专利名称:富含胰岛素样生长因子的鹿茸纳米化制品及其制备方法
技术领域：
本发明属于鹿茸提取物的医用或食用制品领域。更具体地来说，本发明涉及由富 含胰岛素样生长因子(IGF-I)的鹿茸提取物制成的纳米化制品。另外，本发明还涉及制备 该鹿茸纳米化制品的方法，以及该制品在药品、食品、保健品和化妆品等方面的应用。
背景技术：
鹿茸(鹿尚未骨化的幼角)和鹿角作为传统的中药材，具有强筋健骨、补肾壮阳、 疏通督脉等功效，自古以来就被广泛应用于配制成为各种滋补药品、食品、保健品和化妆 品。通过现代药物化学研究分析，鹿茸中含有许多种生理活性成分，包括磷脂、生物胺类化 合物、前列腺素、维生素、氨基酸、无机盐、不饱和脂肪酸、皮质醇等。随着现代生物技术高速 发展，人们发现鹿茸中除了含有上述各种生理活性成分之外，其中还含有胰岛素样生长因 子(IGF-I)、胰岛素、人生长激素(HGH)、促生长释放因子(GHRF-6)、神经生长因子(NGF)、表 皮生长因子(EGF)、成纤维生长因子(FGF)等大分子活性蛋白质。以上各种活性成分，尤其 是各种活性蛋白质，相互协同作用，发挥功效。其中，胰岛素样生长因子起着尤为突出的作 用。IGF-I具有促进细胞分裂的作用，能够用于治疗和预防碳水化合物等能源代谢调节紊乱 等方面的疾病，如治疗和预防糖代谢或脂肪代谢等方面的疾病，如糖尿病等。中国专利申请 CN1251531A公开了可以利用IGF-I诱导或提高组织生长、增殖或再生的方法，尤其是利用 IGF-I促进内耳组织的生长；中国专利申请CN1204263A披露了可以利用IGF-I治疗脑或脊 髓神经的退行性疾病，如阿尔兹海默症(Alzheimer's Disease)、帕金森氏症(Parkinson's Disease)等。在治疗糖尿病方面，也有大量文献披露了利用IGF-I治疗I型、II型和胰岛 素耐药性糖尿病等方面的实践(参见中国专利申请CN1387440A、CN1384201A等)。
在传统的鹿茸加工过程中，鹿茸直接粉碎后服用，颗粒较大，造成吸收效率低下； 有时，鹿茸的加工需要经过加热煎煮、烘干等步骤，高温会使其中的IGF-I等蛋白质变性， 从而降低乃至丧失它们的功效。另一种传统的加工方式是将鹿茸浸泡在高浓度酒精含量的 酒中，制成药酒服用。但是由于酒中含有高浓度的作为有机溶剂的酒精，会使IGF-I等蛋白 质变性，而且从大颗粒鹿茸中也不利于溶解出IGF-I等蛋白质，因而会导致IGF-I等蛋白质 被破坏，使得鹿茸的使用效率低下，造成资源浪费。另外，高浓度酒精含量的药酒也限制了 每次的服用量。
为了提高鹿茸材料的使用效率，人们尝试了各种方法提取鹿茸的有效成分。例如， 国际专利申请W02004/035069A披露了一种用于预防和治疗糖尿病的鹿角制品及其制备方 法，但是每1克该制品中仅仅含有18ng IGF-I和0. 5ng胰岛素。中国专利CN1241943C公 开了一种鹿茸制品的提取方法，但是其中提取出的物质没有提示可以经过纳米化包裹等修 饰处理，口服时要面对胃肠道的吸收屏障和消化系统的蛋白水解酶降解的难题，造成IGF-I 等有效成分的实际吸收效率的低下。
人们也尝试各种方法提取鹿茸的有效成分，制备成各种有利于吸收的制品，尤其 是制备成纳米化的制品，从而提高鹿茸材料的吸收效率。例如，中国专利申请CN1723992A就公开了一种用特定方式制备的含有纳米级鹿茸粉和核桃仁粉等成分的制品，作为抗疲劳 和增强免疫力的保健品。但是，该制品在制备的过程中，鹿茸需要用乙醇溶剂进行萃取，由 于酒精是一种有机溶剂，对IGF-I等水溶性蛋白质萃取效率低，而且容易使这些蛋白质变 性，破坏了 IGF-I等蛋白质的功效，造成制成品中IGF-I等蛋白质的活性低，影响了使用效 果。中国专利CN1166369C公开了一种使用水、植物油和/或动物油将鹿茸或鹿角制成粒径 为10 IOOOnm的胶体状液或混悬液，但是在制备过程中对鹿茸的所有粉碎物进行纳米化 处理，没有去除其中大量不能为人体所吸收的角质成分，而且使用植物油或动物油将不能 充分提取IGF-I等水溶性蛋白质，使该制品中IGF-I的实际含量低，而且这种纳米化的颗粒 并不能有效避免消化系统的蛋白水解酶的降解。
针对现有技术中存在的缺陷，经过长期艰苦的研究，本发明人获得了一种新的富 含胰岛素样生长因子(IGF-I)的鹿茸提取物及其纳米化制品，克服了上述缺陷。本发明的 制品不但IGF-I的含量高并保持了高活性，充分利用了鹿茸资源，而且纳米化的制品可以 带来一定的促渗作用，有助于克服胃肠道的吸收屏障和酶屏障的问题。此外，该制品的制备 工艺合理，便于在大规模生产中控制质量，而且制备过程使用天然原材料，可以生物降解， 避免了人工合成产品的污染，更容易为消费者接受。
发明内容
本发明提供了一种由鹿茸提取物制成的纳米化制品及其制备方法，所述提取物富 含胰岛素样生长因子。本发明还提供了该纳米化制品在制备药品、食品、保健品和化妆品中 的应用。
在第一方面，本发明提供了一种由鹿茸提取物制成的纳米化制品，其包含粒径为 IiTlOOO纳米(nm)的纳米囊球，而且所述提取物中胰岛素样生长因子(IGF-I)的含量为 10(Γ10000纳克/克。本发明的制品中的提取物的IGF-I含量为10(Γ 0000纳克/克提 取物，远远高于其他已知鹿茸提取物的IGF-I含量，优选所述IGF-I含量为lOOCTeOOOng/ 克，更优选为150(T4500ng/克。而且本发明的制品所述制品中的纳米囊球的粒径优选为 IO^lOOOnm,更优选为 2(T800nm，更优选为 4(T400nm。
所述制品可以通过以下两个步骤来获得首先从鹿茸中用溶剂提取出富含IGF-I 的提取物；然后将上述提取物制备成纳米化制品。本发明优选选用新鲜鹿茸或冷藏的新鲜 鹿茸作为原材料，有利于最大限度地保存IGF-I等活性成分的含量和活性。本文中所用的 术语“新鲜”指的是采集鹿茸后6小时内就开始进行加工制备本发明的纳米化制品或进行 冷藏了，优选加工或冷藏不迟于采集后的3小时，更有选不迟于1小时，最优选不迟于20分 钟。本文中所用的术语“冷藏”指的是将鹿茸保存于0°C以下的环境中，优选保存于-20°C 的环境中。
本发明优选将水作为溶剂，提取出IGF-I含量为lOCTlOOOOng/克的提取物，优选 IGF-I含量为lOOCTeOOOng/克，更优选为150(T4500ng/克。而纳米化制品的产生可以采用 超音速射流法或聚合物包裹法来制备纳米级的颗粒或囊球。优选本发明的制品为纳米级的 囊球，其采用聚合物包裹鹿茸提取物形成纳米级的囊球。合适的聚合物有用单体合成的聚 合物和脂肪族类聚酯类聚合物。用单体合成的聚合物的单体实例有丙烯酰胺、丙烯酸酯和 氰基丙烯酸烷基酯及它们的衍生物。由于多为人工合成，该类许多聚合物不能为生物降解， 因此本发明的制品优选包含具有良好的可生物降解的脂肪族类聚酯类聚合物，由此形成纳米级的囊球。这类聚合物的实例有聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PLG)、聚乙交酯丙交酯共聚物 (PLGA)、聚己内酯(PCL)、多聚氨基酸及它们的衍生物等，优选多聚氨基酸。其他优选的实例 是一些天然高分子聚合物及它们的衍生物，可选的天然高分子聚合物有白蛋白、壳聚糖、葡 聚糖、海藻酸盐等，它们具有良好的可生物降解的性质，分散后可形成纳米囊球包裹活性成 分。
本发明的纳米化制品特别优选含有粒径为10(T400nm的纳米囊球。在一个具体 实施方式中，本发明的纳米化制品中含有壳聚糖，使用壳聚糖包裹鹿茸提取物，形成粒径为 10(T400nm的纳米囊球。壳聚糖包裹的鹿茸提取物除了对其中肽类物质具有一定的促渗透 作用，而且由于壳聚糖具有较前的粘膜粘附特性，也能抑制一定的蛋白酶降解，防止IGF-I 等有效成份在吸收前就被降解。此外，在壳聚糖中缀和蛋白酶抑制剂，如EDTA等金属蛋白 酶抑制剂，也可以降低蛋白酶的降解作用。因此，本发明的含有壳聚糖的纳米化制品尤其适 合进一步加工成口服制品，如口喷剂、片齐U、胶囊剂等。
本发明的纳米化制品还优选含有粒径为5(Tl50nm的纳米囊球。在一个具体实施 方式中，本发明的纳米化制品中含有多聚氨基酸，使用多聚氨基酸包裹鹿茸提取物，形成粒 径为5(Tl50nm的纳米囊球。多聚氨基酸可以选自多聚赖氨酸以及由亮氨酸和谷氨酸组成 的聚氨基酸(参见国际专利申请W096/029991A)。
本发明的纳米化制品除了含有上述鹿茸提取物和聚合物包裹材料之外，还可以进 一步包含药学上可接受的辅剂，从而加工各种剂型。药学上可接受的辅剂包括药学上可接 受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与活性成分相容。运用药学上可接受的辅剂制备制剂对 本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的制剂包含一种或多种本发明第一个方面所 述的纳米化制品作为活性成分，将该纳米化制品和药学上可接受的辅剂(如本领域普通技 术人员所熟知的载体、赋形剂、稀释剂等)组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂 和液体制剂。优选本发明的制剂为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延 迟释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂等剂型，从而适合 各种给药形式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等 的给药形式。本发明的纳米化制品特别优选制成口喷剂、胶囊剂或注射剂。其中载体、赋形 剂、稀释剂是药学上可接受的并与活性成分相容。可以选用的合适的赋形剂优选但不仅限 于水、生理盐水、葡萄糖，甘油、乙醇或其类似物及其组合。
在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的纳米化制品在制备促进细胞增殖的 药品、保健食品和/或化妆品中的应用。本发明的纳米化制品由富含IGF-I的鹿茸提取物 制成，具有促进细胞分裂、增殖的作用，可用于诱导或提高患者的组织生长、增殖或再生的 水平，治疗相应疾病，例如脑或脊髓神经的退行性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森氏症等。由 于是天然制品，而且鹿茸本身有着悠久的使用历史，健康人服用一定量的本发明的纳米化 制品有助于维持其正常的细胞分裂、增殖作用，有助于保持其充沛的活力。健康人外用一定 量的本发明的纳米化制品有助于维持其皮肤细胞的分裂、增殖，改善外部形象，具有美容的 作用。
在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的纳米化制品在制备治疗和/或预防 碳水化合物代谢调节紊乱的药品和/或保健食品中的应用。本发明的纳米化制品由富含 IGF-I的鹿茸提取物制成，能够用于治疗和/或预防碳水化合物等能源代谢调节紊乱等方面的疾病或亚健康状态，如治疗和预防糖代谢或脂肪代谢等方面的疾病，特别是糖尿病，包 括I型、II型和胰岛素耐药性糖尿病等。
对于本发明第二和第三方面的药品来说，本发明的纳米化制品可以加工成各种药 物剂型，对需要促进细胞增殖或者需要治疗和/或预防碳水化合物代谢调节紊乱的患者给 药。给药的剂量和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、病情、患病 时间、身体状况等)确定。一般而言，以纳米化制品中的IGF-I计，给药的剂量为0. 001 100mg/kg患者体重，优选为0. 01 lmg/kg，优选为0. 02 0. lmg/kg.给药形式可以根据 各种药物制剂的剂型来确定，适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮 下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式，优选使用口喷剂或胶囊剂口服给药。
在本发明第二和第三方面的应用中，本发明的纳米化制品可以单独作为药品、保 健食品和/或化妆品使用，也可以添加到其他药品、保健食品和/或化妆品中使用。例如， 本发明的纳米化制品可以添加到常规的饮料、食品或化妆品中配合应用。
在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的纳米化制品的制备方法。该制备方 法可以包括以下两个步骤首先从鹿茸中提取富含IGF-I的提取物；然后将上述提取物制 备成纳米化制品。该制备方法优选包括下列步骤
a)用水浸提粉碎的鹿茸，分离出分子量为50(T500000Da的水溶性提取物，冷冻干 燥；
和b)用可生物降解的聚合物将步骤a)所得的提取物包裹成纳米囊球。
其中，步骤a)中粉碎鹿茸的步骤可包括切片、勻浆、超声波破碎等方式中的一种 或几种。“切片”指的是将鹿茸制成薄片，优选使用切片机将新鲜鹿茸或冷藏的新鲜鹿茸切 成厚度为广5mm的薄片。“勻浆”指的是将鹿茸粉碎至没有大的组织块为止，勻浆过程中可 以加入适量的去离子水。经过超声波破碎，能充分使细胞破裂，该破碎过程中可以加入适量 的去离子水。粉碎鹿茸的步骤优选按次序包括切片、勻浆和超声波破碎步骤，也可以省略其 中的切片步骤。粉碎鹿茸的全过程最好在低温环境中操作，其中使用的试剂也最好是低温 预冷的，低温环境指在(T20°C的环境，优选(Tl(TC的环境，最好在4°C。步骤a)中用水浸 提粉碎的鹿茸的步骤可以与粉碎鹿茸的步骤同时完成，即通过在切片、勻浆和/或超声波 破碎等步骤中加入的水来浸提鹿茸的有效成分，如IGF-I，浸提随着粉碎步骤的完成而自然 完成；也可以在粉碎鹿茸的步骤后再进一步放置一段时间进行浸提，所述时间如不超过36 小时，优选放置24小时，最好能够放置在低温环境中。步骤a)中将水溶性提取物分离出来 的步骤可以通过常规的离心和/或过滤等方式来进行，如超离心和/或超滤等。该步骤中 优选提取分子量为50(T500000Da的成分，更有选提取分子量为lOOiTlOOOOODa的成分，最 优选提取分子量为lOOCTlOOOODa的成分。在一个具体实施方式
，本发明先通过离心去除水 浸提产物中的沉淀，然后选用合适的超滤膜截留相应分子量的成分，再加入适当量的水溶 解。然后进行冷冻干燥，如使用冷冻干燥机将上步所得的溶有相应分子量的成分的水溶液 以-30°C -50°C的干燥机工作温度来进行干燥，干燥后产品的含水量为3% -10%。
在步骤b)中，将步骤a)所得的最终产物进行纳米化，其可以采用超音速射流法或 聚合物包裹法来制备纳米级的颗粒或囊球。“超音速射流法”是指使用超音速射流设备(如 可购自北京纳诺生物科技有限公司)将鹿茸提取物形成高速喷射流，并使多股喷射流在粉 碎区高速互相交汇，产生高速碰撞和研磨，从而形成纳米级的颗粒。本发明优选采用聚合物包裹鹿茸提取物的方式形成纳米级的囊球。其合适的聚合物有用单体合成的聚合物和脂肪 族类聚酯类聚合物。用单体合成的聚合物的单体实例有丙烯酰胺、丙烯酸酯和氰基丙烯酸 烷基酯及它们的衍生物。制备纳米级囊球的步骤包括将鹿茸提取物与单体一起加入含有乳 化剂(如葡聚糖、聚山梨酸酯等)的酸性水介质中，加入聚合引发剂(通常是阴离子，如OH—) 引发单体的聚合反应，使得鹿茸提取物在聚合反应过程中包埋进纳米级囊球中。由于单体 多为人工合成，该类许多聚合物不能为生物降解，因此本发明的制品优选包含具有良好的 可生物降解的脂肪族类聚酯类聚合物，由此形成纳米级的囊球。这类聚合物的实例有聚乳 酸(PLA)、聚乙交酯(PLG)、聚乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、多聚氨基酸及 它们的衍生物等，其他优选的实例是一些天然高分子聚合物及它们的衍生物，可选的天然 高分子聚合物有白蛋白、壳聚糖、葡聚糖、海藻酸盐等，它们具有良好的可生物降解聚乳酸， 分散后可形成纳米囊球包裹活性成分。这类聚合物可以采用后分散法包裹鹿茸提取物，具 体的实例有采用溶剂蒸发或自发乳化/溶剂扩散等方式进行包裹。溶剂蒸发法指，将聚合 物和鹿茸提取物溶于有机溶剂中，将有机溶剂加到含有乳化剂的水体系中进行乳化，然后 通过加温、减压或连续搅拌等方式把有机溶剂蒸发除去，形成聚合物纳米囊球的水分散体 系。自发乳化/溶剂扩散法指，用亲水性有机溶剂和疏水性有机溶剂形成的混合溶剂溶解 聚合物和鹿茸提取物，将其分散到水中，由于亲水性有机溶剂会自动从油相扩散到水相，从 而形成纳米囊球。在一个具体实施方式
中，本发明的制备方法中使用的聚合物为壳聚糖，即 使用壳聚糖包裹鹿茸提取物，形成粒径为10(T400nm的纳米囊球。在另一个具体实施方式
中，本发明的制备方法中使用的聚合物为多聚氨基酸，即使用多聚氨基酸包裹鹿茸提取物， 形成粒径为5(Tl50nm的纳米囊球。多聚氨基酸可以选自多聚赖氨酸和由亮氨酸和谷氨酸 组成的聚氨基酸。
本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容 均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指 出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论 述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
本发明的实施例
实施例1，鹿茸有效成分的提取
取新鲜鹿茸0. 5kg，用冷冻切片机将鹿茸切成厚度为广2mm的切片，然后加入适量 (200mL)预冷的去离子水在4°C用勻浆机进行粉碎，勻浆操作进行至勻浆中没有大的组织 块时结束。然后向初步粉碎的产物中加入IL预冷的去离子水，混勻后在冰浴条件下进行超 声波破碎。然后将该破碎后的悬浊液以5000转/分钟(rpm)离心20分钟，留上清液待用。 离心后的沉淀物加入IL预冷的去离子水，震荡均勻后在冰浴条件下进行超声波破碎，然后 再以5000转/分钟离心20分钟，留上清液待用。离心后的沉淀物再重复上述步骤，加入水、 超声波处理、离心后，留上清液待用。将以上步骤中获得的3份上清液混合在一起，接着进 行2次超滤。首次超滤用截留分子量为IOOOOODa的超滤膜(购自Millopore，Ultrapore)， 保留滤出液。然后将滤出液用截留分子量为IOOODa(购自Millopore，Ultrapore)的超滤 膜进行超滤，弃去滤出液。用200mL预冷的去离子水溶出超滤膜截留的物质，保留溶出液待 用。将经过第一次溶出步骤的超滤膜再用200mL预冷的去离子水溶出，弃去超滤膜，合并所得的两次溶出液。使用冷冻干燥机在-3(T-5(TC冷冻干燥溶出液，得干燥后的粗产品22克， 其中该粗产品的含水量不超过8 %。
用IGF-1ELISA检测试剂盒(购自美国R&D Systems公司，产品目录号DG100)来 检测以上提取过程得到的粗产品中的IGF-I含量。精确称取IOmg粗产品，溶于Iml去离子 水中，根据厂商的试剂盒操作说明书检测，从标准IGF-I检测曲线上读出含量，上述每克粗 产品中IGF-I的含量为2384纳克(ng)。
实施例2，鹿茸有效成分的提取
使用与实施例1相似的步骤进行提取。所用步骤与实施例1不同的地方主要在于 使用冷藏于-20°C的鹿茸；以及在冰浴条件下进行超声波破碎后，静止放置悬浊液24小时， 以充分溶出活性成分。具体过程如下新鲜鹿茸采集后冷藏于-20°C冰箱10天，取该鹿茸 0. 5kg，用冷冻切片机将鹿茸切成厚度为广2mm的切片，然后加入适量水在4°C用勻浆机进 行粉碎。然后向初步粉碎的产物加入IL预冷的去离子水，混勻后在冰浴条件下进行超声波 破碎。然后将该破碎后的悬浊液静止放置24小时，以充分溶出活性物质。接着，将悬浊液 以5000转/分钟(rpm)离心20分钟，留上清液待用。离心后的沉淀物加入IL预冷的去离 子水，震荡均勻后再以5000转/分钟离心20分钟，留上清液待用。离心后的沉淀物再重复 上述步骤，加入水、混勻、离心后，留上清液待用。将以上步骤中获得的3份上清液混合在一 起，接着进行2次超滤。首次超滤用截留分子量为IOOOOODa的超滤膜，保留滤出液。然后 将滤出液用截留分子量为IOOODa的超滤膜进行超滤，弃去滤出液。用200mL预冷的去离 子水溶出超滤膜截留的物质，保留溶出液待用。将经过第一次溶出步骤的超滤膜再用200mL 预冷的去离子水溶出，弃去超滤膜，合并所得的两次溶出液。使用冷冻干燥机在-3(T-5(TC 冷冻干燥溶出液，得干燥后的粗产品24克，其中该粗产品的含水量不超过8%。
用IGF-1ELISA检测试剂盒来检测以上提取过程得到的粗产品中的IGF-1含量，测 得上述每克粗产品中IGF-I的含量为1832ng。
实施例3，鹿茸有效成分的提取
使用与实施例1相同的步骤将新鲜鹿茸0. 5kg切片、超声波破碎，然后进行2次 超滤。首次超滤用截留分子量为IOOOODa(购自Millopore，Ultrapore)的超滤膜，保留滤 出液。然后将滤出液用截留分子量为IOOODa的超滤膜进行超滤，弃去滤出液。用200mL 预冷的去离子水溶出超滤膜截留的物质，保留溶出液待用。将经过第一次溶出步骤的超滤 膜再用200mL预冷的去离子水溶出，弃去超滤膜，合并所得的两次溶出液。使用冷冻干燥 机在-3(T-5(TC冷冻干燥溶出液，得干燥后的粗产品10克，其中该粗产品的含水量不超过 8%。
用IGF-1ELISA检测试剂盒来检测以上提取过程得到的粗产品中的IGF-1含量，测 得上述每克粗产品中IGF-I的含量为4315ng。
实施例4，用壳聚糖制备纳米化鹿茸制品
取平均相对分子量为45000的壳聚糖(购自浙江大学)120mg和上述实施例制得 的粗产品5mg，将它们溶解于12mL 醋酸溶液。然后将该壳聚糖醋酸溶液缓慢滴加到 150mL含20%乙醇的司盘85溶液(购自上海化学试剂公司)中，于40°C减压抽去水分。然 后将获得产物以5000rpm离心20分钟，弃去上清液，沉淀用石油醚洗涤2次。然后向沉淀 加入20毫升水，以超声波处理，即得壳聚糖包裹的纳米囊球悬液。将上述壳聚糖包裹的纳米囊球悬液加水稀释20倍，取适量于铜网上，用2%磷钨酸钠进行负染，然后利用透射电子 显微镜进行观察，所得的纳米囊球的粒径大小为10(T400nm。重复以上制备过程制备，但其 中不加入鹿茸粗产品，由此制得空白纳米囊球悬液作为空白对照。
用IGF-1ELISA检测试剂盒来检测以上纳米化鹿茸制品的包封率。将适量纳米囊 球悬液等分成2份(每份样品中的IGF-I的投药量计为W0)，其中一份用IGF-1ELISA检测 试剂盒检测游离的和吸附在纳米颗粒表面的IGF-I的量(Wl)；另一份用0. 5U/mL壳聚糖酶 (购自日本化学工业公司)酶解6小时，然后再用IGF-1ELISA检测试剂盒检测IGF-I的量 (W2)。根据包封率=(W2-W1)/W0*100%的公式，测得的上述产品的包封率为68%。
实施例5，用多聚氨基酸制备纳米化鹿茸制品
将上述实施例制得的粗产品IOmg溶于12mL pH7. 4的PBS (其中含有0. Olmol/ L磷酸盐、0. 138mol/L NaCl和0. 0027mol/L KCl)中。取平均相对分子量为23000的聚 Leu/Glu-50/50 (购自中国科学院过程工程研究所，其中含50%的亮氨酸和50%的谷氨 酸)50mg，将其分散在上述PBS溶液中，自动形成含有纳米囊球的胶体分散液(聚氨基酸包 裹的纳米化鹿茸制品)。该液体能够散射光现，而且置于15°C 3小时后未出现沉淀。取上 述聚氨基酸包裹的纳米化鹿茸制品，利用透射电子显微镜进行观察，所得的纳米囊球的粒 径大小为5(Tl50nm。
实施例6，纳米化鹿茸制品中的IGF-I活性测定
用实施例4制备的纳米囊球悬液和空白对照分别刺激96孔板培养的Balb_3T3细 胞的增殖。用鼠尾胶原包被96孔培养板，用DMEM稀释后置冰上待用。30分钟后，向板孔中 分别加入50yL纳米囊球悬液和空白对照，置孵育箱内平衡60分钟。接着加入50yL MTT, 在37°C孵育4小时。然后加100 μ L DMS0，温浴1小时。由于活细胞可将四唑盐转化成可被 DMSO溶解的有色产物，其产量与活细胞数量成正比，因此用酶标仪在570nm下测吸光度，即 可估算活细胞数。相对于空白对照，使用本发明的纳米化鹿茸制品能够显著提高Balb-3T3 细胞的增殖率。
实施例7，纳米化鹿茸制品中的IGF-I抗酶降解活性测定
用实施例4制备的纳米囊球悬液、胰酶处理过的纳米囊球悬液和空白对照分别刺 激96孔板培养的Balb-3T3细胞的增殖。其中，用胰酶37°C处理2小时，制备得胰酶处理过 的纳米囊球悬液。用与实施例6相同的实验步骤检测细胞的增殖效应，测定吸光度。由此 测得的上述产品经酶降解后IGF-I的活性相对于未经酶降解的，仍旧保持81%的活性。
权利要求
一种由鹿茸提取物制成的纳米化制品，其中纳米囊球的粒径为100～400nm，其中含有壳聚糖，而且所述提取物中胰岛素样生长因子-1的含量为1000～6000ng/克；而且所述纳米化制品由包括下列步骤的制备方法制成a)用水浸提粉碎的鹿茸，分离出分子量为500～500000Da的水溶性提取物，冷冻干燥；和b)用壳聚糖将步骤a)所得的提取物包裹成纳米囊球。
2.根据权利要求
1的纳米化制品，其中而且所述提取物中胰岛素样生长因子-1的含量 为 1500 4500ng/ 克。
3.一种由鹿茸提取物制成的纳米化制品，其中纳米囊球的粒径为50 150nm，其中含 有多聚氨基酸，而且所述提取物中胰岛素样生长因子-1的含量为1000 6000ng/克；而且 所述纳米化制品由包括下列步骤的制备方法制成a)用水浸提粉碎的鹿茸，分离出分子量为500 500000Da的水溶性提取物，冷冻干燥；和b)用多聚氨基酸将步骤a)所得的提取物包裹成纳米囊球。
4.根据权利要求
3的纳米化制品，其中而且所述提取物中胰岛素样生长因子-1的含量 为 1500 4500ng/ 克。
5.根据权利要求
1-2之任一的纳米化制品，其为口喷剂、胶囊剂或注射剂。
6.根据权利要求
3-4之任一的纳米化制品，其为口喷剂、胶囊剂或注射剂。
7.权利要求
1-6之任一的纳米化制品在制备促进细胞增殖的药品、保健食品和/或化 妆品中的应用。
8.权利要求
1-6之任一的纳米化制品在制备治疗和/或预防碳水化合物代谢调节紊乱 的药品和/或保健食品中的应用。
9.权利要求
1-6之任一的纳米化制品在制备治疗和/或预防糖尿病的药品和/或保健 食品中的应用。
专利摘要
本发明涉及一种由富含胰岛素样生长因子(IGF-1)的鹿茸提取物制成的纳米化制品，其中所述提取物中IGF-1的含量为100~10000纳克/克，而且所述制品中的纳米囊球的粒径为10~1000纳米。另外，本发明还涉及制备该鹿茸纳米化制品的方法，以及该制品在药品、食品、保健品和化妆品等方面的应用。
文档编号A61K38/30GKCN101068556 B发布类型授权 专利申请号CN 200680001262
公开日2010年11月10日 申请日期2006年4月28日
发明者王利忠 申请人:王利忠导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),