口蹄疫合成疫苗的制备方法

专利名称:口蹄疫合成疫苗的制备方法
口蹄疫(FMD)是一种引起偶蹄动物衰弱、具有高度传染性的疾病。病原体-口蹄疫病毒(FMDV)是一种属于细小核糖核酸病毒簇的小型动物病毒。它有一条约8000核苷酸组成的正向RNA单链基因组。
过去，用灭活病毒或减毒活病毒已经生产FMD疫苗。这些方法，虽然一般是有效的，但也不是没有问题的。偶尔因病毒灭活不完全或减毒不够可能引起FMD发生。合成的FMDV疫苗将免除生产过程中处理病毒的各种问题，因此用此疫苗作为一种最理想的代替方法是可以理解的。〔D.Rowlands，Endeavor 8(3)，123-127(1984)〕。
近几年已经对FMDV进行了研究。细小核糖核酸病毒含有四种外壳蛋白，命名为VP1、VP2、VP3和VP4。这些VP蛋白的实际名称服从于不同的衡量标准。本发明范围内所涉及的有关蛋白已经被一些研究组称之为VP3〔见，如，Kleid等，Seience 214，1125(1981)〕而被另一些研究组定为VP1〔见如，Clarke等，FEBS Letters 157，261(1983)〕。为了现时目的，这一蛋白质称为VP1。
VP1已经成为相当多的研究和结构分析的题目，已经发现它能产生猪的中和抗体反应，〔J.Laporte，J.Groselaude，J.Wantyghem，S.Bernard，P.Rouze，C.R.Acad.Sci.276，3399(1973)〕并且使猪和牲畜都不受FMDV感染〔H.L.Bachrach，D.M.Moore，P.D.Mckercher，J.Polatnick.J Immuno
115，1636(1975)〕。已报导TrpLE和VP1的生物合成融合多肽经多次接种可以保护猪和牲畜防止接触病毒而发病〔D.G.Kleid，D.yansura，B.Small，D.Dowbenko，D.Moore，M.Grubman，P.Mckcrcher，D.O.Morgan，E.V.Robertson，H.L.Bachrach，Scieuce 214，1125-1129(1981)〕。
Strohmaier等，J.Gen.Virol.59，295-306(1982)，用化学和酶的方法消化VP1，得出结论为能产生中和抗体的主要免疫原区位于氨基酸序列的146-154和201-213。
Bittle等，Nature 298，30-33(1982)用化学方法合成了相当于FMDV VP1多肽的141-160和200-213区域的肽类，并且在豚鼠和家兔上证实了这些肽类能产生高水平中和抗体的能力。在PCT International Patent Application NO.WO 83 03，547，(1983年10月27日发表)中也有这方面的工作报告。
纵观以前进行的有关小肽序列的全部工作，主题是信心并发现这些小肽序列如果存在免疫原性只是在把它们连到一高分子量载体上而获得的。最常用的载体是锁眼帽贝血兰香白(KLH)。
PCT Application NO.WO 83 03，547提出单体、非环状的小肽不能产生足够中和指数以获得对病毒的抵抗。刊物特别申明需要约1.5或更大的中和指数才能使动物抵抗这种病毒，并指出单体未结合的肽的中和指数接近0.5，这种肽具有实质上相当于O1K FMDV约141-160位上氨基酸残基序列。已报告当同一肽与KLH结合后中和指数约3.7到3.9，这一结果可以与上一结果相比较。
一类新的未结合的单体小肽已被发现。不用任何载体，这些肽类能产生一种出乎意外的、显著增强的抗FMDV的中和反应。这些肽类能产生一种出乎意外的、显著增强的抗FMDV的中和反应。这些肽类在牲畜上接种一次就产生前所未有的保护作用，重复免疫后可以完全得到保护。在目前的发现以前，要获得后一结果必须用比新发现肽类的体积约大五倍的抗原才能得到。
依据本发明，可提供一种含结构式(Ⅰ)序列的化合物X-A-Y-B-Z (Ⅰ)其中A和B是组成口蹄疫病毒VP1外壳蛋白血清型顺序的氨基酸残基序列，其中之一种含有从18到24个氨基酸残基并包括O血清型的141-158位氨基酸残基序列或其它血清型的相同序列，而另一个含有从14-20个氨基酸残基并包括O血清型200-213位氨基酸残基序列或其它血清型的相同序列;
X是H，H-半胱或H-半胱-半胱，它的巯基可能是封闭的或自由的;
Z是OH，半胱-OH，或脯-半胱-甘-OH，它的巯基也可以是封闭的或自由的;
Y是约2到6个氨基酸序列，或它们在制药上合格的盐。
根据注释，本发明目标指向按结构式(Ⅰ)合成的、具有免疫原性的肽类X-A-Y-B-Z (Ⅰ)基因A和B包括相当于O血清型、1亚型、Kaufbeuren株(O1K)FMDV的VP1外壳蛋白中存在的选择序列和在其它任何口蹄疫病毒血清型中存在的相同的同类序列。
已知存在7个血清型的FMDV。最普遍的是欧洲并带有A、B和C名称。余下的3个是南非，SAT-1，SAT-2和SAT-3，还有一个是亚洲，Asia-1。另外每个血清型已知有许多亚型和与亚型有关的株。具体的例子是O血清型，1亚型，Kaufbeuren株(O1K);O血清型，1亚型、Campos株(O1C);O血清型、1亚型、British Field Strain株(O1BFS);A血清型、10亚型、61株(A10，61);A血清型、12亚型、119株(A12，119);A血清型、24亚型(A27);A血清型、79亚型(A79);和C血清型、3亚型、Indaial株(C3I)。
O血清型141-158位和200-213位氨基酸残基序列代表本发明的肽的基因A和B定义的中心点。在任何具体例子中基团A包含一个序列，而基因B包含另一个序列。另外，在任何其它血清型和血清亚型中存在的类似又不是必须的同一序列也包括在基团A和B的定义内。在基团A和B的定义包括分别相当于O血清型141-158位和200-213位氨基酸序列的大于18和14个氨基酸残基长度的情况下，其余的残基可以是任何氨基酸。
为了便于说明，下面给出O1K 141-158序列和其它血清型和亚型的同类序列的例子141 150 158O1K 缬脯冬酰亮精甘冬亮谷酰缬亮丙谷酰赖缬丙精苏O1BFS 缬脯冬酰亮精甘冬亮谷酰缬亮丙谷酰赖缬丙精苏O1C 缬脯冬酰缬精甘冬亮谷酰缬亮丙谷酰赖缬丙精苏A10，61 丝-精丝-甘冬亮甘丝异亮丙丙精缬丙苏谷酰A12，119 丝甘-缬精甘冬苯丙甘丝亮丙脯精缬丙精谷酰A24C 丝甘-精精甘冬蛋甘苏亮丙丙精缬缬赖谷酰A27 谷酰-精丙甘冬蛋甘苏亮丙丙精缬丙赖谷酰A79 丝甘-精精甘冬蛋甘苏亮丙丙精缬丙赖谷酰C31 -精精甘冬亮缬组亮丙丙丙组丙精组下面是O1K200-213序列和其它血清型和亚型同类序列的例子200 213O1K 精组赖谷酰赖异亮缬丙脯缬赖谷酰苏亮O1BFS 精组赖谷酰赖异亮缬丙脯缬赖谷酰苏亮A10，61 精苏赖谷酰赖异亮异亮丙脯丙赖谷酰亮亮A12，119 精组赖谷酰赖异亮异亮丙脯甘赖谷酰-亮A24c 精组赖谷酰赖异亮异亮丙脯丙赖谷酰亮亮A31 精组赖谷酰脯亮异亮丙脯丙赖谷酰亮亮在本发明提供的这些肽类中，A或B基团中的一个包含141-158顺序，另一个是200-213位顺序。最好是A或B中一个是141-158的序列而另一个是200-213的序列。更合意的是基团A是200-213序列而基团B是141-158序列。本发明肽类的A和B基团是来自同一个FMDV血清型的肽序列最为合意。
基因x代表本发明肽类的氨基末端部分，x可代表氨基末端的氢或单半胱氨酰或双半胱氨酰的延长。如果x是单或双半胱氨酰，则半胱氨酸的硫氢可能是封闭的或游离的。很多为工艺熟练者所熟悉的封闭基团都能用。例如磺酸盐、羧甲基、羧氨基甲基、氨基乙基等等。然而最好x是氢。
基团Z定义为本发明肽类的羧基末端。这样Z是羟基或是含半胱氨酸的延伸，即半胱氨酸或脯-半胱-甘-OH三肽。再有，半胱氨酸可以是封闭的或游离的，如果是封闭的，可用任何前面所述的相同的封闭基团来封闭。
基团Y连接基团A和B，代表一个氨基酸残基或一个具有2至6个氨基酸残基的序列。最好Y是一个有2至4个氨基酸残基的序列。这序列可由多种氨基酸残基组成。脯氨酸是一种可选择的氨基酸残基，含脯-脯的序列更为可取。特别可取的序列是脯-脯-丝或亮-脯-脯-苏。
本发明所包含的化合物是药品上合格的酸及盐和药品上合格的羧酸盐。“药品上合格的盐”是指这些盐类可用于温血动物的化疗。
“药品上合格的酸及盐”一词包括有机和无机两类的酸及盐，例如包括那些从诸如盐酸、氢氟酸、硫酸、磺酸、酒石酸、延胡索酸、氢溴酸、羟基乙酸、柠檬酸、马来酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、苯甲酸、抗坏血酸、对-甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸，等等中制备的酸及盐。最好是从盐酸、乙酸或琥珀酸制备的酸及盐。以上的盐是用工艺上熟练者已知的常规方法制备的。
“羧酸盐”一词包括诸如氨、碱金属盐如钠、钾和锂等等。
为方便起见，有关的氨基酸用它们已批准的速记三个字母表示。
这些表示法如下3-字母丙氨酸 Ala精氨酸 Arg天门冬酰胺 Asn天门冬氨酸 Asp半胱氨酸 Cys谷氨酸 Glu谷氨酰胺 Gln甘氨酸 Gly组氨酸 His异亮氨酸 Ile亮氨酸 Leu
赖氨酸 Lys苯丙氨酸 Phe脯氨酸 Pro丝氨酸 Ser苏氨酸 Thr色氨酸 Trp酪氨酸 Tyr缬氨酸 Val本发明的化合物的实例是VP1(O1K) H〔(200-213)脯脯丝(141-158)〕脯半胱甘-OH;
VP1(O1K) H-半胱〔(200-213)脯脯丝(141-158)〕半胱-OH;
VP1(O1K) H-半胱半胱〔(200-213)脯脯丝(141-158)脯半胱甘-OH;
VP1(O1K) H〔(200-213)脯脯丝(141-158)〕OH;
VP1(O1BFS) H〔(141-158)脯脯(200-213)〕OH;
VP1(Al0，61) H〔(141-158)亮脯脯丝(200-213)〕OH;
VP1(A12，119) H-半胱〔(200-213)亮脯脯丝(141-158)〕OH;
VP1(A24C) H〔(200-213)缬脯脯苏精(141-158)〕OH;
VP1(O1C) H-半胱半胱(141-158)脯脯(200-213)〕半胱-OH;
VP1(C3I) H〔(200-213)脯脯丝(141-158)〕OH;
VP1(O1K) H-半胱-〔精酪冬酰精冬酰丙(141-158)〕亮脯脯苏〔谷酰丙(200-213)〕OH;等等。
本发明的化合物可以由各种已知的肽合成技术来制备，包括传统(溶解)方法、固相方法及最近使用的重组DNA方法。
制备本发明复合物的主要方法之一是固相技术，这一技术中氨基酸序列是从一不溶解的树脂支持的C-末端的起始氨基酸开始依次构建的。固相方法技术是J.Stewart等描述过的，多相肽的合成，Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，1984。
固相肽合成工艺情况的实例由R.D.Dimarchi，J.P.Tam，R.B.Merrifield报告中提供，Int.J.Pep.Prot.Res.19，270-279(1982);还有R.B.Merrifield，L.D.Vizioli，H.G.Boman，Biochem.21，5021-5031(1982);S.Mojsov，R.B.Merrifield，Eur.J.Biochem.145，601-605(1984)，这些方法在制备这些FMDV合成免疫原时可能被采用。最重要的特点如下1.利用聚合(苯乙烯-1%二乙烯苯)树脂，200-400筛孔珠，取自Bio-Rad实验室。
2.用Mitchell等方法(1978，见后)使树脂支持物转变为氨甲基树脂。
3.羧基末端的氨基酸通过(季一)t-丁酰-羰基-氨酰基-〔4-(羟甲基)苯基〕乙酸衍生物酰胺化到氨甲基树脂上。
4.保护氨基的t-丁酰-羰基(Boc)基团以50%TFA/CH2Cl2断开，并在5% DIEA/CH2Cl2中中和胺。
5.利用每个残基上的双偶联、除了天门冬酰胺、谷酰胺和精氨酸外，第一偶联是用予先形成的对称酐。第二偶联都是用予先形成的HOBt-酯。前面提到的例外是第一偶联与第二偶联相同。
6.通过在碳阳离子消除剂存在的情况下，把肽暴露于一种酸的方法从树脂支持物上切下肽。
7.最好利用下列侧链保护基团精氨酸(对甲苯磺酰)，天门冬氨酸(O-环戊基)，半胱氨酸(4-苄甲氧基)，谷氨酸(O-环戊基)，组氨酸(苄氧甲基)赖氨酸(2-氯-苄氧羰基)，丝氨酸(苄基)，苏氨酸(苄基)，色氨酸(甲酰基)和酪氨酸(2-溴苄氧羰基)。
更可取的肽与树脂的裂解条件包括在从-10℃到+15℃温度下，使肽-树脂暴露于无水氢氟酸。最好的碳阳离子消除剂是对-甲酚。
本发明的复合物也能通过重组DNA方法制备。制备时，编码所要的肽的核苷酸序列是用目前这类常规的合成方法制备的。这些方法一般包括制备所需的序列的片段和其互补序列两者的寡核苷酸编码。设计寡核苷酸提供一个片段的编码序列与二个互补序列的片段一致，反之亦然。寡核苷酸配对、连结，最后产生所需的基因序列。
这序列插入到一个克隆载体的一个部位，该部位可使已编码的肽类产物得以表达。一个合适的克隆载体至少含有基因表达控制序列部分。
典型的表达控制序列可以用五种成分表示。这些成分在基因上出现的次序如下(a)起动子区;(b)5′非翻译区;(c)蛋白质编码序列;(d)3′非翻译区和(e)转录终止位点。
基因系上每一成分的功能已明瞭。起动子区起动产生mRNA(转录)。起动子可以是(1)不受外界控制(基本的)，(2)在阻遏物控制下，所谓阻遏物，即当存在该物质时抑制基因功能，或(3)在诱导物控制下，所谓诱导物，即需要该物质诱导基因功能。例如，脂蛋白(Ipp)基因不受外界控制，这就称之为“基本的”。
位于起动子旁或附近的是“转录起始位点”，RNA聚合酶在此结合引起mRNA的转录起始。一旦转录起始，就产生mRNA。产生的mRNA的结构由上述(b)到(d)基因成分的DNA顺序所决定。
由此产生的mRNA携带能翻译成蛋白质产物的序列。能翻译的序列位于5′非翻译区向下和3′非翻译区向上的区域。翻译由核糖体结合到mRNA5′非翻译区的一个序列上，以核糖体结合位点表示之，并且在翻译起始密码(AVG)处开始，该密码以产物基因序列的第一个密码子出现，也为蛋氨酸(Met)编码。翻译终止于编译区末端出现的一个或几个终止密码上。
利用重组DNA技术，使制备一种克隆载体成为可能，通过把一个表达控制序列插入到此载体上，该克隆载体用来生产选择的外部(外源)蛋白。表达控制序列是-核苷酸序列当它有效地连结到基因上时，就能控制和调节这些基因的表达。
在上述内容中，“表达控制序列”一词包含前述(a)、(b)、(d)和(e)的成分。
重组DNA方法学可用于表达本发明的化合物，其方式是作为较大的“杂交”分子的一部分，或者直接表达。在直接表达的方式中，克隆载体可以这样设计，即该表达产物由基本起始密码子的蛋氨酸(Met)残基为先导的全部所需产物所组成。多余的Met残基可以通过用溴化氰处理或用苯基异硫氰酸盐再加一强脱水酸如三氟醋酸处理产物而移除。
在杂交分子表达方式中，把编码所需产物的DNA序列插入到克隆载体的表达控制序列的一个位点上，使表达的产物组成杂交蛋白。“杂交蛋白”意思是组成外源蛋白的重组DNA产物，一般是指全部或部分由表达控制序列所产生的固有(内源性)蛋白，(例如，脂蛋白基因上的脂蛋白)，所需蛋白是连结在这些固有蛋白上的。
由重组DNA方法所生产的设计合理的杂交分子将含有一个裂解位点，它位于内源蛋白部分与所需产物的连结处。通过化学或酶法处理杂交蛋白产物，裂解位点允许终产物产生。非常有用的选择性裂解位点包含一个DNA序列，该序列编码可被化学式酶法在C-末端裂解的一个氨基酸或氨基酸序列。
用来裂解蛋白的化学试剂如溴化氰，BNPS-甲基吲哚，羟胺等等。溴化氰在C末端的蛋氨酸残基上裂解蛋白。因此，选择裂解位点就是蛋氨酸基本身。
羟胺在C末端的某一天冬酰胺-Z上裂解，这里Z是甘氨酸、亮氨酸或丙氨酸。
BNPS-甲基吲哚在C末端色氨酸残基上裂解。
用于裂解的酶制剂如胰蛋白酶、木瓜酶、纤维蛋白酶、凝血酶等等。每一种酶引起裂解都发生在它所识别的特殊氨基酸序列上。例如肠激酶识别的选择性切点是-(天门冬氨酸)n-赖氨酸-这-氨基酸序列，其中n为2到4的整数。
特别是对于本发明缺乏蛋氨酸的复合物，最适合的选择性切点是蛋氨酸残基。这残基连在所需产物的N-末端上，很容易被使用溴化氰的已知方法所裂解从而产生所期望的终产物。
构造有用的克隆载体时，需要几个因素。其中两个因素对所有的有用的克隆载体是共同的。第一，载体必须具有一段含有复制功能点(复制子)的DNA片段。质粒和噬菌体DNA本来就含有复制子它促进在宿主细胞内的复制过程。第二，载体必须具有这样一个DNA片段，它能从未转化的细胞中把对选择转化细胞有用的性质转送给能转化的宿主细胞。各种其他性质也可用于选择的目的。最常用的一种性质是抗菌素耐药性，如四环素抗性或氨苄青霉素抗性。
上述两种因素一般存在于容易使用和识别的克隆载体上。合适的克隆载体的例子是细菌质粒，例如包括pBR322、pMB9、ColE1、pCR1质粒的大肠杆菌质粒;广宿主质粒，包括RP4，噬菌体DNA，如入噬菌体等等。上述已知载体如果不是全部，也是绝大部分带有前面所述的两种因素。
第三个因素是表达控制序列。其它任何这类控制表达序列都能使用，例如包括来自脂蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因，色氨酸基因，β-内酰氨酸基因，入噬菌体等等。
用插入一个选择表达控制序列得到一个合适的克隆载体时，使用的是常规的方法。克隆载体上存在各种位点，在该位点上用对它特异的限制性内切酶可以进行切割。任何这样的位点都可选择来插入表达控制序列。举一例子，在已知道得很清楚和已被证明的质粒pBR322上，存在几个合适的限制性位点，其中任何一个都可作为插入位点。PstI位点位于β-内酰胺酶基因。其余在特异编码区以外的位点是EcoRI和PvuⅡ。这些和别的位点都能被工艺熟练者很好辨认。
利用任何这样的或其它的位点，插入一个表达控制序列或其基本部分来生产本发明所限定的载体是容易做到的。
第四个因素当然是编码所需产品的DNA序列。正如前面注明的，这种DNA序列可以通过合成来构建，即用已知的磷酸三酯的方法或其它已知方法来合成。
合适的克隆载体可用于多种宿主体，例如革兰氏阴性原核生物如大肠杆菌，沙雷氏菌属，假单胞菌属等等;革兰氏阳性原核生物如芽胞杆菌属，链霉菌属等等;及其核生物如酵母属等等。合适的宿主体是革兰氏阴性原核生物，尤其是大肠杆菌更为合适，例如大肠杆菌K-12系，象PV308。
用已知的方法学，把适当地制备出来的克隆载体用于转化适合的宿主体，在这样的生物体内扩增，并用标准的发酵条件表达外源性蛋白产物。这外源性蛋白产物是用常规方法从所得的发酵肉汤中分离出来的。
于是，根据本发明，就提供了一个制备含结构式(Ⅰ)序列的合成口蹄疫疫苗的程序x-A-y-B-Z (Ⅰ)其中x、A、y、B和Z如前所定义的，它包含(a)从结构式(Ⅰ)相应的被保护复合物中裂解出一保护性基团;或(b)培养一种微生物，它被含有编码结构式(Ⅰ)复合物的DNA序列的表达转移载体所转化，在适于表达编码结构式(Ⅰ)复合物的DNA序列的情况下，由上述微生物的溶菌液或培养基中纯化结构式(Ⅰ)复合物。
(c)如果需要，使游离复合物盐化，形成相应的药品上合格的盐。
有效治疗口蹄疫的本发明的复合物能用于各种药品组成和配方之中，并可经各种方便途径给药，如鼻内、肌肉内、静脉内、皮下和腹腔内。
本发明复合物给药时，适于注射的药品形式包括无菌水溶液或弥散剂，及可重新制成无菌注射液或弥散剂的无菌粉末。载体可以是溶剂或弥散介质，例如含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等等)，及合适的上述混合物和植物油。保持适当的流动性，例如通过使用卵磷脂涂层，通过保持在弥散情况下所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂。通过各种抗菌剂和抗真菌剂确保予防微生物的作用，例如paraten，氯代丁醇、苯酚，m-甲酚，山梨酸等等。在很多情况下，期望含有等张试剂，例如蔗糖，氯化钠等等。利用延缓吸收的物质可以延长注射药物形式的吸收，例如，单硬脂酸铝和白明酸。
无菌注射液可以通过把本发明的复合物掺入适量合适的溶剂，如果需要，可带有各种别的配料。
如需要，为更有效的分布，复合物可掺入慢释放或有目标的传送系统，如基质聚合物、脂质体和微球体。
在期望对口蹄疫有予防或治疗作用期间，都要给受者一定剂量的本发明复合物。接受者的量和给药方式将对诱发特殊反应的必需剂量的大小有影响。
为了给药方便和剂量一致，本发明复合物接单位剂量配方有特殊的优点。“单位剂量形式”涉及到物理学上分主单位，适于给治疗对象提供单个剂量。每一单位含有予先定量的复合物来计算复合物与药品上合格的载体联在一起产生预期的治疗和予防作用。这个特殊单位剂量形式直接依赖并受(a)特殊组成的单一特性和(b)所获得的特殊效果所支配。
以下非限定实例用来进一步说明本发明。
实例1.FMD合成疫苗的制备所有的肽类都在Beckman 990 B固相肽合成仪上用半自动程程进行合成。起始作用过程从加上第一个氨基酸，经过后面的所有步骤直到加上最后一个氨基酸都是人工获得的。所有试剂除非另有说明，都是商业用的最高挡品。二甲基甲酰胺(DMF)使用之前要过4
分子筛后贮存一周。二氯甲烷(CH2Cl2)是高压液相层析纯的。二异丙基乙胺(DIEA)用前用茚三酮稀释。共聚树脂(苯乙烯-1%二乙烯苯)，200-400网孔珠，从Bio-Rad实验室购买。保护氨基酸的质量是购自Peninsula实验室和Bachem，用前经过薄层层析、旋光、氨基酸分析和质谱分析检测过的。
A、氨甲酰树脂的制备氨甲酰树脂的制备如A.R.Mitchell，S.B.H.Kent，M.Engelharol R.B.Merrifield，J.Org.Chen.43，2845-2852(1978)所述，但所期望的作用是他们报告的四倍。彻底洗过的100克树脂放在三颈的圆底烧瓶内，加入16克(81毫摩尔)的正-(羟甲基)酞亚胺和三氟醋酸/二氯甲烷(1∶1，V/V)2升。在快速搅拌下，慢慢加入三氟甲烷磺酸(40ml，0.44摩尔)。22℃反应6小时后，过滤溶液，每次用4升三氟醋酸/二氯甲烷(1∶1，V/V)，二氯甲烷、乙醇，最后是二氯甲烷广泛洗涤。树脂一旦经真空干燥后，在2升含5%肼的乙醇中回流16小时。树脂趁热过滤，并用煮沸乙醇(4×2升)，甲醇(4×2升)和二氯甲烷(4×2升)洗涤。产物经真空干燥，通过茚三酮分析，产生胺化作用为0.836毫摩尔/克〔V.Sarin，S.B.H.Kent，J.P.Tam，R.B.Merrifield，Anal、Biochem.117，147-151(1981)〕。
B、Boc-甘氨酸-〔4-(氧甲基苯)〕醋酸的制备。
合成Boc-甘氨酸-〔4-(氧甲基苯)〕醋酸，严格按J.P.Tam，S.B.H.Kent，T.W.Wang，R.B.Merrifield，合成法，955-957(1979)〕所述，得率为45%。
C、衍生的甘氨酸与氨甲基树脂的连结。
Boc-甘-〔4-(氧甲基苯)〕醋酸(1.4毫摩尔)于0℃，在1.4毫摩尔1-羟基苯三唑(HOBt)存在的条件下，溶于20毫升DMF/二氯甲烷(1∶3，V/V)中。加入等量的(1.4毫摩尔)二环己基碳化二亚胺(DCC)，于0℃搅拌反应混合物10分钟，然后过滤除去二环己基脲，上清液加到4克悬于20毫升二氯甲烷的氨甲基树脂上。过二小时后，过滤树脂，用40毫升二氯甲烷洗涤3次，然后悬于40毫升0.5M醋酸酐/0.1MDIEA/二氯甲烷。再过2小时后树脂对茚三酮呈阴性。树脂用40毫升二氯甲烷洗三次，然后在40毫升三氟醋酸/二氯甲烷(1∶1，V/V)中去除甘氨酸的-丁基氧羰基的保护基团。
D、重复分步合成方案在每种情况下，每种氨基酸用多于胺的三倍量进行双偶联。而天门冬酰胺、谷氨酰胺和精氨酸以它们先形成的HOBt-酯的形式偶联两次，其余氨基酸第一次偶联以其先形成的对称酐进行，再以其先形成的HOBt-酯的形式重复偶联。中和作用、去保护和全部洗涤，在15毫升溶剂/克起始树脂开始，按以下方案全部自动化。
1. 5%DIEA/CH2Cl2(2×2分钟)
2. CH2Cl2(6×1分钟)3. 第一次偶联(1×120分钟)4. CH2Cl2(6×1分钟)5. 5%DIEA/CH2Cl2(2×2分钟)6. CH2Cl2(6×1分钟)7. 第二次偶联(1×120分钟)8. CH2Cl2(6×1分钟)9. 5%TFA/CH2Cl2(1×2分钟;1×20分钟)10. CH2Cl2(6×1分钟)在合成过程中，将树脂等分移出用以制备缩短的免疫原。
E、制备O1K，VP1(141-158)脯半胱甘-〔21残基肽〕约3克肽树脂代表1.34克被保护的O1K，VP1(141-158)-脯半胱甘，用30毫升HF/对-甲酚(9∶1)于0℃处理60分钟，裂解完成后，于0℃在真空下把树脂蒸发干，随后用5×50毫升二乙基醚洗涤。去保护的肽依次用醋酸处理来溶解10%醋酸(3×30毫升)，50%醋酸(1×30毫升)，最后10醋酸(3×30毫升)。该肽冷冻干燥至产量的76%。Ellmantritration显示出最少70%游离的巯基成分。该肽经葡聚糖(Sephadex)G-25凝胶渗透层析用10%醋酸纯化，随后二硫苏糖醇(DTT)还原，得到经分析高压液相层析(HPLC)确定的高度均一的单体部分。
F、制备O1K，VP1〔亮脯脯丝(141-158)〕脯半胱甘-〔25残基肽〕
约1.1克肽树脂代表0.532克已保护的O1K，VP1〔亮脯脯丝-(141-158)〕脯半胱甘如E项一样处理，得到所要肽的产量为84%。
G、制备O1K，VP1〔(200-213)脯脯丝(141-158)〕脯半胱甘-〔38残基肽〕约2.4克肽树脂代表1.29克已保护的O1K，VP1〔(200-213)脯脯丝(141-158)脯半胱甘按E项处理得到97%产量的所要肽。
H.制备O1K，VP1〔半胱半胱(200-213)脯脯丝(141-158)脯半胱甘-〔40残基肽〕约2.5克肽树脂代表1.39克已保护的O1K，VP1〔半胱半胱(200-213)脯脯丝(141-158)〕脯半胱甘按E项处理得到97%产量的所要肽。
I、制备O1K，VP1H-半胱-〔精酪冬酰精冬酰丙(141-158)〕亮脯脯苏〔谷丙(200-213)〕OH-〔45残基肽〕已保护的O1K，VP1H-半胱-〔精酪冬酰精冬酰丙(141-158)〕亮脯脯苏〔谷丙(200-213)〕-肽树脂按E项处理得到标题所列的肽。
这五种多肽的氨基酸分析如表1所示
Ⅰ.肽类通过SPDP化学性附着到KLH上下面叙述最小肽的研究过程基本上对所有的化学性结合到KLH上的肽是相同的。SPDP〔N-琥珀酰亚胺-3(2-二硫吡啶)丙酸盐〕对KLH最大适合的负载水平是按照反应超过60分钟的复合物的沉淀程度来确定的。据观察SPDP对KLH超过250摩尔是合适的。1.5克KLH(～1×10-4毫摩尔)溶于25毫升0.1摩尔Na2HPO4，pH7.2用轻度超声处理。少量不溶物用离心除去，上清液加入7.81毫克溶于625微升DMF的SPDP(2.5×10-2毫摩尔)。碱性吸收停止后，样品离心，上清液用Sephadex G-25层析(0.1M NaHPO4，pH7.2，速度为20厘米/小时)胱盐。在衍生化过程中得到的负载水平用DTT还原测得约为40%。
在100g被处理过的KLH(2×10-6摩尔配体)的25毫升0.1M Na2HPO4，pH7.2中加入溶于600微升0.1摩尔pH7.4的Tris缓冲液中超过十倍量的(141-158)脯半胱甘还原肽(44毫克，2×10-5摩尔)。反应通过释出的配体来监测，发现在22℃，60分钟时接近定量。样品在Sephacryl S-200上用0.1摩尔NH4HCO3，pH7.5胱盐并冻干。基于有限的反应物，偶联21-，25-和38-残基肽的产量分别为84%、85%和68%。
J.肽类的配方所有肽和肽-KLH连结物在需要的浓度下溶于10mM Tris，pH8.0，然后用Freund氏完全估剂按1∶1稀释。给与每个动物的总量及抗原浓度在每个实验中叙述。
Ⅱ、生物学方案A、豚鼠接种全部实验用随机近亲繁殖的雌性Duncan Hartly豚鼠，体重为450-500克。每组5只豚鼠，按所述剂量皮下注射每只为0.15毫升体积的每种疫苗制剂。除0.15毫升总剂量外，只有一次是0.45毫升剂量用于抗原量滴定得到规定的最高浓度。从O1Kaufbeuren品系制备对照疫苗，已发表的序列数据就是来自这一品系。疫苗用氢氧化铝凝胶制备，每一剂量含1.66毫克皂苷，五只豚鼠皮下各注射一毫升疫苗。攻击病毒的是上述的O1Kaufbeuren品系。它通过连续的小泡啉巴管适应于豚鼠，以第五豚鼠啉巴管水平用作攻击目的。病毒滴定后，进行1/20稀释，得到豚鼠ID50为103.5的攻击剂量，即每只动物3000感染剂量。所有的实验动物都在左右足垫作病毒攻击的皮内接种，体积为0.2毫升。连续7天观察每只受攻击的豚鼠是否在其它的后足、手或口发生继发性或延及性损伤。予防标准为没有任何继发损伤。
B、牲畜接种全部实验用6到8个月对口蹄疫敏感的小母牛。混合喂养，体重约150-180公斤。按所述剂量每种疫苗制品皮下注射每只给3毫升，每组为三只牲畜。每次实验，一组三只是不接种的作为阳性实验对照。在舌上十个部位用舌内注射一次剂量为0.1毫升的104ID50新滴定的O1BFS 1860病毒来攻击全部动物。每天检查攻击过的动物看体温是否升高，舌、足上损伤是否出现。感染后七天无继发损伤出现，则认为动物是被保护了。全部动物试验和血清估测在联合国动物病毒研究所进行。
C、血清中和滴度(SNT)的测定用于测定血清中和滴度的定量方法如Golding，S.M，Hedger，R.S.，Talbot，T.，Watson，J.，所述，Rese ch in Veterinary Science 40，142-147(1976)。所有ELISA抗体滴度都是规定为直接抗肽140-160。在所有采用上述肽类接种的动物中已经得出ELISA测定和血清中和滴度之间极为密切的相关关系。
Ⅲ、生物学结果建立一系列可能合成的肽类疫苗的相对效力的最方便方法是测定其最小预防摩尔剂量。表2代表用四种不同免疫原在豚鼠上得到的剂量滴度结果。资料在几个方面做了说明，最主要的方面是明显增高血清中和滴度(SNT)及与21-残基肽比较通过38-和40-残基肽得到的预防作用。这些结果清楚表明本发明复合物的意想不到的有利性质，它提供对病毒攻击最满意的预防作用。38-和40-残基肽在实验误差内似乎是相等的，从而使后者氨基末端半胱-半胱残基的重要性减到最小。这二个肽提供的完全保护作用只用了21-残基抗原肽剂量的1/10到1/100。然而，不用任何提及的载体，使豚鼠抵抗FMDV的神奇能力显著简化了方法并消除变异性的主要来源。最理想的能提供完全抗性的合成剂是这样的，它包含处于高度限定和纯净状态下最少的病毒结构信息。去除KLH或类似载体而仍然提供抗性标志着在合成疫苗的方法方面有了显著进步。
抗原最优化的必要性是极为重要的，因为商品化将很可能使用比Freund氏完全佐剂低效的佐剂。表3显示了40残基肽在商品合格的Al(OH)3佐剂中有完全保护作用的摩尔剂量，该剂量相当于21残基肽在完全Freund氏佐剂中产生保护作用的剂量。
表3.用40-残基肽接种豚鼠佐剂估价肽浓度 佐剂 被保护的动物数/受攻击的动物数150毫微摩尔 Freund氏完全佐剂 5/517毫微摩尔 ″ 5/52毫微摩尔 ″ 4/50.2毫微摩尔 ″ 0/5150毫微摩尔 Al(OH)35/517毫微摩尔 ″ 1/52毫微摩尔 ″ 0/50.2毫微摩尔 ″ 0/4对于估价FMD疫苗，虽然已经证明豚鼠是个有用的模型，但最终成功的试验必须在牲畜上进行，在主要的商业指标动物上进行。表4表示了用40-残基肽接种牲畜，再用常规的攻击即在每个接种过的动物上做舌的直接病毒感染的结果。血清中和滴度迅速增加，在第14天接近最大值，至少在整个攻击时间内(32天)一直保持着。第32天，受攻击的9只动物中的2只完全有抗性，没有表现出继发损伤。这些动物代表用合成肽成功地单次牲畜接种FMD的第一个例子。这证明了本发明的免疫原效力。再有，通过攻击前中和抗体浓度
的血清学测定，证明不可能予先存在抗性。与传统的FMD疫苗所期望的中和抗体浓度的已知最低水平比较，所有动物都已明显具有抗性。所以此时不能接受把肽疫苗的功效建立在用传统疫苗作为比较基础的SNT值上。重复免疫动物1，2和3号动物在攻击后14天得到完全抗性。加强免疫后，观察到用ELISA测定的这些动物的抗体滴度增加了将近一半的对数单位(log unit)。这种40-残基肽仅为其它已经证明能使牲畜免疫的合成抗原的不到五分之一体积。在无任何潜在的低水平的细菌增强作用的情况下，它的合成性质将允许对它与各种佐剂组合中的固有活性加以评价。
勘误表
勘误表
权利要求
1.制备含式(1)序列的复合物的方法x-A-y-B-z(1)其中A和B是组成口蹄疫病毒VP1外壳蛋白血清型序列的氨基酸残基序列，其中一个含18到24个氨基酸残基，并包括在O血清型的141到158位的氨基酸序列或其它血清型的相同序列，另一个含14到20个氨基酸残基并包括O血清型200-213位的氨基酸残基序列或其它血清型的相同序列；x是H，H-半胱，或H-半胱-半胱，它的巯基可能封闭或游离；z是OH，半胱-OH，或脯-半胱-甘-OH，它的巯基可能封闭或游离；y是约2到6个氨基酸残基序列，或是其药品上合格的盐，它包括(a)从含式(1)序列的相应的被保护的复合物上裂解出的一个保护性基团；或(b)在适于表达编码式(1)复合物的DNA序列的条件下，培养由含有编码式(1)复合物的表达转移载体所转化的微生物，并从所说的微生物的溶菌液或培养基中纯化式(1)复合物。(C)如果需要，可使游离的复合物盐化形成相应的药品合格的盐。
2.制备如权利要求
1项中所要求的复合物的方法，其中x是H-或H-半胱半胱-。
3.制备如权利要求
1或2中所要求的复合物的方法，其中y是2到4个氨基酸残基的序列。
4.制备如权利要求
3所要求的复合物的方法，其中y含有-脯-脯-序列。
5.制备如权利要求
4所要求的复合物的方法，其中y是-脯-脯-丝-或亮-脯-脯-苏。
6.制备如权利要求
1-5中任何一个复合物的方法，其中z是-OH或-脯-半胱-甘-OH。
7.如权利要求
1中所要求的为制备VP1(O1K)〔半胱-半胱(200-213)-脯-脯-丝(141-158)〕-脯半胱甘;VP1(O1K)〔(200-213)-脯-脯-丝-(141-158)〕-脯半胱甘;或其在药品上合格的盐的方法。
8.按权利要求
1要求的为制备VP1(O1K)H-半胱-〔精酪冬酰精冬酰丙(141-158)-亮脯脯苏(谷丙(200-213)〕-OH，或其药品合格的盐的方法。
专利摘要
公开了有治疗或预防口蹄疫活性的化合物。这化合物含有结构式X-A-Y-B-Z序列，其中A和B是组成口蹄疫病毒VP外壳蛋白血清型序列的氨基酸残基序列，其中一个含有18到24氨基酸残基，并包括O血清型141-158位上氨基酸残基序列或其它血清型的相同序列，而另一个含有14到20氨基酸残基，并包括O血清型200到213位上的氨基酸残基序列或其它血清型的相同序列；X，Z和Y的定义如说明书中所述。
文档编号C12N15/09GK86103718SQ86103718
公开日1987年2月4日 申请日期1986年6月2日
发明者理查德·丹尼斯·迪马奇, 杰拉尔德·斯蒂芬·布鲁克 申请人:伊莱利利公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan