剂量的盐水、hsc、血小板、游离apd1、s-apd1、p-apd1、s+p-apd1和s-p-apd1治疗患有c1498白血病的小鼠(图4d)。另外，另一组小鼠每天施用apd1治疗，持续6天(apd1剂量为0.25mg/kg)。通过c1498细胞的生物发光信号监测白血病的生长。如图4e和4f所示，用s-p-apd1治疗的小鼠在两周后显示出降低的生物发光信号，并且在三周后生物发光信号完全消失。此外，该组中的8只小鼠中有7只显示出强烈的免疫反应，没有任何可检测到的白血病细胞信号。相反，由于apd1的快速清除和非特异性生物分布，因此用apd1治疗的小鼠在存活时间方面未显示出增强的免疫作用。p-apd1组的适度治疗功效可归因于血小板缺乏骨髓归巢能力。此外，由于细胞间相互作用的空间位阻，s-apd1组的微不足道免疫反应可归因于t细胞的低效活化。相反，具有骨髓归巢能力的s-p-apd1可以有效地积累在骨髓中，并有效地将apd-1释放给初始t细胞。接受s-p-apd1的小鼠在80天后的存活率与白血病的生长有关，约为87.5％。相反，对于所有其他apd1治疗组，没有小鼠存活超过40天，对于盐水组，没有小鼠存活超过30天(图4h)。还使用流式细胞仪分析了外周血中的c1498细胞。如图4g所示，接受s-p-apd1治疗的小鼠的c1498细胞数量微不足道，这明显低于其他apd1治疗组和生理盐水对照组。

此外，将接受不同治疗的小鼠的脾切除并成像(图4i)。s-p-apd1治疗的小鼠的脾脏显示正常形态，而其他治疗组的脾脏较大。定量结果表明，用s-p-apd1治疗的小鼠的脾脏最小，是其他脾脏的1/2-1/3(图4j)。然后使用苏木精和曙红(h&e)染色研究主要器官中白血病的发展。在用盐水治疗的小鼠的骨髓、肝、脾和肺组织中发现了白血病细胞。而用s-p-apd1治疗的小鼠的主要器官中的白血病细胞数量可忽略不计。尤其是，用盐水治疗的小鼠的脾脏中的免疫功能区几乎被白血病细胞破坏，这可能导致无效的免疫应答。

(4)t细胞介导的免疫反应

为了了解潜在的观察到的s-p-apd1治疗功效的细胞机制，收集治疗后外周血中的t细胞并通过流式细胞仪进行分析。与盐水、hsc和血小板治疗的对照组相比，在接受s-p-apd1治疗的小鼠中观察到cd3+t细胞大约增加了4倍(图5a和5c)。与其他apd1治疗组相比，s-p-apd1治疗组的cd3+t细胞显示增加1.9-2.4倍(图5a和5c)。此外，与盐水、hsc和血小板对照组相比，接受s-p-apd1治疗的小鼠的cd8+t细胞增加了1.5倍，与其他apd1治疗组相比增加了约1.3倍(图5b和5d)。此外，与其他apd1治疗组相比，s-p-apd1治疗组的ifnγ+cd8+t细胞增加了1.9-2.6倍，与生理盐水、hsc和血小板对照组相比增加了6.4-17.8倍。cd3+、cd8+和ifnγ+cd8+t细胞的这些增加与抑制白血病的生长一致，证实了s-p-apd1组的有效免疫应答和细胞毒性t细胞的启动。进一步分析了骨髓中的t细胞亚群。通过流式细胞仪在患有白血病的小鼠的骨髓中检测到表达pd-1的t细胞。与盐水、hsc和血小板对照组相比，接受s-p-apd1治疗的小鼠的cd8+t细胞增加1.8-1.9倍，与其他使用apd1的治疗组相比，其增加约1.3倍。此外，用s-p-apd1治疗后，小鼠骨髓中的cd8+t细胞显示出约44％的gzmb阳性(图6)，这显著高于其他治疗组，表明效应t细胞在s-p-apd1治疗后增加。此外，s-p-apd1治疗组处于早期激活状态的效应t细胞高于其他治疗组，这可以通过cd8+cd44+cd69+和cd8+cd44+cd25+t细胞的百分比更高来证明。与其他apd1治疗组相比，s-p-apd1治疗组的ifnγ+cd8+t细胞增加2.6-2.9倍，比生理盐水、hsc和血小板对照组相比，增加5.3-21.2倍。相比之下，用s-p-apd1治疗的不患白血病小鼠的骨髓中cd8+和ifnγ+cd8+t细胞亚群没有显示出明显的增加。细胞因子和趋化因子基于luminex的定量揭示了四个共同调节的蛋白簇在用apd1治疗后，外周血中的许多促炎因子增加(图5e)。此外，与其他apd1治疗组相比，s-p-apd1组中的大多数细胞因子和趋化因子均被上调，这与s-p-apd1的优异抗白血病治疗功效相一致。血清细胞因子水平升高可能反映包括单核细胞和髓样细胞的其他免疫细胞亚群的变化，因为aml的特征是防止单核细胞和髓样细胞的成熟。如先前的研究所示，白血病的发展可能会导致aml患者单核细胞和包括粒细胞的其他髓样细胞异常。

为了进一步证实s-p-apd1治疗的长期效力，分离了cd8+t细胞，并通过流式细胞仪进行了分析。除了将天然cd8+t细胞转变为活性表型外，还存在向中枢记忆cd8+t细胞表型的转变。cd44⁺cd62l⁺中枢记忆表型比生理盐水对照高2.1倍(图7a)。同样，cd44^hicd122^hi记忆t细胞亚群也增加了。在再次激发实验中证明了s-p-apd1治疗的小鼠中记忆亚组的功能。接下来，在接种白血病80天后，将接受s-p-apd1治疗的小鼠用1×10⁶个c1498细胞再次激发。结果表明，先前治疗的无白血病小鼠对新施用的白血病细胞有抵抗力，并且在60天时仍保持无白血病，而这种白血病在天然小鼠中生长强劲(图7b和7c)。在天然小鼠组中，所有动物在40天内死亡。这些结果表明由s-p-apd1治疗诱导的长期抗白血病免疫应答。为了进一步证实t细胞介导的免疫应答在s-p-apd1治疗中的关键作用，向t细胞敲除小鼠(rag^-/-)注射c1498细胞，然后施用s-p-apd1。如图7d所示，盐水组中的所有动物在三周内死亡。此外，与盐水对照组相比，游离的apd1和s-p-apd1治疗没有对白血病的生长或生存益处提供任何显著的抑制，表明在基于apd1的治疗中t细胞介导的免疫应答。考虑到s-p-apd1改变cd8+t细胞表型的能力，仅努力确定观察到的抗白血病作用是否取决于cd8+t细胞。通过腹膜内施用抗cd8单克隆抗体，使患有c1498白血病细胞的小鼠的cd8+t细胞耗尽。通过流式细胞仪分析证实了cd8+t细胞的完全耗尽。在不存在cd8+t细胞的情况下，s-p-apd1的治疗作用被取消。没有接受盐水、游离apd1和s-p-apd1的小鼠存活超过40天，表明cd8+t细胞对于通过s-p-apd1治疗产生抗白血病作用至关重要(图7e)。还在pd1基因敲除小鼠模型(pd^-/-)中研究了s-p-apd1的治疗功效。在具有微不足道的存活益处的pd1基因敲除小鼠中发现抗白血病作用显著降低，证实了pd1阻断在pd1介导的免疫反应中的重要性(图7f)。

为了评估s-p-apd1治疗另一种类型的白血病的有效性，我们在balb/cj小鼠中使用了wehi-3骨髓单核细胞白血病细胞系。在这种白血病模型中，接受s-p-apd1治疗的小鼠表现出更好的白血病控制，并且62.5％的治疗的小鼠在第50天还活着。相反，对照组中的小鼠在第40天时死亡，并具有较大的脾脏。

总之，这项研究提出了一种新的“细胞组合”药物递送方法，一种细胞用于靶向，另一种细胞用于主动释放，以实现有效的免疫应答，从而彻底消除白血病细胞。通过利用hsc归巢能力和血小板原位活化，s-p-apd1可以增强apd1在骨髓中的递送和效力，从而有效地引发t细胞并抑制白血病的生长和复发。与传统的aml非选择性细胞毒剂相比，此类s-p-apd1可以诱导有效的免疫应答，同时减轻毒性。此外，s-p-apd1递送系统可将免疫原性和副作用降至最低，因为这些成分均来自患者本身。由于优异的生物相容性和易制造性，这种新开发的用于递送免疫检查点抑制剂的生物技术细胞工程方法代表了一个有吸引力的临床转化平台。此外，可以采用该细胞组装介导的递送策略以掺入其他生物微粒以治疗多种疾病，对于这些疾病，时空药物递送至关重要。

b)材料和方法

(1)细胞系。

小鼠白血病细胞系c1498由明尼苏达大学的bruceblazar博士友情提供。c1498细胞保存在dulbecco的改良eagle培养基(dmem)(gibco，invitrogen，carlsbad，加利福尼亚洲)中，并添加10％胎牛血清(invitrogen，carlsbad，加利福尼亚洲)、100u/ml青霉素(invitrogen)和100u/ml链霉素(invitrogen)。从c57bl/6j小鼠的股骨和胫骨中分离出hsc和祖细胞(在所有研究中均称为hsc)。首先使用谱系耗竭试剂盒(miltenyi，德国)对骨髓进行预富集。随后用抗sca-1微珠试剂盒(miltenyi)处理所得细胞，以获得lin^-sca-1⁺hsc。在加入人类il-6(50ng/ml，thermoscientific)、人类flt3配体(100ng/ml，thermoscientific)、鼠干细胞因子(scf，50ng/ml，thermoscientific)和低密度脂蛋白(ldl，40μg/ml，thermoscientific)的无血清扩增培养基(sfem，stemcelltechnologies，剑桥，马萨诸塞州)中培养细胞。将细胞在培养箱(thermoscientific)中于37℃，5％co2和90％相对湿度的环境下培养。大约每2-3天以1:3的分流比将细胞在80％融合下传代培养。

(2)抗体。

抗pd1抗体(apd1)获自biolegend(目录号114114，clone：rmp1-14)。用于免疫染色的抗体对cd3(biolegend，目录号100236,clone:17a2)、cd4(bdbioscience，目录号553046,clone:rm4-5)、cd8a(biolegend，目录号100708,clone:53-6.7)、ifn-γ(biolegend，目录号505806,clone:xmg1.2)、cd122(biolegend，目录号123207,clone:tm-β1)、cd41(biolegend，目录号133904,clone:mwreg30)、cd9(biolegend，目录号124807,clone:mz3)、cd61(biolegend，目录号104307,clone:2c9.g2(hmβ3-1)、cd62p(biolegend，目录号148305,clone:rmp-1)、cd36(biolegend，目录号102605,clone:hm36)、cd154(biolegend，目录号106505,clone:mr1)、cd62l(biolegend，目录号104405,clone:mel-14)、cd44(biolegend，目录号103024,clone:im7)、cd34(biolegend，目录号128609,clone:hm34)、cd38(bdbioscience，目录号558813,clone:90/cd38)、cd117(biolegend，目录号105812,clone:2b8)、cd366(bdbioscience，目录号566346,clone:5d12/tim-3)、cd223(biolegend，目录号125207,clone:c9b7w)、cd274(biolegend，目录号124311,clone:10f.9g2)、颗粒酶b(gzmb)(biolegend，目录号372204,clone:qa16a02)、cd25(biolegend，目录号101904,clone:3c7)、cd69(biolegend，目录号104508,clone:h1.2f3)。染色后的细胞按照制造商的说明进行荧光激活细胞分选(facs)分析。使用多色流式细胞仪并进行适当补偿。所有抗体均按照制造商的说明使用。缀合在抗体上的荧光染料与相同的荧光染料通道完全匹配。染色后，使用flowjo或cytexpert软件包在facscalibur仪器(cytoflex，bd)上分析细胞。cd8+t细胞耗竭抗体(clone：yts169.4)购自bioxcell。大鼠igg购自invitrogen。从研发系统获得重组的mpd-1。用于免疫染色的二抗是山羊抗大鼠igg(h+l；thermofisherscientific，目录号a18866)。

(3)小鼠。

c57bl/6j小鼠、t细胞敲除小鼠(b6.129s7-rag1^tm-mom/j)和pd1敲除小鼠(b6.cg-pdcd1^tm1.1shr/j)购自jackson实验室。所有动物研究严格按照北卡罗来纳大学教堂山分校和北我卡罗来纳州立大学机构动物护理和使用委员会批准的动物方案进行了。

(4)apd1缀合血小板的制备。

从小鼠全血中分离出鼠血小板。简而言之，用含有1.0ml柠檬酸-磷酸右旋糖(16mm柠檬酸，90mm柠檬酸钠，16mmnah2po4，142mm葡萄糖，ph7.4)的edta二钾处理过的管，从c57bl/6j小鼠中收集全血(从眶窦无末期收集)。然后通过在室温下将全血以100g离心20分钟来收集富含血小板的血浆(prp)。此后，将前列腺素e1(pge1)以1μm的最终浓度添加到富含血小板的血浆中，并在100g下将prp离心20分钟，以进一步去除红细胞。为了分离血小板，将富含血小板的血浆以800g离心20分钟。接下来，收集沉淀并将其重悬于含有1mmedta和1μmpge1的pbs缓冲液中。为了体外活化血小板，将血小板溶液以800g离心20分钟，然后悬浮在pbs缓冲液中。使用血细胞计数器在显微镜下计数血小板的数目。

为了通过磺基琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(sulfo-smcc,pierce)接头装饰血小板表面的apd1(biolegend)，首先使用流式细胞仪检测血小板表面的游离巯基。简而言之，将1×10⁶血小板与pbs中的0.1mg/ml马来酰亚胺荧光探针(mal-fitc，sigma)混合，并在反应15分钟后以800g离心10分钟。然后洗涤血小板，离心并进行流式细胞仪分析。这里经报道具有最少的游离硫醇基团的红细胞被用作对照组。接下来，将apd1与sulfo-smcc在4℃下以1:1.2的摩尔比反应2小时。然后将混合物在超滤管中(截留分子量＝3kda)离心，以弃去多余的smcc接头。之后，将smcc-apd1添加到血小板中并在室温下保持1小时以获得apd1-血小板。通过在800g离心20分钟去除多余的抗体。在实验中使用之前，将沉淀洗涤并在室温下储存在含有1μmpge1的pbs中。为了进一步评估apd1的缀合效率，如上所述，使各种量的apd1与血小板反应，并且将所得到的apd1-血小板离心、洗涤并使用超声裂解。通过elisa(大鼠igg总elisa试剂盒，ebioscience)测量缀合至血小板的apd1的量。为了评估apd1对血小板的作用，通过在反应后24小时用显微镜计数血小板的数量来研究血小板的稳定性。为了研究apd1的释放，将0.5u/ml凝血酶添加到1×10⁸apd1血小板悬液(500μl)中，以在37℃下活化血小板。以预定的时间间隔收集50μl样品，并以800g离心20分钟，然后通过elisa检测上清液。未活化的apd1-血小板用作对照。

为了进一步研究apd1缀合后血小板的功能，进行了胶原结合和血小板聚集研究。将鼠i/iii型胶原蛋白(bio-rad)重构至2.0mg/ml的浓度，添加至96孔板中，并在4℃下孵育过夜。将孔板进一步用2％bsa封闭2小时，并用pbs洗涤以进行胶原结合研究。仅封闭空白孔板，但不添加胶原蛋白。将1×10⁷个用wgaalexafluor594染色的p-apd1或血小板添加到有或没有胶原蛋白预涂覆的血小板中。孵育1分钟后，将孔板用pbs洗涤，并共聚焦成像。为了进行聚集研究，将标记有wgaalexafluor594的p-apd1或血小板在含0.5u/ml凝血酶的完全培养基中孵育，然后进行共聚焦成像(clsm，lsm710,zeiss)。

为了可视化血小板表面上apd1的装饰，将apd1与fitc缀合，然后用罗丹明染色血小板。然后通过共聚焦激光扫描显微镜(clsm，lsm710，zeiss)观察apd1-血小板。为了进一步表征apd1-血小板，将apd1-血小板用pe染色的大鼠抗igg抗体染色，并进行流式细胞仪分析。将未染色的血小板以及血小板和抗体的简单混合物用作对照。

(5)hsc-血小板-apd1组装体的制备。

从c57bl/6j小鼠的股骨和胫骨中分离出hsc，并在含有40μmac4galnaz(thermoscientific)的培养基中培养72小时。为了检测hsc表面上叠氮基的存在，将hsc与含有50μm铜(ii)-tbta复合物、2mm抗坏血酸钠、25μmfam炔烃的pbs在避光孵育。15分钟后，将所得的hsc用pbs洗涤三次，并进行流式细胞仪分析和共聚焦观察。为了使具有三键的血小板功能化以进行点击反应，在室温下将血小板用20μm二苯并环辛炔-peg4-n-羟基琥珀酰亚胺酯(dbco-nhs)处理30分钟，然后如上所述用apd1装饰。为了检查血小板上三键的存在，将所得的血小板与20μm叠氮化物-fitc探针避光反应15分钟，然后进行流式细胞仪分析。

为了将血小板与hsc缀合，将1×10⁷dbco功能化的血小板添加到1×10⁷ac4galnaz处理的hsc中，并在37℃下孵育45分钟。此后，将过量的叠氮化物-peg(50μm)加入hsc和血小板混合物中，再孵育15分钟，以淬灭血小板表面的其他dbco。通过共聚焦显微镜观察所得的血小板-hsc组装体。血小板用罗丹明染色以进行观察。

为了研究hsc表面上血小板的缀合量，将血小板的反应量从1:1(血小板与hsc之比)增加至8:1。加入过量的叠氮化物peg后，将所得的s-p-apd1用pbs洗涤三次，并进行共聚焦显微镜分析。还通过在不同反应比下计数200个s-p-apd1组装体来量化hsc上缀合的血小板的百分比。

为了进行扫描电子显微镜(sem)表征，首先将s-p-apd1用3.5％的戊二醛固定4小时，用pbs洗涤三次，然后用乙醇按梯度系列(30％、50％、70％、85％、90％每次持续15分钟，100％两次持续30分钟)脱水，然后用叔丁醇处理。在真空下干燥后，将s-p-apd1涂覆金/钯并在sem(verios460l)上进行检查。

为了测试在hsc上缀合后血小板的生物活性，将s-p-apd1用0.5u/ml凝血酶在37℃下处理30分钟，然后在300g下离心5分钟。收集上清液，并用2％乙酸铀酰染色，并用透射电子显微镜(tem，jeol2000fx，hitachi)观察。还通过检查血小板上关键蛋白的表达来检测s-p-apd1上血小板的功能。简而言之，将s-p-apd1用各种大鼠抗小鼠抗体(cd61、cd41、cd9、cd36、cd62p、cd154、biolegend)染色，并通过流式细胞仪进行分析。在添加凝血酶以激活血小板后进行cd62p和cd154检测。

为了测试缀合后hsc的生存力，将hsc或s-p-apd1接种在96孔板中，并在孵育48小时后向其中加入10μlcck8溶液(日本dojindo)。4小时后，通过酶标仪在450nm的波长处测量吸光度。

为了使apd-1在hsc表面缀合，将1×10⁶个hsc与用罗丹明染色的smcc-apd1在4℃下反应1小时。在400g离心5分钟后，将hsc-apd1在37℃下孵育2和6小时。在用溶酶体绿色示踪剂、hoechst33258和锥虫蓝染色后，将hsc-apd1进行共聚焦观察。

(6)体内药代动力学。

将六只小鼠随机分为两组并静脉注射游离apd1(apd1，1mg/kg)和s-p-apd1(每只小鼠200μlpbs中apd1，1mg/kg，hsc/血小板，1×10⁸)。在预定的时间点，从尾巴中收集10μl血液样本，在100μl水中稀释并进行超声处理。通过大鼠igg总elisa试剂盒测量释放的apd1。为了进行体内生物分布研究，给小鼠静脉注射cy5.5标记的游离apd1、s-apd1、p-apd1、hsc和apd1的混合物以及s-p-apd1。6小时后，取出骨头并使用ivisspectrum系统(perkinelmer)记录骨头的荧光图像。通过livingimagesoftware分析感兴趣区域(roi)的荧光强度。为了使hsc-血小板组装体的骨髓积累，向患有白血病的小鼠静脉内注射hsc-血小板组装体(用fitc染色的hsc，罗丹明染色的血小板，hsc/血小板，5×10⁷)。注射后12小时，对小鼠实施安乐死。收集骨头并切片。将骨组织固定在10％福尔马林中。48小时后，将骨头在edta溶液中脱钙2天，然后在30％蔗糖中孵育。之后，将骨组织在o.c.t.培养基中冷冻以进行切片。用赫斯特(hoechst)染色后，将骨切片进行共聚焦显微镜观察。为了观察在骨髓中pmp的潜在产生，将罗丹明标记的血小板、pmp和hsc血小板静脉内注射给患有白血病的小鼠。24小时后，收集骨组织，如上所述进行切片，并进行共聚焦观察。荧光信号的定量在imagej软件上进行。

(7)体内白血病治疗。

为了建立白血病模型，将1×10⁶个荧光素酶标记的c1498细胞静脉内注射到小鼠中。7天后，将64只小鼠随机分为8组，并以细胞数为5×10⁷，apd1浓度为0.5mg/kg经尾静脉静脉注射pbs、hsc、血小板、游离apd1、s-apd1、p-apd1、s+p-apd1和s-p-apd1。每隔一天重复治疗三次。通过检测来自c1498细胞的生物发光信号来监测白血病的生长。d-萤光素(xenogen)用作萤光素酶的底物，每只小鼠以在100μlpbs中浓度为150mg/kg腔内注射d-萤光素。注射d-荧光素5分钟后用ivis光谱成像系统(perkinelmer)收集生物发光图像，生物发光信号的采集时间为5分钟。在注射c1498细胞后1周、2周和3周记录生物发光信号。使用livingimage软件4.3.1版(perkinelmer)定量生物发光信号。为了校正背景生物发光，减去了从无白血病小鼠(注射有d-荧光素)获得的信号。3周后，收集100μl血液样品，并用红细胞裂解缓冲液裂解。将剩余的细胞进行流式细胞仪分析以研究外周血中c1498细胞的量。此外，记录每只小鼠的存活时间，并对脾脏称重和成像。此外，取出主要组织(心脏、肝脏、脾脏、肺、肝、骨头)进行苏木精和曙红(h&e)染色。通过光学显微镜(dm5500b,leica)观察载玻片。

为了研究s-p-apd1治疗功效的根本的细胞机制，以apd1的浓度为0.5mg/kg给t细胞敲除小鼠(rag^-/-)、cd8+t细胞耗竭的小鼠和pd1敲除小鼠(pd^-/-)注入盐水、游离的apd1和s-p-apd1。记录每只小鼠的存活时间。为了耗尽cd8+t细胞，在治疗期间内，在s-p-apd1治疗前2天开始的每72小时向c57bl/6j小鼠腹膜内注射500μg抗cd8单克隆抗体(克隆yts169.4，bioxcell)。通过从外周血分离的t细胞的流式细胞仪分析证实耗尽(cytoflex，beckmancoulter，美国)。所有的流式细胞仪数据均通过cytexpert软件进行分析。

为了进行白血病再次激发研究，在首次注射c1498细胞80天后，向c57bl/6j小鼠注射1×10⁶个c1498细胞。每周监测生物发光信号并记录存活时间。

(8)细胞因子和趋化因子的检测以及t细胞分析。

使用基于luminex的检测方法测量多种细胞因子和趋化因子的血浆水平。在第12天收集外周血，然后以300g离心10分钟。将上清液等分并保存在-80℃直至分析。用luminex测定缓冲液稀释样品，并遵循制造商的说明。在聚类之前，将细胞因子值按每个样品的z分数归一化。使用热图功能，通过k均值聚类，基于细胞因子的分布将样品分为四类。为了研究骨髓中t细胞中pd-1的表达，收集骨髓并用抗cd8和抗pd1抗体染色(收集用于分析的事件为5×10⁴)。抗人cd8抗体用作同种型对照抗体。对于t细胞分析，在第12天收集外周血和骨髓。血样首先用红细胞裂解缓冲液裂解，然后用抗cd3、抗cd8、抗cd4、抗颗粒酶b、抗cd44、抗cd25、抗cd69和抗ifnγ抗体染色30分钟。根据biolegend细胞内染色方案进行粒酶b染色。为了计数cd3+t细胞数量，首先用红细胞裂解缓冲液裂解150μl血液，并在加入50μl计数珠的apc抗cd3抗体染色后进行流式细胞仪分析。用于cd8和cd4分析的收集的事件为1×10⁵，用于ifnγ分析的收集的事件为5×10⁴。为了进行记忆t细胞分析，在30天后从盐水治疗的小鼠和s-p-apd1治疗的小鼠中取出脾细胞，并用抗cd8、抗cd44、抗cd62l和抗cd122抗体染色。之后，将染色的细胞进行流式细胞仪分析(收集的用于分析的事件为5×10⁴)。为了检测pd^-/-小鼠的t细胞衰竭，收集正常小鼠和pd^-/-小鼠淋巴结的淋巴细胞，用抗cd8、抗tim-3和抗lag-3染色并进行流式细胞仪分析(收集的用于分析的事件为5×10⁴)。对于来自脾脏和淋巴结分析的t细胞，首先将组织进行机械破碎，然后通过40μm过滤器过滤细胞以进行进一步分析。

(9)统计。

显示的所有结果均为平均值s.d.使用graphpadprism(6.0)评估统计分析。对数秩检验用于生存时间的统计分析，而双尾学生氏t检验用于其他统计分析。在p值<0.05的情况下，实验组与对照组之间的差异具有统计学意义。

d.参考文献

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