专利名称:一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明属于生物技术与组织工程领域，特别涉及一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法。
背景技术：
种子细胞是组织工程最基本的原材料，将少量的细胞经培养、扩增并种植于细胞外基质上形成具有一定结构和功能的组织，是组织工程研究中最重要的环节。但大多数组织细胞的来源有限，分离困难，限制了组织工程研究的进展。
骨髓间充质干细胞体外取材容易，能高度自我增殖与更新。它不仅具有向成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、网状细胞等多个方向分化的潜能(Pittenger MF et al.，Science，1999，284(1))，而且在机体受到外伤、老化、疾病等损伤时，这些细胞就会增殖分化，产生新的组织来替代它们，以保持机体的稳态平衡。骨髓间充质干细胞还具有支持造血的重要功能(Ueda Tet al.，J Clin Invest，2000，1051013-1021)，与造血干细胞共同移植能够加速患者造血功能的恢复与重建(Almeida-Porada G et al.，Blood 2000，953620-3627；Noort WA et al.，Exp Hematol 2002，30870-878；Angelopoulou M，et al.，ExpHematol 2003，31413-420)，对临床上攻克造血干细胞移植治疗的难题具有重大意义。另外，骨髓间充质干细胞植入反应较弱，易于被外源基因转染并稳定表达，被认为是组织工程、细胞及基因治疗中理想的靶细胞(Suzanne Kadereit，Adult Stem Cells(PhD)，International Society for Stem Cell Research)。特别是某些发育过程带有遗传缺陷的疾病，往往治疗难度极大，如某些肌营养不良、骨发育不良等，从正常供体中分离骨髓间充质干细胞或经过体外诱导分化，然后植入患病受体，则有望改善受体相关组织的功能。因此，骨髓间充质干细胞正作为一种新型的种子细胞，受到广泛的关注和重视。
目前有关骨髓间充质干细胞的培养与扩增主要有静态和动态两种方法。静态主要包括单层平皿培养法(Friedenstein AJ et al.，Cell Tissue Kinet，1987，20(3))以及在培养板内采用I型胶原(Kiyoshi Yoneno et al.，Journal of Biomedicalmaterials Research Part A，2005，75A(3))、或I型胶原与琼脂糖复合物(AnnaBatorsky et al.，Biotechnology and Bioengineering，2005，92(4))、纤维蛋白复合物(Shimony N et al.，Kidney International，2006，69(3))或海藻酸盐(Markusen JF，etal.，Tissue Engineering，2006，12(4))等凝胶做为载体的三维培养法；动态培养主要是利用微载体在生物反应器内(Qin Q et al.，Tissue Engineering，1998，4(1)；Glowacki J et al.，Cell Transplant，1998，7(3))进行三维培养，或将骨髓间充质干细胞与造血干细胞在旋转壁式生物反应器内(Xi Chen et al.，Stem Cells，2006，published online May25)进行三维共培养。
静态培养易于操作与控制，但单层培养时单位面积内细胞扩增数量有限，无法满足临床需要种子细胞数量巨大的要求；三维培养得到的细胞扩增倍数虽然比单层培养的有所增加，尤其是I型胶原本身就是一种细胞外基质，作为组织支持物，与细胞的生长、分化、增生以及组织损伤的修复等密切相关，非常有利于细胞的增殖。但由于营养物质在静态条件下受到传质阻力的影响，附着在载体内部的细胞会因得不到足够的养分而凋亡，不能最大限度地发挥培养体系的功能，造成资源浪费。
动态三维培养体系可为细胞提供更近于体内的三维立体环境，细胞无论是在微载体上还是在旋转壁式培养体系内都可以克服接触抑制，形成多层生长，细胞扩增数量明显增加。但附着在微载体表面的种子细胞，会因剪切力以及微载体间的相互碰撞而受到损伤，加之微载体对培养液成分及代谢产物的吸附，容易造成细胞聚集，引起细胞分化(Yoo JU et al.，J Bone Joint Surg Am，1998，80(12)；Johnstone B et al.，Clin Orthop，1999，(367 Suppl)S156)，降低了种子细胞的质量。旋转壁式培养体系虽然剪切力较低，减少了剪切力对细胞造成的损伤，但存在一定的浓度梯度，养分的供给不均匀。因此，需要发展适宜的三维动态培养体系，来改善培养环境以培养出数量和质量均有保证的骨髓间充质干细胞。
发明内容本发明的目的是提供一种三维动态条件下培养与扩增骨髓间充质干细胞的方法。
本发明的技术方案包括以下步骤1.提供骨髓间充质干细胞。取四周龄体重2.5kg左右的新西兰大白兔，用3％戊巴比妥钠按1mL·kg-1静脉注射麻醉后，无菌条件下以骨髓穿刺针刺入兔股骨骨髓腔，接10mL注射器，内含3000U·mL-1的肝素0.5mL，抽出骨髓4-6mL，经低糖无血清DMEM稀释后，与比重为1.073g·mL-1的Percoll分离液按1∶1体积比进行梯度离心，3000rpm离心25min，缓慢吸取中间交界面乳白色云雾状悬浮细胞至另一离心管中，以低糖无血清DMEM洗涤两次，1200rpm离心5min。去上清，加入含20％胎牛血清的DMEM培养基，调整细胞密度，以5×105cells·mL-1的密度接种于培养瓶中。三天后去除悬浮细胞，每五天半量换液。当原代兔骨髓间充质干细胞在培养瓶底达到80％融合时，加入含0.02％EDTA浓度为0.25％的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例进行传代培养。
2.准备中空纤维膜。将内径与外径分别为0.8mm与1.4mm、壁面孔径为0.1μm的亲水性聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维膜反复清洗后，121℃灭菌30min，待用。
3.I型胶原凝胶包埋骨髓间充质干细胞。将含有3ng·mL-1bFGF浓度为3mg·mL-1的I型胶原溶液加入一定细胞数量的兔骨髓间充质干细胞悬液中，调整细胞密度为5×105cells·mL-1，接种于聚偏氟乙烯中空纤维膜内，置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内2小时后在膜内形成含有细胞的凝胶。
4.准备气升式环流生物反应器。实验之前，用清洗剂及软刷清洗气升式环流生物反应器(air-lift loop bioreactor，ALB)的各个部件后，超纯水冲洗三遍。装配好ALB的主体部分，将主体部分及连接好的管路包裹好，121℃灭菌30min，烘干备用。
5.在气升式环流生物反应器中，三维动态培养骨髓间充质干细胞。在超净台中无菌条件下组装ALB细胞培养系统，将包埋骨髓间充质干细胞的I型胶原凝胶膜组件接种至反应器内，加入含20％胎牛血清、3ng·mL-1bFGF的DMEM培养基，然后将ALB细胞培养系统置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内，打开气泵2开关，调节气体流量，使培养液在环流生物反应器内充分循环起来。
6.酶解凝胶，收获骨髓间充质干细胞。培养结束后，取出包埋骨髓间充质干细胞的I型胶原凝胶膜组件，将中空纤维膜置入离心管内，加入浓度为2.5％的I型胶原酶，37℃下酶解20min，1200rpm离心5min，弃上清，加入1mL培养液，吹打，计细胞数，接种至培养瓶中培养。
本发明的效果和优点是(1)能够使骨髓间充质干细胞在三维条件下进行动态培养，有效降低培养体系的传质阻力，使细胞具有充足的养分供应，细胞扩增数量明显增加。
(2)支架材料I型胶原凝胶为细胞提供更近于体内的三维立体环境，促进了细胞之间的联系，使细胞在凝胶中形成多层生长。
(3)细胞在中空纤维膜内的凝胶中生长，完全避开了膜外流体剪切力的作用，并避免了细胞相互之间的碰撞，从而避免了普通气升式环流反应器对细胞所带来的损伤，这对于干细胞培养尤为重要。
(4)利用本发明一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法，对中空纤维膜内I型胶原凝胶包埋的兔骨髓间充质干细胞进行了三维动态培养。结果表明，细胞在此培养体系中生长良好，七天后单个核细胞、CD44+CD45-细胞的扩增倍数分别可达20倍和31倍。
图1是本发明所述的一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法操作流程图。
图2是本发明所述的一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的中空纤维膜结构扫描电镜图。
图3是本发明所述的一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法的气升式环流培养体系的工艺流程图。
图4是本发明所述的一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法，I型胶原凝胶包埋兔骨髓间充质干细胞的显微照片。
图5是本发明所述的一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法，静态条件下兔骨髓间充质干细胞在I型胶原凝胶中培养的显微照片(ADay1；BDay7)。
图中1.CO2培养箱；2.气泵；3.转子流量计；4.气体过滤膜；5.中空纤维膜组件；6.消泡填料；7.支架。
具体实施方式以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。
实施例1本实施例为静态条件下兔骨髓间充质于细胞在I型胶原凝胶中的培养。
为了验证细胞可以在I型胶原凝胶中良好生长，采用I型胶原凝胶包埋兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养与扩增。具体地，将细胞数为10×105cells的兔骨髓间充质干细胞与含3ng·mL-1bFGF浓度为3mg·mL-1的I型胶原溶液1mL混合均匀，接种至96孔培养板中，每孔50μL。置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内2小时形成含有细胞的凝胶，加入含20％胎牛血清、3ng·mL-1bFGF的DMEM培养液100μL，此时细胞在每孔的密度为5×105cells·mL-1，置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养。另取一份同样细胞密度的骨髓间充质干细胞悬液直接接种至培养瓶中作为对照组进行静态培养。
培养7天以后，将包埋骨髓间充质干细胞的I型胶原凝胶用2.5％的I型胶原酶37℃下酶解20min，1200rpm离心5min，弃上清，加入1mL培养液，吹打，计数，分别向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞方向诱导；流式细胞仪检测CD44+CD45-细胞数。同时收获对照组的骨髓间充质干细胞，消化，吹打，计数，分别向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞诱导；流式细胞仪检测CD44+CD45-细胞数。
以上实验均重复三次。
实验结果培养7天后，对照组细胞密度达15×105cells·mL-1，扩增倍数为3倍；I型胶原凝胶包埋组细胞密度达35×105cells·mL-1，扩增倍数为7倍。诱导分化结果显示，实验组与对照组所得到的细胞都能够向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞分化；流式细胞仪检测结果发现实验组与对照组CD44+CD45-细胞百分含量均超过70％，为骨髓间充质干细胞。图4为静态条件下兔骨髓间充质干细胞在I型胶原凝胶中培养的显微照片(ADay1；BDay7)。
此实施例说明骨髓间充质干细胞在I型胶原凝胶中能够良好生长；静态培养条件下，I型胶原凝胶中培养的细胞扩增倍数明显多于普通培养的细胞，同时验证了I型胶原凝胶的传质性能良好；由于动物细胞尤其干细胞对剪切力十分敏感，提示在避免剪切力损伤的情况下，采用I型胶原凝胶动态培养的细胞可能会增殖更多。
实施例2本实施例为I型胶原凝胶包埋兔骨髓间充质干细胞酶解胶原时细胞的收获率。
采用3mg·mL-1的I型胶原凝胶包埋兔骨髓间充质干细胞，通过I型胶原酶酶解I型胶原来确定细胞的收获率。具体地，将细胞数为25×105cells兔骨髓间充质干细胞与0.5mL浓度为3mg·mL-1的I型胶原溶液混合均匀，接种至96孔板中，每孔50μL，置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内2小时形成含有细胞的凝胶。加入2.5％的I型胶原酶37℃下酶解20min，1200rpm离心5min，弃上清，加入1mL培养液，吹打，计数，计算细胞收获率。
以上实验重复三次。
实验结果三次实验所得细胞收获率分别为88.7％，94.2％，90.4％，平均收获率达到91.1％。此实施例说明采用I型胶原酶酶解I型胶原收获细胞的方法是可行的；在细胞培养后，可以通过该方法收获大部分扩增的细胞。图5为3mg·mL-1的I型胶原凝胶包埋兔骨髓间充质干细胞的显微照片。
实施例3本实施例为中空纤维膜内I型胶原凝胶包埋兔骨髓间充质干细胞在气升式环流生物反应器内的培养。
为了验证ALB细胞培养系统能够成功地培养干细胞，本实施例将中空纤维膜内I型胶原凝胶包埋的兔骨髓间充质干细胞在ALB培养系统内进行培养。
兔骨髓间充质干细胞的分离取四周龄体重2.5kg左右的新西兰大白兔，用3％戊巴比妥钠按1mL·kg-1静脉注射麻醉后，在无菌操作下以骨髓穿刺针刺入兔股骨骨髓腔，接10mL注射器，内含3000U·mL-1的肝素0.5mL，抽出骨髓4-6mL，经低糖无血清DMEM稀释后，与比重为1.073g·mL-1的Percoll分离液按1∶1体积比进行梯度离心，3000rpm离心25min，缓慢吸取中间交界面乳白色云雾状悬浮细胞至另一离心管中，以低糖无血清DMEM洗涤两次，1200rpm离心5min。去上清，加入含20％胎牛血清的DMEM培养基，调整细胞密度，以5×105cells·mL-1的密度接种于培养瓶中。三天后去除悬浮细胞，每五天半量换液。当原代兔骨髓间充质干细胞在培养瓶底达到80％融合时，加入含0.02％EDTA浓度为0.25％的胰酶消化，按1∶3的比例进行传代培养。
实验前中空纤维膜的准备将内径与外径分别为0.8mm与1.4mm的亲水性聚偏氟乙烯中空纤维膜反复清洗后，121℃灭菌30min，待用。
I型胶原凝胶包埋兔骨髓间充质干细胞将含有3ng·mL-1bFGF浓度为3mg·mL-1的I型胶原溶液加入一定细胞数量的兔骨髓间充质干细胞悬液中，调整细胞密度为5×105cells·mL-1，接种于聚偏氟乙烯中空纤维膜内，置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内2小时后在膜内形成含有细胞的凝胶。
实验前气升式环流生物反应器的准备实验之前，用清洗剂及软刷清洗ALB的各个部件后，超纯水冲洗三遍。装配好ALB的主体部分，将主体部分及连接好的管路包裹好，121℃灭菌30min，烘干备用。
骨髓间充质干细胞在气升式环流生物反应器内的培养在超净台中无菌条件下组装ALB细胞培养系统，将包埋骨髓间充质干细胞的I型胶原凝胶膜组件接种至反应器内，加入含20％胎牛血清、3ng·mL-1bFGF的DMEM培养基，然后将ALB细胞培养系统置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内，打开气泵开关，调节气体流量，使培养液在环流生物反应器内充分循环起来。
培养7天后，取出包埋骨髓间充质干细胞的I型胶原凝胶膜组件，将中空纤维膜置入离心管内，加入浓度为2.5％的I型胶原酶，37℃下酶解20min，1200rpm离心5min，弃上清，加入1mL培养液，吹打，计数，分别向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞诱导；流式细胞仪检测CD44+CD45-细胞数。
培养结果中空纤维膜内I型胶原凝胶包埋的兔骨髓间充质干细胞在气升式环流生物反应器内培养7天后，单个核细胞扩增了20倍，CD44+CD45-细胞扩增了30多倍，并且能诱导分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞。
此实施例说明气升式环流生物反应器能够有效降低培养体系的传质阻力，使细胞具有充足的养分供应；I型胶原作为细胞外基质为骨髓间充质干细胞提供了优良的三维立体生长环境，促进了细胞之间的联系，使细胞形成多层生长，细胞扩增数量明显增加；细胞在中空纤维膜内的凝胶中生长，完全避开了膜外流体剪切力的作用，并避免了细胞相互之间的碰撞，从而避免了普通气升式环流反应器对细胞所带来的损伤，提高了细胞的培养效果。使用此反应器体外培养与扩增目的细胞是可行的。
尽管本发明是以中空纤维膜内I型胶原凝胶包埋兔骨髓间充质干细胞为例来描述的，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述，其它种类的细胞、凝胶、中空纤维膜以及实施例的其它变形，对于本领域技术人员都是可以预料的。因此，这样的变形不会脱离所属权利要求
限定的范围及精神。
权利要求
1.一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于以下步骤(1)提供骨髓间充质干细胞兔股骨来源的骨髓间充质干细胞以5×105cells·mL-1的密度接种于含20％胎牛血清的DMEM培养基中培养，当细胞在培养瓶底达80％融合时，加入含0.02％EDTA浓度为0.25％的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例进行常规传代培养；(2)准备中空纤维膜将内径与外径分别为0.8mm与1.4mm的亲水性聚偏氟乙烯中空纤维膜反复清洗后，121℃灭菌30min；(3)I型胶原凝胶包埋骨髓间充质干细胞将含有3ng·mL-1bFGF浓度为3mg·mL-1的I型胶原溶液加入一定细胞数量的兔骨髓间充质干细胞悬液中，调整细胞密度为5×105cells·mL-1，接种于聚偏氟乙烯中空纤维膜内，置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内2小时，在膜内形成含有细胞的凝胶；(4)准备气升式环流生物反应器用清洗剂及软刷清洗气升式环流生物反应器的各个部件，超纯水冲洗三遍；装配好反应器的主体部分，将主体部分及连接好的管路包裹好，121℃灭菌30min，烘干；(5)在气升式环流生物反应器中，三维动态培养骨髓间充质干细胞将包埋骨髓间充质干细胞的I型胶原凝胶膜组件接种至气升式环流生物反应器内，加入含20％胎牛血清、3ng·mL-1bFGF的DMEM培养基，置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内，打开气泵开关，调节气体流量，使培养液在环流生物反应器内充分循环起来；(6)酶解凝胶，收获骨髓间充质干细胞采用浓度为2.5％的I型胶原酶37℃下酶解I型胶原凝胶20min，1200rpm离心5min，收获骨髓间充质干细胞。
专利摘要
一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法，属于生物技术与组织工程领域，特别涉及一种三维条件下动态扩增干细胞的技术。其特征是在中空纤维膜内用I型胶原凝胶包埋骨髓间充质干细胞，然后将此细胞在气升式环流生物反应器中进行培养，收获骨髓间充质干细胞。本发明的效果和益处是，I型胶原凝胶为骨髓间充质干细胞提供了优良的三维立体生长环境，促进了细胞之间的联系，使细胞形成多层生长；中空纤维膜可使细胞避免受到流体剪切力的作用及相互之间的碰撞，从而消除流体流动所带来的损伤；气升式环流生物反应器能够有效降低培养体系的传质阻力，使细胞具有充足的养分供应，有利于骨髓间充质干细胞的扩增。
文档编号A61L27/48GK1994478SQ200610135028
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月21日
发明者刘天庆, 李香琴, 崔占峰, 朱琳 申请人:大连理工大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan