一种活性天然产物纳米载药系统及其制备方法与应用与流程

本发明属于纳米医药技术领域，涉及一种纳米载药系统及其制备方法与应用，尤其涉及一种基于熊果酸和齐墩果酸为纳米药物载体的纳米载药系统及其制备方法以及在癌症治疗方面的应用。

背景技术：

癌症是世界范围内的主要公共卫生问题，传统的化学治疗对于大多数癌症患者来说仍然是一种不可或缺的治疗方法，但是它不能区分患病细胞和正常细胞，因此在治疗癌症的同时，往往又不可避免的承受其对正常组织器官的损伤，这让患者承受了更大的额外的痛苦，并且严重限制了化疗药物的临床应用。

药物传递系统的应用在纳米医学领域引起了广泛的关注(jdrugtarget2016,24(3),179-191)。纳米药物载体是一种很有前途的药物载体，设计和合成高效的药物传递系统对癌症治疗至关重要(chem.rev.2015,115(16),8564-608)。

各种纳米药物载体如碳纳米管(int.j.pharm.2015,479(2),357-363)、脂质体(j.controlledrelease2016,229,10-22)、聚合物胶束(jcontrolrelease2004,97(2),249-257)、纳米凝胶(nanomedicine2018,14(7),2387-2395)、纳米颗粒(actabiomater2016,29,248-260)等已被开发出来。

然而，多数药物载体还存在诸多局限性，包括载药量低、体内药物泄漏快、血液清除率高，特别是载药纳米粒在临床应用中可能导致生物相容性差、生物降解性差等问题(jcontrolrelease2012,160(2),117-134)。尤其，目前几乎所有药物载体都只是药物运输的辅料，大量载体的使用，由于不良的新陈代谢和血液清除，往往会导致额外的毒性作用(bioconjugchem2016,27(4),855-862；naturereviewsmaterials2016,1,16014)。

天然产物是药品和保健品的主要来源，具有很好的生物活性、生物相容性和生物安全性。因此，利用活性天然产物自身固有的生物安全性和生物相容性，开发具有生物活性的药物载体材料，让纳米载体也具有一定的抗肿瘤功效或保健功效，那么大量纳米载体摄入导致的毒副作用就不用那么担心了，并有望实现载体与药物协同抗肿瘤，以及减缓化疗药物引起的毒副作用的目的，让化学疗法治疗肿瘤的方法中实现安全高效治疗。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种活性天然产物纳米载药系统及其制备方法与应用，该纳米载药系统首次将天然活性小分子熊果酸或齐墩果酸不经过任何修饰直接用于制备纳米载体，并成功装载疏水性药物形成纳米载药颗粒；载体可以与抗癌药物通过将细胞阻滞在不同细胞周期，或通过不同机制将细胞周期阻滞在同一细胞周期，起到协同抗肿瘤效果，提高肿瘤抑制率；载体可以通过抗氧化途径有效降低化疗药物引起的组织损伤；而且纳米载药系统有良好的生物相容性和系统安全性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种活性天然产物纳米载药系统，以活性天然产物熊果酸或齐墩果酸作为药物载体，药物载体与疏水性药物的质量比为1～20:1，其中：疏水性药物为紫杉醇及其紫杉烷类药物、姜黄素、喜树碱等中的一种，该纳米载药系统可用于癌症(尤其是乳腺癌、肝癌但不限于)的治疗。

一种活性天然产物纳米载药系统的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将药物载体熊果酸或齐墩果酸和疏水性药物溶解于良性有机溶剂中，得到浓度为1～5mg/ml的混合液，其中：良性有机溶剂主要包括甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、正己烷及其他们之间的溶剂中的一种或几种；

步骤二、将步骤一的混合液加入到含有质量浓度为1～5％的表面活性剂溶液中，涡旋震荡0.5～3分钟，其中：混合物与表面活性剂溶液的体积比为1:1～6，表面活性剂包括酸性表面活性剂、碱性表面活性剂以及中性表面活性剂中的一种，尤其是聚乙烯醇；

步骤三、将步骤二的混悬液进行乳化处理，尤其是超声乳化1～5分钟；

步骤四、将步骤三形成的乳液滴加至质量浓度为0.1～0.8％的表面活性剂水溶液中，进行搅拌挥发有机溶剂，其中：该过程应在不高于25℃环境下进行，乳液与的表面活性剂水溶液的体积比为1:5～30，表面活性剂包括酸性表面活性剂、碱性表面活性剂以及中性表面活性剂中的一种，尤其是聚乙烯醇；

步骤五、将步骤四的溶液进行高速离心处理(转数不低于5000转)、双蒸水洗涤，除去残留表面活性剂，收获载药纳米颗粒；

步骤六、向步骤五得到的载药纳米颗粒中加入水、生理盐水或pbs，制成混悬液备用，并于4℃下保存；或者将步骤五得到的载药纳米颗粒干燥或冻干，进行长期保存，保存条件为室温冷藏或冷冻。

本发明具有如下优点：

1、本发明选用活性天然产物熊果酸或齐墩果酸作为药物载体，并且载体由且仅由熊果酸或齐墩果酸构成，并形成纳米微球。

2、熊果酸和齐墩果酸不经过任何化学修饰和结构改造，纳米载体系统保留了熊果酸和齐墩果酸完整的生物活性。

3、该纳米载体可与疏水性药物发生弱相互作用，形成纳米载药颗粒。

4、纳米载药颗粒的粒经大小为100～300nm，平均粒经约为150～190nm，不会形成给药栓塞，可以用于患者静脉给药或腹腔给药。

5、熊果酸纳米载药系统最高载药量和最佳包封率为：23.12％±1.07％和94.41±4.28％；齐墩果酸纳米载药系统最高载药量和最佳包封率为为12.95％±0.51％和58.76±2.54％。

6、该纳米载药颗粒亲水性得到明显改善，血液半衰期较化学药物延长3～6倍。

7、该纳米载药颗粒具有良好的生物安全性，对正常细胞没有或有极低的细胞毒性。

8、该纳米载药颗粒能起到协同抗肿瘤作用，协同指数小于0.9。

9、该纳米载药颗粒具有高的肿瘤靶向性，能够有效的在肿瘤部位富集。

10、4t1荷瘤小鼠模型，肿瘤抑制率高于70％。

11、该纳米载药颗粒能够有效降低机体毒副作用，其中血液学指标(白细胞数，淋巴细胞数，中性粒细胞数)较紫杉醇注射液相比显著提高p<0.01。

12、该纳米载药颗粒能够提高可机体抗氧化能力，治疗组肝组织中sod(超氧化物歧化酶)和gsh(还原型谷胱甘肽)含量显著高于紫杉醇注射液治疗组，p<0.05。

附图说明

图1为熊果酸纳米颗粒(uanps)和熊果酸装载紫杉醇(ua-ptxnps)扫描电子显微镜图像，标尺为1微米；

图2为齐墩果酸纳米颗粒(oanps)和齐墩果酸装载紫杉醇(oa-ptxnps)扫描电子显微镜图像，标尺为1微米；

图3为熊果酸纳米颗粒(uanps)和熊果酸装载紫杉醇(ua-ptxnps)透射电子显微镜图像；

图4为齐墩果酸纳米颗粒(oanps)和齐墩果酸装载紫杉醇(oa-ptxnps)透射电子显微镜图像；

图5为熊果酸和齐墩果酸固体粉末和纳米粒子的接触角；

图6为熊果酸纳米载药颗粒载药量包封率；

图7为齐墩果酸纳米载药颗粒载药量包封率；

图8为纳米载药颗粒在不同ph释放介质中体外释放曲线图；

图9为熊果酸纳米载药颗粒体外细胞毒性和细胞周期，a.熊果酸固体粉末与熊果酸纳米颗粒对mcf-7细胞生长抑制作用48hb.熊果酸纳米粒子对mcf-7细胞生长抑制作用48hc.纳米粒子作用在mcf-7和4t1细胞上的结合指数(ci)d.不同纳米制剂对mcf-7细胞周期的阻滞作用；

图10为齐墩果酸纳米载药颗粒体外细胞毒性和细胞周期，a.齐墩果酸固体粉末与齐墩果酸纳米颗粒对mcf-7细胞生长抑制作用48hb.齐墩果酸纳米粒子对mcf-7细胞生长抑制作用48hc.纳米粒子作用在mcf-7和4t1细胞上的结合指数(ci)d.不同纳米制剂对mcf-7细胞周期的阻滞作用；

图11为荷瘤小鼠在熊果酸载药颗粒(ua-ptxnps)治疗后肿瘤体积变化图；

图12为荷瘤小鼠在齐墩果酸载药颗粒(oa-ptxnps)治疗后肿瘤体积抑制率图；

图13为齐墩果酸纳米粒子对小鼠肝脏组织损伤保护作用的生化指标和抗氧化指标评价以及肝脏组织切片h&e染色图像。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供了一种天然小分子纳米载药粒子(nps)，其载体材料主要包括两种小分子活性天然产物：熊果酸(ursolicacid,ua)、齐墩果酸(oleanolicacid,oa)，结构式如下：

本发明采用乳化溶剂挥发法制备纳米颗粒，具体步骤如下：

(1)载体纳米颗粒：将5.0mg载体(熊果酸、齐墩果酸)溶解在1.0ml二氯甲烷中(如不能完全溶解可加少量甲醇做助溶剂)，随后涡旋震荡条件下加入到3.0ml，2.5％聚乙烯醇(pva)水溶液(w/v)，涡旋震荡60s，立刻将涡旋液转移至探头式超声仪下对混合物进行60s的超声处理。然后，将形成的乳状液在400rpm的磁性搅拌速度，滴加至30ml、0.3％pva水溶液(w/v)。溶液在室温下搅拌6～8小时以去除有机溶剂。然后在4℃下以12,000rpm离心40分钟，收集纳米粒子，用双蒸馏水洗涤两次(去除多余的pva和游离药物)，并冻干备用。

(2)载药纳米颗粒的制备方法：将5.0mg熊果酸和1.25mg紫杉醇溶解在1.0ml二氯甲烷中(如不能完全溶解可加少量甲醇做助溶剂)或将5.0mg齐墩果酸酸和1.0mg紫杉醇溶解在1.0ml二氯甲烷中，随后步骤严格按照载体纳米颗粒制备方法进行相同操作，以获得载药纳米颗粒。

图1-图4是由两种载体制备的纳米颗粒和载药纳米颗粒的sem和tem图片，两种载体构成的纳米粒子均为形貌均一的纳米球形结构，平均粒经<200nm，具有优良的分散性；装载紫杉醇形成载药纳米粒子后，其形貌没有发生改变，说明药物加载后没有对载体组装结构带来显著变化。tem图像显示，ua形成的载体纳米粒子为实心球型，而oa形成的载体纳米粒子为空心球形，而二者装载药物后均为实心球型结构。

纳米粒子表征：

(1)三相接触角测量在室温下进行，冻干粉末都统一放在载玻片(平均13毫米直径和平均厚度2毫米)。5μl液滴的去离子水滴加至样品表面，平衡10秒后，液滴使用高速摄像机拍摄，对成像液滴轮廓进行了仿真，获得三相接触角度，测量至少进行了三次。

图5为接触角实验结果，本产品的亲水性得到显著改善，将有利于实现纳米粒子在血液中的长循环。

(2)纳米粒子载药量和包封率测定：

用高效液相色谱系统对纳米颗粒制剂中的药物浓度进行测定。将载药纳米粒子冻干粉溶解在二甲基亚砜中，破坏纳米颗粒，释放装载的药物。0.22μm针头过滤器过滤，流动相为乙腈/水(65/35,v/v)，用227nm的检测器波长分析ptx含量。

图6和图7为小分子活性天然产物的药物装载量和包封率，其中熊果酸装载紫杉醇，最大载药量和封装效率分别为23.12％±1.07％和94.41±4.28％；齐墩果酸装载紫杉醇的最大装载量和包封率分别为12.95％±0.51％和58.76±2.54％。

(3)体外释放实验，分别在37℃、ph7.3和5.5条件下测定了载药纳米颗粒的体外释放曲线。

图8为释放曲线结果，在ph7.3和5.5时，ua-ptxnps的累积ptx释放量分别约为40％和30％；在ph7.3和5.5时，oa-ptxnps的累积ptx释放量分别约为18％和10％。纳米载药粒子显示出极佳的稳定，有望防止药物在体内的过早泄露。

体外细胞实验：

图9和图10分别为熊果酸载药纳米粒子和齐墩果酸载药纳米粒子的体外细胞实验结果，结果显示，在相同紫杉醇当量下，载药纳米粒子增强了mcf-7细胞的抑制率，联合指数计算显示ic50下联合指数均小于1.0，表明载体与药物具有协同抗肿瘤作用，能有效提高抗肿瘤效果。细胞周期显示熊果酸与紫杉醇通过将mcf-7细胞阻滞在不同有丝分裂周期实现协同增效作用。

体内抗肿瘤效果：

图11和图12分别为4t1荷瘤小鼠经不同药物治疗后肿瘤体积变化。结果显示，单独的载体纳米粒子对肿瘤均有不同程度的抑制作用，而熊果酸载药组肿瘤抑制率高达90％，显著高于单独药物组和单独载体组；需要特别说明的是，oa-ptxnps治疗组肿瘤抑制率比非生物活性载体plga-ptx组肿瘤抑制率高10％。这一结果也进一步证实，有生物活性的天然产物装载抗癌药物可以实现协同增效作用作用。

副作用评价：

图13分别测定了血清中典型肝组织损伤的生化指标以及肝组织的抗氧化指标，结果显示，活性天然产物载药组机体各项指标较游离药物组以及非活性载体组均有一定程度上减缓，这说明载体在递送系统中起到了积极正面的作用，对各组肝组织切片进行h&e染色后进行病理分析，结果表明，活性天然产物载药组肝组织损伤得到了有效修复，说明载体能够一定程度上减缓化疗药物引起的副作用。