专利名称：制备气体填充的脂质体的方法
相关申请此申请是共同未决的美国系列号为717,084和美国系列号为716,899的申请的部分继续，两个申请的申请日都是1991年6月18日，依次是美国系列号为568,828，申请日为1990年8月20日申请的部分继续，它依次又是美国系列号为455,707，申请日为1989年12月22日申请的部分继续。此处全文编入了这些专利申请的每一公开供作参考。
背景技术：
发明领域本发明涉及制备气体填充的脂质体的新方法和设备。经这些方法制备的脂质体特别有用，例如用于超声显像及治疗传送系统。
背景技术：
各种各样的显像技术已用于检测和诊断动物和人的疾病。X-射线是用于诊断显像的首要技术之一。通过此技术获得的影像反映了被显像物体的电子密度。过去造影剂，如钡或碘已用于增强或阻断X-射线，由此增加不同结构间的对比度。然而，已知X-射线有一定的危害性，因为用于X-射线的辐射正在电离，电离辐射的不同危害作用是可以累积的。
另一重要的显像技术是磁共振显像(MRI)。然而，此技术有许多的缺陷，例如费用和不便于移动检查。此外，在许多医疗中心，MRI不适用。
用于核医学的放射性核素，提供了另一种显像技术。用此技术，核素，如锝标记的化合物，给患者注射，用γ照相机获取影像。然而，核医学技术不能看到立体图像并使动物或患者遭受辐射的不良作用。而且核素的操作与处理也成问题。
超声是另一种用于诊断的影像技术，它不象核医学和X-射线，因为它不使患者暴露于电离辐射的有害作用之下。而且不象磁共振显像，超声相对廉价并能移动检查。使用超声技术，通过传感器使声传送进患者或动物体内。当声波在体内传播时，在组织和组织液的界面间相遇。超声波依赖体内组织和组织液的声学特性，部分或全部反射或吸收。当声波通过界面反射时，通过传感器的接收器测定和处理，形成影像。体内组织和组织液的声学特性确定了在所形成的显像中出现的对比。
近年来，超声技术取得了进步。然而，尽管有这些不同的技术进展，超声在许多方面仍然是不完美的工具，特别是关于肝和脾、肾、心血管疾病的显像和检测，包括测定血流。检测这些区域的能力依赖于组织或组织液与周围组织或组织液之间声学特性的差别。结果，寻求到了造影剂，它能增加组织或组织液与周围组织或组织液之间的声学差别，以改善超声显像和疾病检测。
超声显像形成的理论基础指导研究者们寻觅气体造影剂。在密度或声阻抗大大不同的不同物质的界面对声学特性或声阻抗的改变最重要，特别是固体、液体和气体之间的界面。当超声波和这些界面相遇时，声学阻抗的改变产生更强的声波反射和超声显像中更强的信号。影响声效率或反射的另一个因素是反射界面的弹性。这种界面的弹性越大，声反射就越有效。如气泡物可出现高弹性界面。这样，作为上述原理的结果，研究者们着重于根据气泡或含气体超声造影剂的开发及其制备的有效方法的开发。
另一个致力于重要研究的领域是靶药物传递领域。当某处毒性成问题时，靶传递工具特别重要。特异的治疗传递方法潜在地用于降低毒副作用、降低要求的剂量、降低患者的花费。
在现有技术中将遗传物质，例如，导入活细胞，其方法和物质是有限和无效的。目前已开发了几种不同的机制，使遗传物质传递给活细胞。这些机制包括磷酸钙沉淀和电穿孔，如以阳离子聚合物及水填充的脂质体为载体的技术。所有这些方法都在体内相当无效及只限于使用在细胞培养转染。这些方法没有一个有利于定位释放、传递和使遗传物质整合于靶细胞。
用于治疗药物，如遗传物质传递的最好方法是治疗各种各样的人和动物疾患。特征的遗传病和在可理解的蛋白质转录方面，已取得了很大进步，但在传递遗传物质给细胞治疗人和动物疾病方面进展相当小。
主要的困难是从细胞外空间进入细胞内空间传递遗传物质或甚至有效地使遗传物质定位在选择的细胞膜表面。在体内已尝试了不同的技术，但没有大的成功。例如病毒，象腺病毒与逆转录病毒，已用作载体，转送遗传物质给细胞。使用了整个病毒，但置于病毒囊内的遗传物质的量有限。并且有由活病毒引起的相关的危险的相互作用。可分离病毒囊中的必要成分，用于携带遗传物质给所选择的细胞。然而，在体内，传递载体不但必须识别某种细胞，而且必须传递进这些细胞。尽管在病毒载体方面做了大量工作，但是为在体内传递遗传物质开发一种成功靶定位的病毒介导载体是困难的。
在细胞培养中，常规的含液体的脂质体已用于传递遗传物质进入细胞，但是体内遗传物质的细胞传递基本无效。例如体内阳离子脂质体转染技术不能有效地实施。需要的更有效的方法是改善治疗药物，如遗传物质的细胞传递。
本发明主要涉及上述及用于超声显像造影剂及用于治疗药物的有效靶定位传递载体领域的别的重要要求。
发明概要本发明提供了用于超声显像造影剂或作为药物传递剂的气体填充的脂质体的制备方法与设备。本发明的方法益处是，例如，气体填充的脂质体的制造过程简单、成本低。
制备气体填充的脂质体的优选方法包括在有气体存在时，在低于类脂从凝胶状态向液晶状态相转变温度下振荡含类脂的水溶液。
出乎意料，根据本发明方法制备的气体填充的脂质体具有许多惊人的高效性。例如，气体填充的脂质体由于其生物相容性及易于同脂溶性化合物在脂质体破裂后穿过细胞膜，所以有益处。本发明的脂质体也显示了对超声的回声反射性，对压力高度稳定、和/或通常具有长的贮存寿命、干燥贮存或悬于液体培养基中。脂质体的回响反射性根据本发明对制造的脂质体的诊断和治疗的应用是重要的。气体填充的脂质体也有下列优点，例如稳定的颗粒大小、低的毒性和温和的膜。据信这种柔韧的气体填充的脂质体的膜可有助于这样的指质体累积或靶定位到组织，如肿瘤。
根据本发明制造的气体填充的脂质体对超声对比显像因此有优越的特性。当其位于气体或组织培养基内时，气体填充的脂质体对提高声的吸收产生了界面。因此，气体填充的脂质体一般用于给患者显像，和/或诊断患者疾病组织的存在及加热和药物释放或激活组织的存在。
除超声外，使用了根据本发明制造的脂质体，例如，用于磁显像和作为MRI造影剂。例如，气体填充的脂质体可包括顺磁气体，例如大气，含痕量氧17，或顺磁离子，如Mn+2、Gd+2、Fe+3，并因此用作磁共振显像的敏感造影剂。此外，例如根据本发明制造的气体填充的脂质体可含射线透不过的金属离子，例如碘、钡、溴或钨，用于X-射线造影剂。
气体填充的脂质体也特别用于药物载体。不象现有技术中的脂质体，只有适于水溶性胶囊药物的液体内部，根据本发明制造的气体填充的脂质体特别适用于胶囊性脂溶性药物。而且，药物的脂溶性衍生物易于掺入类脂层，例如二卤化金属茂的烷基化衍生物。Kuo等，J.Am Chem.Soc.1991,113,9027-9045。
附图简述
图1是根据本发明，为制备本发明气体填充的脂质体微球体优选设备部分图。
图2说明的是过滤和/或分散本发明含气体填充的脂质体的治疗微球体的优选设备。
图3说明的是过滤和/或分散本发明含气体填充的脂质体的治疗微球体的优选设备。
图4是图3的设备的部分部件分解图。
图5是(A)过滤前和(B)过滤后说明本发明气体填充脂质体大小的显微照片。
图6图示的是(A)过滤前和(B)过滤后本发明气体填充脂质体的大小分配。
图7是通过滤器进行(A)过滤前和(B)过滤后类脂悬浮液的显微照片。
图8是继于过滤和高压类脂悬浮液形成的气体填充的脂质体显微照片，此照片摄于筛分气体填充的脂质体大小的(A)之前和(B)之后。
发明概述本发明是指气体填充的脂质体的制备方法和设备。不象现有技术中的方法，是指用内部填充水溶液形成脂质体，本发明的方法是指内部含气体的脂质体的制备。
制备气体填充的脂质体的优选方法包括在气体存在时，温度在类脂从凝胶状态向液晶状态相转变温度以下振荡含类脂的水溶液。本发明也提供了制备气体填充的脂质体的方法，包括在气体存在时振荡含类脂的水溶液及分离结果产生的气体填充的脂质体，以用于诊断或治疗。经上述方法制备的脂质体此处称为通过振荡气体滴注方法由凝胶状态制备的气体填充的脂质体。
通常一般的水填充的脂质体在类脂的相转变温度以上的温度形成，因为它们更具柔韧性并因此在液晶状态下应用于生物系统。例如，见Szoka and Papahadjopoulos,Proc.Natl.Acad.Sci.1998,75,9494-4198.相比之下，按本发明方法优选实施方案制造的脂质体是气体填充的，有更大的柔韧性，因为气体比水溶液更具可缩性和柔和性。因此，在低于类脂的相转变温度的温度下形成时，尽管凝胶相是更硬的，气体填充的脂质体可用于生物系统。
本发明方法提供了在气体存在时，振荡含类脂的水溶液。此处使用的振荡，定义为搅拌水溶液使气体从局部周围环境进入水溶液的运动。搅拌水溶液和引起气体进入的任何类型的运动都可用于振荡。振荡必须具有足够的力度以使其在一短时间内能够形成泡沫。如30分，优选在20分钟之内，更优选是在10分钟之内。振荡可以通过旋转进行(如通过涡旋)，从一边到另一边，或上下运动。而且，可结合不同类型的运动。此外，振荡可通过摇动含有类脂水溶液的容器进行，或通过摇动容器内水溶液而不摇动容器本身产生。进一步，振荡可通过手工或机器产生。可使用的机械振荡器包括，如象VWR Scientific(Cerritos,CA)振荡摇床及机械涂料混合器及其它已知的机器。另一个产生振荡的方法是在高速或高压下发出气体的运动。也可理解，优选用较大体积的水溶液，力的总量相应增加。剧烈振荡定义为至少每分钟振荡约60次，而且优选。涡旋至少每分钟1000次，剧烈振荡的例子更优选。涡旋在每分1800转为最好。
振荡形成的气体填充的脂质体通过水溶液顶部的泡沫的存在检测。一旦形成泡沫，伴随着水溶液体积的降低。优选地，泡沫的最终体积至少约为类脂水溶液起初体积的2倍，更好地，泡沫的最终体积至少约为水溶液初始体积的3倍，再最好地，泡沫的最终体积至少约为初始体积的4倍；最好地，所有类脂水溶液变成泡沫。
需要的持续振荡时间可通过检测泡沫的形成确定。例如，50ml离心管中10ml类脂溶液涡旋近15-20分钟或气体填充的脂质体的粘稠度相当厚，以致于当其旋转时不再粘于侧壁。此时，泡沫可导致含气体填充的脂质体溶液产至30至50ml水平。
要求形成优选泡沫的类脂的浓度依赖使用的类脂类型而变，一旦经此说明书支持，可被本领域技术人员容易确定。例如，在优选的实施方案中，按本发明方法用于形成气体填充的脂质体的1,2-二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)的浓度约20mg/ml-约30mg/ml盐溶液。用于优选实施方案中的二硬脂酸磷脂酰胆碱(DSPC)的浓度约为5mg/ml至约10mg/ml盐溶液。
具体地，浓度为20mg/ml至30mg/ml的DPPC一经振荡，便全部产生悬浮液，并且包裹的气体体积本身比悬液体积大4倍。浓度为10mg/ml的DSPC，一经振荡，完全产生无任何液体悬液的总体积，并全部为泡沫。
一旦得到此说明书支持，本领域的技术人员可知，类脂或脂质体可处理于本发明方法前或之后。例如，类脂可水合，然后冻干经冻融循环处理，或只水合。在优选的实施方案中，水合类脂，然后冻干，或水合，然后通过冻融循环处理，然后冻干，这些是在气体填充的脂质体形成之前。在最优选的实施方案中，水合类脂，然后振荡，接着至少进行一个在液氮中冷冻和融化的循环，此后接着冻干。在气体填充的脂质体形成之前这些处理的益处包括类脂由液体到具有较大表面积的固体的转化，一旦水合，因此具有较好的溶解性并因此形成较高产率的气体填充的脂质体。
根据本发明优选实施方案的方法，气体的存在通过当场环境气压提供。当场环境气压可以是密封容器内的气压，或在一个非密封容器内的气压，可是外环境中的气压。
二者择一，例如，气体可被注射进或不然加至有类脂水溶液的容器中或注射进类脂水溶液本身以提供空气以外的气体。不如空气重的气体加至密封的容器中而比空气重的气体加至密封的或不密封的容器中。
本发明优选的方法优选在低于所用类脂的凝胶态至液晶态相转变温度下进行。所谓凝胶态向液晶态相转变温度，是指类脂双层从凝胶态向液晶态转变的温度。例如见Chap-man等J.Biol.Chem.1974,249,2512-2521。不同类脂的凝胶态向液晶态相转变温度对本领域技术人员显而易见地，且例如描述于Gregoriadis ed.,Liposome Technology，Vol.I,1-18(CRC Press,1984)and Derek Marsh,CRCHandbook of Lipid Bilayers(CRC Press,Boca Raton,FL1990),at P.139。也可在下表Ⅰ中看出。使用的类脂凝胶态向液晶态相转变温度高于室温，容器的温度可调节，例如，通过冷却机制冷却含有类脂溶液的容器。
例2当用形码识别技术键入“辛"时，即IDHD，此时提示行会出现1、立IDH12、辛IDH23、音IDH3用户可选择2．同时记忆一下IDH2，这个2是本发明拼形码中的2，而不是数字键中的2。几次下来，用户一般能记住常用的。当然，记不住时还是选择，这一技术将使我们得到一个无重码方案。现有的重码处理技术．当发生重码时，只有1、2、3……等选择而无学习功能。每次发生重码则每次选。还有一种功能是“跳字”功能、自动上屏、当发生重码时、你选的字下次就跳在第一个位置。而处于“预选”状态。本发明则是每发生一次重码，操作者就可以学习一次，记下该重码的位号(标识码)，而下次将此位号当作一个编码放在重码字的编码后面(作为最后一码)，每字四键。该技术可使用户(操作者)每发生一次重码就可记忆一次，从而使重码随着记忆的增多而下降。适用于任何汉字输入法．且技术手段可以多样化。重码每发生一次就记忆一次，只要记住了，就不要再用重码方式输入，而将记住的编码直接输入即可。
本发明的热键部件(部首、字根)显示方法。即当处于输入状态时。只要键入“功能键+代码键”，屏幕提示行就会显示所述代码键所代表的相关代码(即相关部件、部首、字根等)。这一技术将使用户不需要记住每一个部件(部首、笔画、字根等)．而通过该技术随时查看。本技术可用于各种汉字编码输入法。用于本发明的举例如下。
当处于输入状态时．键入A1t+A，则提示行会显示〖A〗又瓦(a)又
及
女当你按一下“A1t+I”，则提示行显示生物系统。例如见Szoka and Papahadjopoulos,PROC.Natl.Acad.Sci.1978 75,4194-4198。对此之下，按本发明方法优选实施方案制造的脂质体是气体填充的，具有较大的柔韧性，因为气体比水溶液更可缩和柔和。因此，在低于类脂的相转变温度下，尽管凝胶相是更硬的，形成的气体填充的脂质体可用于生物系统。
使用凝胶态振荡气体滴注方法生产气体填充的脂质体的优选设备见图1。类脂和水溶性介质的混合物在气体滴注过程中经剧烈搅拌产生气体填充的脂质体，或成批或连续进料。关于图1，来自类脂供应器50的干燥类脂51通过导管59加至混合器66中，或连续流入或以间歇团状输入。如使用成批方法，混合器66可含相当小的容器，如注射器、试管、瓶或圆底烧瓶、或较大容器。如使用连续进料方法，混合器最好是大容器，例如桶。
气体填充的脂质体含有化合物，可加入治疗化合物，例如，以类似于上述类脂的加入方式在气体滴注程序前加入。二者择一，当脂质体在其外边用治疗化合物包裹时，气体滴注程序后，加入治疗化合物。
除了类脂51，来自水介质供应器52的水介质53，如盐溶液，经导管61也加至容器66中。类脂51和水介质53结合形成类脂水溶液74。两者择一，干燥类脂51能在引进混合器66之前水合，使类脂在水溶液中引入。在制造脂质体方法的优选实施方案中，溶液74起初的气体填充的，使溶液只占居混合器66容量的一部分。而且，用连续的方法，加入类脂水溶液74的速度及移去产生的气体填充的脂质体的速度受到控制，保证类脂溶液74的体积不超过混合器66容量的预先确定的百分比。
通过引进高速压缩喷射气流直接进入类脂水溶液74完成振荡。两者择一，通过机械振荡水溶液，或手工或经机器完成振荡。此种机械振荡可通过振荡混合器66或通过直接通过振荡水溶液74，而不振荡混合器本身进行。如图1所示，在优选的实施方案中，机械振荡器75和混合器66相连。振荡应是有充分强度的，目的在一段时间后，在水溶液74的上部形成含气体填充脂质体的泡沫73，如图1所示。泡沫73形成的测定可作为控制振荡持续的手段，就是说，预先不确定振荡的时间，振荡可以持续，直至产生预先确定体积的泡沫。
在制造气体填充的脂质体设备的优选实施方案中，使用的类脂低于室温的凝胶向液晶相转变的温度，使用了冷却类脂水溶液的方法。在图1所示实施方案中，通过混合器66周围配置的外套64完成冷却，以在混合器周围形成环形通道。如图1所示，冷却液63被迫流过这种环形通道，此是分别借助于外套进出导管62和63完成的。通过调节冷却液62的温度和流动速度，类脂水溶液74的温度能维持在期望的温度。
如图1中所示，气体55，可以是气体填充的或其它气体，如氮气或氩气与水溶液74一起导入混合容器66。空气可以采用不密封的混合容器导入，这样水溶液就不断地暴露于环境。批量方法中，固定量的局部环境空气可以通过密封该混合容器66而导入。如采用比空气重的气体，则该容器无需密封。然而，导入不比空气重的气体则需要将混合容器密封，例如采用盖65，如图1中所示。无论气体55是空气或是其它气体，它可以在混合容器66中加压，例如，由导管57将混合容器与加压气体供给罐54连接，如图1中所示。
摇动完毕后，含泡沫73的气体填充的脂质体可以从混合容器66中提取。提取可以通过将注射器100的针头102(如图2中所示)插入泡沫73并通过抽回柱塞106将预定量的泡沫抽入注射管104来完成。如下文进一步论述的，针头102的尖端在泡沫73中所置的位置可用来控制所提取的气体填充的脂质体的大小。
此外，提取可以通过将提取管67插入混合容器66来完成，如图1中所示。如果混合容器66是加压的，如前面论述的，气体55的压力可用来迫使气体填充的脂质体77从混合容器66经导管70入提取容器76。在混合容器66不加压的情况下，提取容器76可以经导管78与真空源58(如真空泵)相连，这样就产生足够的负压将泡沫73吸入提取容器76，如图1中所示。由提取容器76，气体填充的脂质体77导入管瓶82，于其中它们可装运给最终用户。加压气体56的气源可与提取容器76相连从而帮助挤出气体填充的脂质体。由于负压会导致增加气体填充的脂质体的大小，优选采用正压移出充质脂质体。
优选进行过滤以获得基本均一大小的气体填充的脂质体。在某些优选实施方案中，过滤装配含有不只一种过滤器，且优选地，这些过滤器不是紧密地相互连接，如图4中所示。过滤前，气体填充的脂质体的大小范围从约1微米至大干60微米(图5A和6A)。经单个过滤器过滤后，气体填充的脂质体通常小于10微米，但大小在25微米的颗粒仍然存在。经两个过滤器(10微米接着经8微米过滤器)过滤后，几乎所有的脂质体都小于10微米，且大多数为5至7微米(图5B和6B)。
如图1中所示，过滤可以通过将过滤器单元72直接结合到提取管67的端部来完成，这样只有低于预定大小的气体填充的脂质体能从混合容器66中提取。此外，或除提取管过滤器72外，气体填充的脂质体筛分可以通过结合入将气体填充的脂质体77从提取容器76导入管瓶82的导管79的过滤器80的方式来完成，如图1中所示。过滤器80可以含有阶式过滤器装配124，如图4中所示。示于图4中的阶式过滤器装配124包含两个连续过滤器116和120，其中过滤器120置于过滤器116上游。在优选实施方案中，上游过滤器120是“NUCLEPORE”10μm过滤器，下游过滤器116是NUCLEPORE”8μm过滤器。两个0.15mm金属网盘115优选置于过滤器116的两面。优选实施方案中，过滤器116和120由特氟隆TMO形圈118的方式将两者空间间隔最少150μm。
除过滤器外，筛分也可以利用气体填充的脂质体浮力对大小的依赖来完成。气体填充的脂质体恰好具有比水小的密度，因而将浮于混合容器66的顶部。由于最大的脂质体具有最小的密度，它们最快浮于水面。最小的脂质体通常最后升到顶部，并且不被气体填充的脂质将沉入底部。通过将它们经不同的漂浮过程移出混合容器66，这种现象可以优越地用来筛分气体填充的脂质体。因此，提取管67在混合容器66中的垂直位置的定位可以控制提取的气体填充的脂质体大小。管越高，所提取的气体填充的脂质体就越大。而且，定时或不断调节管67在混合容器66中的垂直位置，所提取的气体填充的脂质体的大小可以在不断发展的基础上控制。这种提取可以通过结合装置68而容易化，装置68可以是连于提取管67的与纹套管72匹配的纹箍71，此装置使得提取管67在提取容器66中的垂直位置得以准确地调节。
凝胶态振荡气体装置方法本身也可以用来改善筛分气体填充的类脂微球体。通常，振荡能量的强度越大，所得的气体填充的脂质体的大小就越小。
本发明还包括制备分发给最终用户的含药气体填充的脂质体的新方法。一旦形成气体填充的脂质体，它们将不可以在引起破裂的温度下高温消毒。因此，期望以灭菌成分形成气体填充的脂质体且尽可能少进行随后的操作以避免污染的危险。根据本发明，这可以通过下述方法完成，例如，通过在振荡之前将含有类脂和水溶液的混合容器消毒，并将气体填充的脂质体77从混合容器66经提取容器76直接分配入消毒注射器100的注射管104，如图2中所示，而无需进一步加工或处理。装有气体填充的脂质体77且适当包装好的注射器100可分发给最终用户。之后，产品无需进一步操作以施气体填充的脂质体于患者，只需从包装中取出注射器并从注射器针头102取下保护套(未示出)，将针头插入患者体内，或插入导管。而且，当注射器柱塞106挤压入注射管104时产生的压力会引起最大的气体填充的脂质体破裂，因此不过滤便获得了筛分的程度。
使用时需要过滤气体填充的脂质体时，例如因为它们从提取容器76移出时未过滤或因为需要进一步过滤，注射器100可以装有自己的过滤器108，如图2中所示。这就导致当注射气体填充的脂质体时通过柱塞106的作用引起它们压出过滤器108而使气体填充的脂质体筛分。因此，充气脂质体可以在一个步骤内筛分并注入患者。
如图3中所示，阶式过滤器盒110可以直接装在注射器112上，这样使得在使用时阶式过滤。如图4中所示，过滤器盒110包含阶式过滤器装配124，前面已论述过，结合在具有阳螺纹的下箍122和具有阴螺纹的上箍114之间。下箍122适合于Luer锁，使得它容易固定在注射器112上，而上箍114适合于针头102。
优选实施方案中，类脂溶液经过滤器压出且类脂溶液在振荡前高温消毒。一旦气体填充的脂质体形成，它们可以如前所述过滤筛分。这些步骤先于气体填充的脂质体形成提供，例如，减少未水合的脂质体量且由此提供明显较高的气体填充的脂质体产率以及提供可直接施于患者的消毒脂质体的优点。例如，混合容器如管瓶或注射器可装有过滤的类脂悬浮液，然后该溶液可在混合容器中消毒，例如，通过高压灭菌器。气体可以注入类脂悬浮液以通过振荡该消毒容器生成气体填充的脂质体。优选该消毒容器配有装好的过滤器，这样在接触患者前，气体填充的脂质体经过过滤器。
优选方法的第一步，经过滤器压出类脂溶液，通过破碎干的类脂和更大表面积的暴露而水合，减少了未水合的类脂的量。优选地，过滤器具有孔径约0.1至0.5μm，更优选约0.1至约4μm，甚至更优选，约0.1至约2μm，最优选，约1μm。如图7中所示，当类脂悬浮液过滤时(图7B)，与未先过滤的类脂悬浮液相比(图7A)，未水合类脂的量减少。未水合类脂表现为非均一大小的无定形块，是不合适的。
第二步，消毒，提供可容易施于患者的组合物。优选消毒通过热消毒完成，优选在至少约100℃温度下将溶液高压灭菌法处理，且更优选在约100℃至约130℃下高压灭菌法处理，甚至更优选，约110℃至约130℃，甚至更优选，约120℃至130℃，且最优选约130℃。优选加热至少约1分钟，更优选，约1至30分钟，甚至更优选，约10至约20分钟，且最优选，约15分钟。
采用不同于在会引起气体填充的脂质体破裂温度下高温消毒的方法进行消毒时，消毒可在气体填充的脂质体形成后进行，且是优选的。例如，可在充气脂质体形成前和/或后采用γ射线。
图8说明在130℃高压灭菌15分钟，接着涡旋10分钟后，气体填充的脂质体成功形成的能力。此外，压出和消毒程序后，振荡步骤产生对无残留的无水类脂相来说带得很少的气体填充的脂质体。图8A显示高压灭菌后但在过滤前产生的气体填充的脂质体，由此得许多具有大于10μm大小的气体填充的脂质体。图8B显示约10μm“NUCLEPORE”过滤器过滤后的气体填充的脂质体，得10μm左右的均一大小。
可以采用来制备气体填充的类脂微球的原料包括任何一种本领域熟练技术人员已知的适合用来作脂质体制备的材料或其组合物。采用的类脂可以是天然或合成来源。选用特定类脂类以最适合所需的属性，例如，短血浆半衰期与长血浆半衰期用于最大的血清稳定性。也可以理解某些类脂类可以对特定应用更有效，如抑制治疗化合物在气体填充的脂质体微球体破裂时被释放。
气体填充的脂质体中的类脂可以是单个双层或多薄片双层，且优选多薄片双层的形式。
可以用来产生类脂微球体的类脂类包括但不限于类脂类如脂肪酸，溶类脂，带饱和和非饱和类脂的磷脂酰胆碱包括，二油酰磷脂酰胆碱；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；双十五酰磷脂酰胆碱，二月桂酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱；二硬脂酰磷脂酰胆碱；磷酯酰乙醇胺如二油酰磷脂酰乙醇胺；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰甘油；磷脂酰肌醇；鞘酯类如鞘磷酯；糖酯类如神经节甘油GM1和GM2；葡糖酯类(glucolipids)；硫甘酯；糖鞘酯类；磷脂酸；棕榈酸；硬脂酸；花生四烯酸；油酸；含类脂类的聚合物如聚乙二醇，几丁质，透明质酸或聚乙烯吡咯烷酮；含类脂类的磺化单、双、寡或聚糖；胆甾醇，胆甾醇硫酸酯和胆甾醇半琥珀酸酯；生育酚半琥珀酸酯，带有醚和酯连接脂肪酸的类脂类，聚合的类脂类，二乙酰磷酸酯，硬脂胺，心磷酯，带有长度为6-8个碳的短链脂肪酸的磷脂类，带有对称酰基链的合成磷脂类(例如，带有一个6个碳的酰基链和另一个12个碳的酰基链)，6-(5-胆甾烯-3β-基氧)-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷，二半乳糖基甘油二酯，6-(5-胆甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫化-β-D-吡喃半乳糖苷，6-(5-胆甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-α-D-吡喃甘露糖苷，12-(((7′-二乙基氨基香豆-3-基)羰基)甲基氨基)-十八酸；N-[12-(((7′-二乙基氨基香豆-3-基)羰基)甲基氨基)十八酰基]-2-氨基棕榈酸；(4′-三甲铵)丁酸胆甾烯酯；N-琥珀酰二油酰磷脂酰乙醇胺；1,2-二油酰基-sn-甘油；1,2-二棕榈酰基-sn-3-琥珀酰甘油；1,3-二棕榈酰基-2-琥珀酰甘油；1-十六基-2-棕榈甘油磷酰乙醇胺；和棕榈酰高半胱氨酸；和/或其组合物。
如果需要，可以采用各种阳离子类脂类如DOTMA,N-[1-(2,3-二油酰基氧)丙基]-N,N,N-三甲基铵氯化物；DOTAP,1,2-二油酰基氧-3-(4′-三甲基铵)丙烷；DOTB,1,2-二油酰基-3-(4′-三甲铵)丁酰基-sn-甘油。通常，脂质体中阳离子类脂与非阳离子类脂的摩尔比为，例如，1∶1000,1∶100，优选，2∶1至1∶10之间，更优选在1∶1至1∶2.5的范围内，且最优选1∶1(阳离子类脂摩尔量与非阳离子类脂(例如DPPC)摩尔量的比)。当阳离子用来构建微球体时，品种繁多的类脂类可以包含非阳离子类脂。优选，这种非阳离子类脂是二棕榈酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺或二油酰磷脂酰乙醇胺。作为如上所述的阳离子类脂类的替代，含类脂类的阳离子聚合物如多溶素或多精氨酸也可用来构建微球体，且提供结合带负电荷治疗剂(如遗传物质)于微球体的外部。此外，可以采用负电荷类脂类，例如，来结合带正电荷的治疗化合物。
与本发明精神一致的，对本领域熟练技术人员来说是显然的其它有用类脂类或其组合物亦被本发明所包含。例如，含碳水化合物的类脂类可用于体内靶定位，如USP4,310,505中所描述的，其公开全部并入本文作为参考。
最优选的类脂类为磷脂类，优选DPPC和DSPC，且最优选DPPC。
可用来产生气体填充的微球体的饱和非饱和脂肪酸优选包括，但不限于，直链或支链形式的12个碳原子和22个碳原子间的分子。可采用的饱和脂肪酸的实施包括，但不限于，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸和硬脂酸。可采用的不饱和脂肪酸的实施包括，但不限于，月桂烯酸，抹香鲸酸，肉豆蔻烯酸，棕榈烯酸，岩芹酸，和油烯酸。可采用的支链脂肪酸的实施包括，但不限于，异月桂酸，异肉豆蔻酸，异棕榈酸，和异硬脂酸和类异戊二烯。
通过一或多个烷基或甾醇基，阳离子聚合物可结合到类脂层上，上述基团所起的作用是将阳离子聚合物固定在包围气体的类脂层上。可以这种方式使用的阳离子聚合物包括，但不限制于，多溶素和多精氨酸，和其类似物如多高精氨酸和多高溶素。阳离子类脂类和阳离子聚合物的正电荷基团，或含全氟烷基化基团的阳离子基团，例如，可用来配合负电荷分子如遗传物质上的糖磷酸酯，由此将所述物质结合到空气类脂微球的表面。例如，可以采用两新全氟烷基化二吡啶，如Garelli和Vierling在Biochim Biophys Acta,19921127,41-48中所描述的，其公开全部并入本文作为参考。此外，例如，负电荷分子可以经酯、酰胺、醚、二硫或硫酯键直接结合到类脂的首基上。
生物活性物质，如肽或蛋白质，可以并入类脂层，假定肽具有足够的亲油性或可以用烷基或甾醇基衍生而连接于类脂层。负电荷肽可以，例如，如上所述采用阳离子类脂或聚合物连接。
类脂类或气体填充的脂质体的溶液可以通过，例如，增加品种繁多的粘性改善剂来稳定。粘性改善剂包括，但不限于，碳水化合物及其磷酰化和磺酰化衍生物；聚醚类，优选分子量范围在400和8000之间；二和三羟基烷烃及其聚合物，优选分子量范围在800和8000之间。乳化剂和/或增溶剂也可用来与类脂类或脂质体结合。这些试剂包括，但不限于，阿拉伯胶，胆甾醇，二乙醇胺，单硬脂酸甘油酯，羊毛脂醇，卵磷脂，单和二甘油酯，单乙醇胺，油酸，油醇，泊洛沙姆，聚氧乙烯50硬脂酸酯，聚氧乙烯35蓖麻油，聚氧乙烯10油基醚，聚氧乙烯20十六十八基醚，聚氧乙烯40硬脂酸酯，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯40，聚山梨醇酯60，聚山醇酯80，丙二醇二乙酸酯，丙二醇单硬脂酸酯，月桂基硫酸钠，硬脂酸钠，失水山梨醇单月桂酸酯，失水山梨醇单油酸酯，失水山梨醇单棕榈酸酯，失水山梨醇单硬脂酸酯，硬脂酸，三乙醇胺，和乳化蜡。可与类脂或脂质体溶液一起使用的悬浮和/或增粘剂包括但不限于，阿拉伯胶，琼脂，藻酸，单硬脂酸铝，膨润土，糖糊，聚羧乙烯934P，羧甲基纤维素、钙和钠和钠12，鹿角胶，纤维素，糊精，明胶，瓜尔胶，羟乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，硅酸镁铝，甲基纤维素，果胶，聚环氧乙烷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，藻酸丙二醇酯，二氧化硅，藻酸钠，黄蓍胶，和黄原胶。
本发明的气体填充的脂质体优选包含一种不渗透性物质。不渗透性物质被定义为这样一种物质，它在典型的贮存条件下不允许主要的脂质体内含物通过。主要被定义为大于约50％的内含物，该内含物是包囊在脂质体内的气体以及任何其它成分，例如治疗剂。在贮存期和施用于患者前，优选，少于25％的气体被释放，更优选，少于10％的气体被释放，且最优选，少于1％的气体被释放。
也已发现，气体填充的脂质体的气体不渗透性至少部分地与凝胶态向液晶态的相转变温度有关。通常认为，凝胶态向液晶态的相转变温度越高，在给定温度下脂质体就越是气体不渗透。饱和二酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱的主链熔点转变参见上面的表1和Derek Marsh,CRC Handbookof Lipid Bilayers(CRC Press,Boca Raton,FL 1990)第139页。然而，应当指出的是，一般使用较少量的能量就可以将治疗化合物从带较低凝胶态向液晶态的相转变温度的类脂类组成的气体填充的脂质体释放。
在某些优选实施方案中，类脂的相转变温度比它们要施予的患者的体内温度高。例如，优选施于人的类脂类具有大于约37℃的相转变温度。通常，优选具有相转变温度大于约20℃的微球体。
在某些优选实施方案中，由本发明方法制得的脂质体是稳定的。稳定性定义为从形成时起直至超声应用时耐破裂。为求稳定性可以选用用来构建微球体的类脂类。例如，由DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)组成的气体填充的脂质体要比由DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)组成的气体填充的脂质体稳定，且这些转而又比由蛋磷脂酰胆碱(EPC)组成的气体填充的脂质体稳定。优选，从形成时直至超声应用时少于约50％的脂质体破裂，更优选，少于约25％的脂质体破裂，甚至更优选，少于约10％的脂质体，且最优选，少于约1％的脂质体。
本主题脂质体趋向于比经由已知方法如压力法或其它技术生产的其它气体填充的脂质体在贮存期具有更大的气不渗透性和稳定性。例如，形成72小时后，常规制备的脂质体通常基本上缺乏气体(气体扩散到脂质体外和/或脂质体破裂和/或融合)，导致反射性的伴随损失。相比之下，保持在水溶液中的本发明气体填充的脂质体通常具有大于约三星期的贮存寿命稳定性，优选的贮存寿命稳定性大于约四星期，更优选的贮存寿命稳定性大于约五星期，甚至更优选的贮存寿命稳定性大于约三个月，且通常贮存寿命稳定性甚至更长，如超过六个月，十二个月，或甚至二年。
此外，业已发现，掺入至少少量的负电荷类脂入任何脂质体膜，虽然不是必需的，但有益于提供一种不因聚合而趋于破裂的脂质体。至少少量的是指约占总类脂的约一摩尔百分量。适合的负电荷类脂类对本领域的熟练技术人员是显而易见的，包括例如，磷脂酰丝氨酸和脂肪酸。最优选的对应用共振频率超声时破裂，回波产生性和稳定性有能力的是由二棕榈酰磷脂酯胆碱制备的脂质体。
再则，本发明脂质体在血管中很好地充分稳定，因而它们经受再循环。气体填充的脂质体可以包被，因而被网状内皮系统吸收最小。有用的包被物包括，例如，神经节苷酯，糖醛酸苷半乳糖醛酸酯，古洛糖醛酸酯，聚乙二醇，聚丙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，葡聚糖，淀粉，磷酰化和磺酰化单，双，三，寡和多糖和
。脂质体也可以为如避免被免疫系统识别的目的而包被。
采用的类脂也最好是柔性的。柔性，如气体填充的脂质体的文中所定义的，是结构改变其形状的能力，例如，为了穿过大小比脂质体小的孔。
假定脂质体的循环半衰期充分地长，当通过身体时，脂质体通常穿过靶组织。因此，通过将声波集中于被治疗的选择组织上，治疗药物会局部释放在靶组织。为进一步帮助中靶，也可以将抗体，碳水化合物、肽、糖肽，糖类脂和外源凝集素掺入脂质体的表面。
在某些优选实施方案中，作为对气体灌输过程以及对保持气体填充的脂质体稳定性的帮助，例如，可以向类脂加入乳化剂。乳化剂的实例包括，但不限于，甘油、鲸蜡醇、山梨醇、聚乙醇、月桂基硫酸钠，Lauseth 23，聚山梨醇酯(所有个体)，所有饱和和非饱和脂肪酸，和三乙醇胺。
对于使用前的贮存，本发明的脂质体可以悬浮在水溶液中，如盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲的盐水溶液)，或仅仅是水，并优选贮存在约2℃至约10℃间的温度下，优选在约4℃下。优选，水是经消毒的。
典型贮存条件是，例如，非除气的0.9％NaCl水溶液在4℃下保存48小时。贮存温度优选低于形成脂质体材料的凝胶态向液晶态的相转变温度。
更优选，脂质体贮存在等渗盐水溶液，虽然，如果需要，盐水溶液可以是低渗的(例如，约0.3至约0.5％NaCl)。溶液也可以是缓冲的，如果需要，以提供约pH5至约pH7.4的pH范围。适合的缓冲液包括，但不限于，乙酸盐，柠檬酸盐，磷酸盐和碳酸氢盐。
也可以与脂质体一起包括抑菌剂以防止贮存时细菌降解。适合的抑菌剂包括但不限于氯化苄烷铵，氯化苄乙氧铵，苯甲酸，苄醇，羟苯甲酸丁酯，十六基吡啶鎓氯化物，氯丁醇，氯甲酚，羟苯甲酸甲酯，苯酚，苯甲酸钾，山梨酸钾，苯甲酸钠和山梨酸。
本文所用的“气体填充的”是指脂质体具有至少约10％气体的内部体积，优选至少约25％的气体，更优选至少约50％的气体，甚至更优选至少约75％的气体，且最优选至少约90％的气体。本领域熟练技术人员可以理解，一旦得到本发明的公开，人们也可以采用气体前体，接着活化以形成气体。
本发明的气体填充的脂质体可以使用各种生物相容气体。这类气体包括空气，氮气，二氧化碳，氧气、氩气、氟气、氙气、氖气、氦气，或其任何和所有组合气。一旦得到本发明的公开，其它适合的气体对本领域熟练技术人员是显而易见的。
本发明脂质体的大小依所期的使用而定。对较小的脂质体，通常共振频率超声要比较大的脂质体要高。筛分也可用作调节所得脂质体的生物分布和清除。除过滤外，脂质体的大小，如果需要，也可以通过本领域熟练技术人员已知的方法调节，如压出，声处理，匀浆，采用层流将液体芯导入液体不互混鞘。参见，例如，USP 4,728,478；英国专利申请GB2193095A；USP 4,728,575；USP 4,737,323；国际申请PCT/US 85/01161；Maye等，Biochimica et Biophysica Ac-ta 1986,858,161-168；Hope等，Biochimica et BiophysicaActa 1985,812,55-65；USP 4,533,254；Mayhew等，Methods in Enzymology 1987,149,64-77；Mayhew等，Biochimica et Biophysica Acta 1984,755,169-74；Cheng等，Investigative Radiology 1987,22,47-55；PCT/US89/05040；USP 4,162,282；USP 4,310,505；USP 4,921,706；和Liposomes Technology,Groegoriadis,G主编，Vol I.PP 29-37,51-67和79-108(CRC Press Inc,Boca Ra-ton,FL,1984)。每个前面专利，文献和专利申请的公开全部并入本文作为参考。在压力下压出限定大小的孔是调节脂质体大小的优选方法。
由于脂质体大小影响生物分布，不同大小脂质体可以选用于不同的目的。例如，血管内施用，优选的大小范围是平均外径在约30纳米和约10微米间，优选平均外径为5微米。
更具体地说，对于血管内施用，脂质体的大小优选约10μm或更小的平均外径，且优选小于约7μm，且更优选小于约5μm的平均外径。优选，脂质体不小于约30纳米的平均外径。
对于提供治疗剂释放至器官如肝脏并将正常组织与肿瘤区别，较小的脂质体，约30纳米和约100纳米间的平均外径，是优选的。
为栓塞组织如肾或肺，脂质体优选小于约200微米的平均外径。
对于鼻内，直肠内或表面给药，微球体优选小于约100微米的平均外径。
大脂质体，例如，1到10微米大小之间的，通常限定于静脉内空间，直至被衬在管内的吞噬单体清除，如衬噬菌体和Kuppfer细胞的毛细管窦状隙。为穿至窦状隙外的细胞，可以采用较小的脂质体，例如，小于约1微米平均外径，如大小小于约300纳米。
脂质体的给药途径依预期的使用而定。如本领域熟练技术人员能理解的，本发明治疗剂传递体系的给药可采用各种剂量形式以各种方式进行，如血管内、淋巴内、非肠道、皮下、肌内、鼻内、直肠内、腹膜内、间质、经雾化器入气道、高压、经口，表面，或肿瘤内。对于血管内应用，治疗剂传递体系通常是静脉注射，但也可以是动脉注射。本发明的脂质体也可以间质注射或注入任何体腔。
对于具有良好的传声途径传送超声能量的组织，采用超声，治疗剂从本发明的脂质体的传递得以最好地完成。在体内的大多数组织如肌肉，心脏，肝脏和大多数其它的重要结构是这种情况。脑中，为了直接让超声能量穿过头颅，需要手术来辟路径。
此外，本发明特别有用于将治疗剂传递入患者肺中。本发明的气体填充的脂质体比，例如，常规的液体填充脂质体轻。液体填充脂质体通常沉降在中心的邻近气道而不是到达肺的末梢区域。因而认为，本发明的气体填充的脂质体合格可以改善治疗化合物至肺末梢区域的传递。肺末梢区域包括末端气道和小窝。施用于肺，气体填充的脂质体可由例如，雾化使用。
在例如以衬有类脂类的肺为靶体的使用时，治疗剂可以在气体填充的脂质体与衬在靶组织的类脂类聚合时释放，此外，气体填充的脂质体可以在不使用超声在给药后爆裂。因此，在上述类型的给药中不需要应用超声来释放药物。
再则，本发明的气体填充的脂质体对在水介质或暴露于氧和/或空气时降解的治疗剂特别有用。例如，脂质体可以用惰性气体如氮气或氩气填充与不稳定治疗化合物一起使用。此外，气体填充的脂质体可以用惰性气体填充并用来包囊不稳定治疗剂，用于患者的通常引起治疗剂暴露于气体填充的的区域，如皮肤和眼上使用。
气体填充的脂质体对经皮传递例如，膏药传递体系也特别有用。使用破裂超声可增加经皮传递治疗化合物，再则，机械装置可用来监控和调节药物传递。例如，诊断超声可用来可视监控气体填充的脂质体的爆裂和调节药物的传递和/或水听器可用于查听气体填充的脂质体的爆裂和调节药物传递。
在优选实施方案中，脂质体单独地施用，而不是例如包埋在基质中。
体外应用，如细胞培养使用，气体填充的脂质体可加到培养物的细胞中，然后培养。随后声能可用于含细胞和脂质体的培养基。
通常，本发明的治疗传递体系是以水悬浮液如在水中或盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲的盐水)中的形式给药。优选，水是经消毒的。还优选盐水溶液是等渗盐水溶液，虽然如果需要，盐水溶液可以是低渗的(例如。约0.3至约0.5％NaCl)，如果需要，该溶液也可以是缓冲的，以提供约pH5和至约pH7.4的pH范围。此外，葡聚糖最好包括在培养基中。其它的可用于气体填充的脂质体给药的溶液包括，但不限于，杏油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，棕榈酸异丙酯，矿物油、肉豆蔻醇、辛基十二醇、橄榄油、花生油、桃仁油、芝麻油、大豆油和角鲨烯。
施用的气体填充的微球体的有用剂量和施用方法依年龄、重量、要治疗的哺乳动物，预期的特定应用(治疗/诊断)而定。典型地，剂量以较低水平开始，然后增加直至取得所需的治疗效果。
对于超声显像中的应用，优选，本发明的脂质体具备反射率大于2dB，更优选在给4dB和约20dB之间。在此范围内，较大的脂质体，较高浓度的脂质体，和/或采用较高超声频率时，显出本发明脂质体最高的反射率。
对于治疗药物传递，本发明的含治疗剂的脂质体治疗剂给药于或经其它方式到达患者需治疗的区域后，向该区使用某种频率的超声，该脂质体的破裂令人吃惊地容易进行。具体地说，意外地发现，以相应于含治疗剂的气体填充的脂质体的峰共振频率的频率使用超声时，脂质体会破裂并释放其内容物。
峰共振频率可在体内成体外测定，但最好在体内，采用常规方法，通过将脂质体暴露于超声，接收反射的共振频率信号和分析接收的信号谱以确定该峰来测定。该峰，如所测定的，与峰共振频率一致(或如有时所称的第二级谐波)。
优选，本发明的脂质体具有峰约0.5mHz和约10mHz间的共振频率。当然，本发明脂质体的峰共振频率会依外径和，在某种程序上，脂质体的弹性或柔性的不同而不同。带较大和较高弹性或柔性的脂质体比较小和较低弹性或柔性脂质体的共振频率要低。
当暴露于与较高强度(瓦数)和较长时期(时间)组合的非峰共振频率时，含治疗剂的气体填充的脂质体也会破裂。然而，这种更高的能量，导致大大增加热量，可能是不希望的。通过调节能量的频率使之与峰共振频率匹配，破裂的效率和治疗剂释放得以改善，明显的组织变热通常不会出现(通常温度增加不高于约2℃)，且需要较少的总能量。因此，以峰共振频率使用超声，虽然并不要求，是最优选的。
对于诊断或治疗超声，在本发明的实施中可以采用任何一种类型的诊断超声显像装置，装置的具体类型或型号对本发明的方法无关紧要。设计来施用超声高温的装置也是适合的，这种装置描述于USP 4,620,546；4,658,828和4,586,512，其分别全部并入本文作为参考。优选，该装置使用共振频率(RF)谱分析仪。转换器探头可以体外使用或植入。超声通常比较低强度和短时间开始，然后，增加强度，时间，和/或共振频率直至脂质体在超声上可见(用于诊断超声使用)或破裂(用于治疗超声使用)。
尽管各种原理的使用对本领域熟练技术人员是显而易见的，一旦得到本发明公开，通过一般的指引，对于约1.5至约1微米平均外径的气体填充的脂质体，共振频率通常在约1至10兆赫的范围。通过调节聚焦区于靶组织(例如肿瘤)的中心随着脂质体在靶组织内的累积，脂质体可以在实际时间超声下见到。使用7.5兆赫弯曲排列转换器作为实例，调节传递至转换器的能量至最大和调节聚焦区在靶组织内，则二维峰临时平均(SPTA)能量为在水中的最大值接近5.31mW/cm2。该能量会引起从气体填充的脂质体释放一些治疗剂，但更大量的释放可以通过使用更高能量来完成。
将转换器开到多普勒方式，可实现更高能量的输出，从同一转换器可达每平方厘米2.5瓦。用多普勒方式开动机器，能量可以释放到靶组织内的选择聚焦区，且气体填充的脂质体可释放其治疗剂。选择匹配气体填充的脂质体共振频率的转换器甚至会使这种治疗剂释放的方法更有效。
对于较大直径的气体填充的脂质体，例如，平均外径大于3微米，完成治疗剂释放时较低频率的转换器可能更有效。例如，可以选择3.5兆赫的转换器(20mm弯曲排列型)来与气体填充的脂质体的共振频率一致。采用这种转换器，可传递101.6毫瓦/cm2至聚焦点，并且开至多普勒式会增加能量输出(SPTA)至1.02瓦/cm2。
为使用气蚀现象来释放和/或活化脂质体内的药物/前药，可使用较低频率能量，因为在较低频率气蚀发生更有效。用较高电压(高达300伏)驱动0.757兆赫的转换器，气体填充的脂质体溶液的气蚀将于约5.2大气压的阀值出现。
表Ⅱ显示从普通使用的仪器的诊断超声传送到组织的能量范围。仪器如Piconics Inc.(Tyngsboro,MA)产的接收器脉冲装置1966型661的Portascan一般目的扫描仪；Picker(Cleveland,OH)产的包括80C系统的Echoview 8LScanner或Medisonics(Mountain View,CA)的Model D-9 Versatone Bidirectional Doppler。通常，脉冲重复中所采用的能量范围对诊断和监控气体填充的脂质体是有用的，但对本发明脂质体的破裂无效。
诊断设备产生的能量和强度*<
>*数值来自Carson等的，Ultrasound in Med.& Biol.1978,3,341-350一文，该文的公开全部并入本文作为参考。
如普通采用于治疗超声的较高的能量对活化含治疗剂的气体填充的脂质体是优选的。通常，根据用超声加热的组织区域，治疗超声仪器采用多达50％至100％的占空因数。带较大量肌肉块(即，背、股)的区和高度血管化的组织如心脏会需要较大的占空因数，例如100％。
在超声诊断中，使用一种或几种声波脉冲而且该仪器在脉冲到接受反射的声音信号之间要暂停。超声诊断中使用的有限数量的脉冲限制了传递到被成像组织的有效能量。
在超声治疗中，使用连续的超声波来传递高水平的能量。在使用本发明的脂质体时，声波能量可以是脉冲的，但优选连续的超声波。如果使用脉中，声波优选一次以至少约8个回声序列长度脉冲，并且优选至少20个脉冲。
可以使用固定的频率或调频的超声。将固定的频率定义为声波的频率在时间段内是恒定的。调频则是声波的频率在时间段内是变化的，例如由高到低(PRICH)或由低到高(CHIRP)。例如，声能的起始频率为10MHz的PRICH脉冲偏到1MHz且能量从1增到5瓦特。总而言之，调频，高能的超声能量可在脂质体范围内增加局部气体膨胀和破裂的速度来产生治疗剂的局部传递。
所使用的声波频率可在约0.025到约100兆赫之间变化。优选的频率范围约为0.75-3兆赫，最优选的频率范围为约1-2兆赫。通常治疗时可使用约0.75到约1.5兆赫的频率。通常也可使用约3到7.5兆赫的诊断频率。对于很小的脂质体，如低于0.5微米的平均外径，由于这些较小的脂质体在较高的声波频率时更有效地吸收声能，因此优选使用较高频率的声波。当使用很高的频率时，如超过10兆赫，声能通常会限制渗透到(流)体液和组织的深度。外用可优选皮肤和其它表面组织，但对于深结构，可优选通过组织间隙探针或血管内超声导管来使用声能。
用气体填充的脂质体来传递药物时，可将被传递的治疗药物化合物按需嵌入脂质体的壁中，包囊在脂质体中和/或连结到脂质体上。本文所使用的与治疗化合物的部位有关的短语“连结”或其变化形式的意思是指治疗化合物以某种方式连接到微球的壁的内部和/或外部，如通过共价或离子键或其它化学或电化学键的方式或相互作用的方式连结。本文所用的与治疗化合物的部位有关的短语“包囊”或其变化形式是指治疗化合物位于微球内的空隙中。本文所使用的与治疗化合物的部位有关的短语“嵌入”或其变化形式是指治疗化合物位于微球壁内。短语“含有治疗物”指以各种形式使治疗物置于微球中。因此，治疗物的位置是可变的，例如，包裹在气体填充的微球体的空隙中，位于气体和气体填充的微球内壁之间。结合在气体填充的微球的外表面和/或网在微球结构本身中。
任何一种治疗剂都可包囊在脂质体中。本文所使用的治疗剂意指对病人具有有益效果的试剂。本文所使用的术语治疗剂与术语药物是同义的。
可用气体填充脂质体传递的药物的实例可包含以传递药物为目的，但不局限于此，激素产品如加压素和催产素及其衍生物，胰高血糖素，和甲状腺剂如碘产品和抗甲状腺剂；心血管产品如螯合剂和汞利尿剂和强心甙；呼吸产品如黄嘌呤衍生物(茶碱和氨茶碱)；抗感染剂如氨基糖甙，抗真菌剂(二性霉素)，青霉素和头孢菌素抗生素，抗病毒剂如齐多夫定，利巴韦林，金刚烷胺，阿糖腺苷和阿昔洛韦，抗蠕虫剂(anti-helmintic)，抗疟剂和抗结核药；生物产品如免疫血清，抗毒素和抗蛇毒血清，狂犬病预防产品，细菌疫苗，病毒疫苗，类毒素；抗肿瘤剂如nitrosureas，氮芥，抗代谢物(氟尿嘧啶，激素如progesings和雌激素和抗雌激素剂)；抗生素如放线菌素；有丝分裂抑制剂如依托泊甙和长春生物碱(the Vinca alkaloids)，放射药物如放射活性碘和磷产品；以及干扰类、羟基脲、甲基苄肼、氮烯咪胺、米托坦、天冬酰胺酶和环孢子菌素。
在气体安置过程中，可将遗传和生物活性物质混入这些脂质体气体填充空间内或混入这些颗粒的质膜内或脂膜上。优选结合在这些颗粒的表面上。可将具有高的辛醇/水分配系数的遗传物质和生物活性产品直接混入包裹气体的类脂层中但优选结合在气体填充脂质体球的表面上。要达到这样的目的，通常需将能结合遗传物质或生物活性物质的基团键合在结合这些物质的类脂层中。在使用遗传物质(DNA、RNA，单股和双股和反义和有意寡聚核苷酸)时，通过使用可混合到干类脂起始材料中的阳离子类脂或阳离子聚合物，很容易达到这个目的。
其它合适的治疗剂包括但不局限于抗肿瘤剂，如铂化合物(如，螺铂、顺铂和卡铂)，甲氨喋呤、阿霉素、紫杉酚、丝裂霉素、ansamitocin、博米霉素、阿糖胞苷、阿糖腺苷、巯基多熔素、长春新碱、马利兰、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥(如，PAM、L-PAM或苯丙氨酸芥子)、巯基嘌呤、米托坦、盐酸丙卡巴肼、放线菌素D(actinomycin D)、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、丝裂霉素、普卡霉素(mithramycin)、氨鲁米特、雌莫司汀磷酸钠、氟他胺、乙酸亮丙瑞林乙酸甲地孕酮、柠檬酸他莫昔芬、睾内酯、曲洛司坦、安吖啶(m-AMSA)、门冬酰胺酶(L-asparaginase)Erwina asparaginase，依托泊甙(VP-16)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、替尼泊甙(VM-26)、硫酸长春碱(VLB)、硫酸长春新碱、博来霉素、硫酸博来霉素、甲氨喋呤、阿霉素、和arabinosyl；血液产品如非肠道铁剂、氯化血红素，血卟啉及其衍生物；生物应答改良剂如胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、微生物细胞壁成分，淋巴细胞活素(如，细菌内素如脂多糖，巨噬细胞激活因子)，细菌亚单位(如，分枝杆菌、棒状杆菌)，合成的二肽N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺；抗真菌剂如酮康唑、制霉菌素、灰黄霉素、氟胞嘧啶(5-FC)、米康唑、两性霉素B、蓖麻素和β-内酰胺抗生素(如，sulfazecin)；激素如生长激素、促黑素细胞激素、雌二醇、二丙酸氯地米松、倍他米松、醋酸倍他米松和磷酸倍他米松钠、vetamethasone disodium phos-phate、vetamethasone sodium phosphate、醋酸可的松、地塞米松、醋酸地塞米松、磷酸地塞米松钠、9-去氟肤轻松(flunsolide)、氢化可的松、醋酸氢化可的松、氢化可的松环戊丙酸酯、磷酸氢化可的松钠、琥珀酸氢化可的松钠、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、琥珀酸甲泼尼龙钠、醋酸帕拉米松、泼尼松龙、醋酸泼层松龙、磷酸泼尼松龙钠、氢化泼尼松特丁酸酯、泼尼松、曲安西龙、曲安奈德、二乙酸曲安西龙、己曲安奈德和醋酸氟氢可的松；维生素如Cyanocobalamin neinoicacid,retinoids及衍生物如维生素A棕榈酸酯、和α-生育酚；肽，如超氧化锰二变位酶(manganese super oxide dimu-tase)；酶如碱性磷酸酯酶；抗过敏剂如amelexanox；抗凝剂如苯丙香豆素和肝素；循环系统药物如心得安；代谢增强剂如谷胱甘肽；抗结核剂如对氨基水杨酸、异烟肼、硫酸缠霉素、环丝氨酸、盐酸乙胺丁醇、乙硫异烟胺，吡嗪酰胺、利福平和硫酸链霉素；抗病毒剂如阿昔洛韦、金刚烷胺、齐多夫定(AZT或azidothymidine)、利巴韦林和阿糖腺苷一水合物(adenine arabinoside,ara-A)；抗心绞痛药如地尔硫草、硝苯地平、维拉帕米、丁四硝酯、硝酸异山梨酯、三硝酸甘油酯和戊四硝酯；抗凝剂如苯丙香豆素、肝素；抗生素如氨苯砜、氯霉素、新霉素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢拉定、红霉素、克林霉素、林肯霉素、阿莫西林、氨苄西林、巴安西林、羧苄西林、双氯西林、氨环己西林、picloxacillin、海他西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、替卡西林、利福平和四环素；抗炎剂如二氟尼柳、布洛芬、吲哚美辛、甲氯芬那盐、甲芬那酸、萘普生、羟布宗、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、阿斯匹林和水杨酸盐；抗原生动物剂如氯喹、羟基氯喹、甲硝唑、奎宁和锑酸葡甲胺(meglu-mine antimonate)；抗风湿药如青霉胺；麻醉药如复方樟脑酊；鸦片制剂如可待因、海洛因、美沙酮、吗啡和鸦片；强心甙如去乙酰毛花甙、洋地黄毒甙、地高辛、洋地黄甙和洋地黄；神经肌肉阻断剂如阿曲库铵苯磺酸盐、加拉磺铵、乙芴溴铵、碘二甲箭毒、泮库溴铵、氯琥珀胆碱(succinyl choline chlo-ride)、氯化筒箭毒碱和维库溴铵；镇静药(催眠药)如异戊巴比妥、异戊巴比妥钠、阿普比妥、仲丁比妥钠、水合氯醛、乙氯维诺、炔己蚁胺、盐酸氟西泮、格鲁米特、盐酸左美丙嗪、甲乙哌酮、盐酸咪达唑它、副醛、戊巴比妥、戊巴比妥钠、苯巴比妥钠、司可巴比妥钠、他布比妥、替马西泮和三唑它；局麻药如盐酸卡因、盐酸氯普鲁卡因、盐酸依替卡因、盐酸利多卡因、盐酸甲呱卡因、盐酸普鲁卡因和盐酸丁卡因；全身麻醉药如氟哌利多、依托咪酯、柠檬酸芬太尼与氟哌利多、盐酸氯胺酮、美索比妥钠和硫喷妥钠；及放射性粒子或离子如锶、碘化物、铼和钇。
在某些优选的实施方案中，治疗剂为单克隆抗体，如能够与黑素瘤抗原结合的单克隆抗体。
其它优选的治疗剂包括遗传物质如核酸、RNA和DNA，他们是天然或合成得到的，包括重组RNA和DNA及反意RNA和DNA。可使用的遗传物质的类型包括例如载于表达载体如质粒、噬菌体质粒(phagemids)、装配型质粒、酵母人工染色体(YACs)上的基因，和缺陷性病毒或“辅助”病毒，抗原核酸、单股和双股RNA和DNA及其类似物，如硫代磷酸酯和硫代磷酸酯低聚核苷酸。另外，可将遗传物质与例如蛋白质或其它聚合物混合。
可用于本发明脂质体中的遗传治疗剂的例子包括至少编码一部分HLA基因的DNA、至少编码一部分营养不良素(dystrophin)的DNA，至少编码一部分CFTR的DNA，至少编码一部分IL-2的DNA，至少编码一部分TNF的DNA，能与至少编码一部分Ras的DNA结合的反义寡聚核苷酸。
编码某些蛋白质的DNA可用于治疗许多不同类型的疾病。例如，可用腺嘌呤核苷脱氨酶治疗ADA缺乏；可用肿瘤坏死因子和/或白细胞介素-2治疗晚期癌；可用HDL受体治疗肝脏疾病；可用HLA-B7治疗恶性黑瘤，可用白细胞介素-2治疗成神经细胞瘤、恶性黑素瘤或肾癌；可用白细胞介素-4治疗癌症；可用HIV env治疗HIV感染；可用反义ras/p53治疗肺癌；以及可用凝血因子Ⅷ治疗血友病B。例如，参见Science 258,744-746。
如果需要，可将多种治疗剂置于脂质体中。例如，单个脂质体中可含有多种治疗剂或者可一起给予含有不同治疗物的脂质体。作为实例，可同时给予能与黑素瘤抗原结合的单克隆抗体和至少编码一部分IL-2的寡聚核苷酸。本文中所使用的短语“至少一部分”意思是指寡聚核苷酸不需要代表整个基因，只要其所表示的那部分基因能有效地阻断基因的表达。
类似地，可将药物前体包囊在脂质体中，并且药物前体被包括在本文所使用的术语治疗剂的范围之内。本技术领域中，药物前体是熟知的，包括未激活的药物前体，当暴露在高温、代谢酶、气蚀和/或压力下，在氧或其它物质存在下，或当从脂质体中释出时，这些药物前体将形成活性药物。在本发明方法中，当超声使用含前体药物的脂质体时，在气蚀、加热、加压和/或从脂质体中释放时，这些药物前体能被激活。合适的药物前体对本领域技术人员是显而易见的，例如在Sin Kula等J.Pharm.Sci.1975 64,181-210中进行了描述，由该文所公开的全部内容都引入本文供参考。
例如，药物前体可包括活性药物的未活化形式，其中药物前体上存在有延缓活化和/或改变药物的溶解性或其它特性的化学基团。在这种形式时，通常药物前体是未活化的，但是当通过加热、气蚀、加压和/或通过周围环境中的酶或其它物质从药物前体中除去该化学基团时，即可产生活性药物。本技术领域中详细描述了这些药物前体，并且包括各种各样通过键与化学基团结合的药物，如与短、中等或长链脂肪族碳酸酯形成的酯、有机磷酸的半酯、焦磷酸酯、硫酸酯、酰胺、氨基酸、偶氮键、氨基甲酸酯、磷酰胺、葡糖苷酸、N-乙酰葡糖胺和β-葡糖苷。
具有母体分子和可逆修饰或连结的药物的实例如下具有酮缩醇的铃兰毒甙，具有烷基酯的乙内酰脲、具有甘油或丙氨酸酯的氯苯甘油醚、具有咖啡因复合物的扑热息痛、具有THAM盐的乙酰水杨酸，具有乙酰氨基酚酯的乙酰水杨酸，具有硫酸酯的纳洛酮，具有甲基酯的15-甲基前列腺素F2α，具有聚乙二醇的普鲁卡因，具有烷基酯的红霉素，具有烷基酯或磷酸酯的氯洁霉素，具有甜菜碱盐的四环素，具有环取代的酰氧苄基酯的7-酰基氨基头孢菌素，具有苯基丙酸癸酸酯的诺龙，具有烯醇醚乙缩醛的雌二醇，具有乙酸酯的甲基强的松龙，具有n-乙酰氨基葡糖苷葡糖苷酸(三甲基硅烷基)醚的睾丸酮，真有21-磷酸酯的可的松或强的松龙或地塞米松。
药物前体也可设计为可逆的药物衍生物并用作修饰剂来增强药物转运到特定部位的组织。具有可逆修饰或连结以使药物转运到特定部位组织并增强治疗效果的母体分子的实例包括具有卤代烷基亚硝基脲的异氰酸酯，具有丙酸酯的睾丸酮，具有二烷基酯的氨甲喋呤(3,5′-二氯氨甲喋呤)，具有5′-酰化的阿糖胞苷，氮芥(2,2′-二氯-N-甲基二乙基胺)，具有氨基甲基四环素的氮芥，具有胆甾醇或雌二醇或脱氢异酮酯的氮芥和具有偶氮苯的氮芥。
作为一个本领域的技术人员会意识到，可选择一个特定的修饰所给出的药物的化学基团来影响药物在脂质体膜中或空间中的分配。可选择能选择性地连结化学基团与药物的键来产生理想的代谢速度，如，在酯键情况下，从气体填充的脂质体中释出后，在血清酯酶存在下水解。另外，可选择特定的化学基团来影响在本发明气体填充的运载药物脂质体中所用的药物的生物分布，如具有环磷酰胺的N,N-二(2-氯乙基)-二氨基磷酸分布到卵巢腺癌中。
另外，可设计气体填充脂质体中所用的药物前体含有可逆的衍生物，它用来改良活性产生的期限，延长或贮存作用效果。例如，可用葡聚糖和羧甲基葡聚糖酯修饰烟酸，用藻酸盐修饰链霉素，用双羟萘酸盐修饰二氢链霉素，用5′-adamantoate酯修饰阿糖胞甙(ara-C)，用5-棕榈酸酯和5′-苯甲酸酯修饰阿糖腺苷(ara-A)，用甲基酯修饰两性霉素B、用17-β-烷基酯修饰睾丸酮，用甲酸酯修饰雌二醇，用2-(4-咪唑基)乙胺盐修饰前列腺素，用氨基酸酰胺修饰多巴胺，用单一和双(三甲基硅烷基)醚修饰氯素，和用双羟萘酸盐修饰环氯胍。在这种形式时，长期作用的药物贮存库可在体内从气体填充的载有药物前体的脂质体中释放出来。
另外，可使用通常热不稳定的化合物来产生无毒基团化合物。优选高温分解如上所述具有偶氮键，过氧化物和二硫键的化合物。在这种形式的药物前体下，由高能量的声波与气体填充的脂质体相互作用引起的气蚀和/或温度增加激活化合物中的偶氮，过氧化物和二硫键而由这些包裹在其中的药物前体产生串联的游离基。多种药物或化学物质都可构成这些药物前体，如偶氮化合物，通式为R-N=N-R的化合物，其中R为烃链，两个氮原子之间双键可在体内反应产生游离基产物。
可用来产生游离基产物的药物或化合物的实例包括含偶氮的化合物如偶氮苯，2,2′-偶氮二异丁腈、偶氮二酰胺、石蕊精、氮霉素、azosemide、偶氮磺酰胺、氧化偶氮苯、aztre-onam、苏丹Ⅲ、磺胺柯衣定、磺氨基柯衣定和磺胺水杨嗪，含二硫键的化合物如sulbentine、二硫胺、硫藤黄菌素、二硫化四甲秋兰姆，含过氧化物的化合物如过氧化氢和过氧化苯甲酰、2,2′-偶氮二异丁腈、2,2′-偶氮二(2-酰氨基丙烷)二盐酸盐和2,2′-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)。
用氧气填充的充气脂质体会产生气蚀的广泛的游离基。而且过渡金属离子，特别是锰、铁和铜能增加由氧形成活性氧中间体的速度。在脂质体中包裹金属离子，可增加体内游离基的形成。可将这些金属离子以游离盐、配合物如与ED-TA、DTPA、DOTA或desferrioxamine，或以金属离子氧化物的形式混入脂质体中，另外，衍生的金属离子复合物可结合到脂质的前部基团，或离子的亲脂复合物例如可结合到脂质双层中。当热刺激时，如气蚀，这些金属离子将增加形成活性氧中间体的速度。而且，可将放射敏感剂如2-甲基-5-硝基-1-咪唑基-乙醇和misonidazole混合在气体填充的脂质体中来在热刺激下产生游离基。
作为使用药物前体的例子，可通过易于在体内被血清活性酶清除的酯键，将酰化的化学基团与药物结合。该酰化的药物前体被混合在本发明气体填充的脂质体中。当用超声所产生的声波脉中来中击气体填充的脂质体时，由脂质体包裹的药物前体将暴露于血清中。血清中的酯酶消除酯键，因此产生药物。
类似地，超声不仅可用来破裂气体填充的脂质体，而且可产生热效应，它可增加化学清除的速度并由药物前体释放活性药物。
脂质体也可以设计，以便使药物在脂质体的内部和外面具有对称或不对称的分布。
可选择或修饰治疗物的特定化学结构来达到所需的溶解性，这样治疗剂可被包裹在脂质体气体填充空间内，连结在脂质体上或网在脂质体中。表面结合的治疗剂可携带一种或多种酰基键，这样，当经气蚀而冲击或加热或破裂气泡时，酰化的治疗剂离开表面和/或治疗剂可从酰基键化学基团中被除去。类似地，可将其它治疗剂配制芳族或甾族结构的疏水基团来使其结合到脂质体的表面。
下列实施例更进一步地描述本发明，这些实施例说明制备和试验气体填充的脂质体。下列实施例不会对所附的权利要求的范围构成限制。实施例实施例1制备气体填充的脂质体将50mg的1,2-二棕榈酰-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱(分子量734.05，粉末，批号160pc-183).(Avanti-Po-lar Lipids,Alabaster,AL)称重并在离心管中用5.0ml的盐溶液(0.9％氯化钠)或磷酸盐缓冲盐(0.8％氯化钠，0.02％氯化钾，0.115％磷酸氢二钠，0.02％磷酸二氢钾，PH调至7.4)。然后在涡旋器上(Scientific Industries,Bohemi-a,NY)在6.5的仪器沉降位置振荡水合的悬浮液10分钟。记录总体积为12ml。盐溶液从5.0ml减小到约4ml。
用光学显微镜来估量经过这种新方法的气体填充脂质体的大小。测得脂质体最大的尺度从约50到约60μm并且可见的最小尺度约8μm。平均大小范围为约15至约20μm。
经过在Swin-Lko过滤架上的10或12μm的“核微孔”膜(Nuclepore Filtration Products,Costar Corp.,Cambridge,MA)和20cc注射器(Becton Dickinsion &Co.,Rutherford,NJ)，过滤气体填充的脂质体。膜为10或12μm的“核微孔”膜(Nuclepore Filtration Proclucts,Costar Corp.,Cambridge,MA)。将10.0μm的过滤器安装在Suin-Lok过滤架上并将盖牢牢地压紧。将脂质体溶液振荡起来并经18号针转移到200cc注射器中。将大约12ml的脂质体溶液放入注射器中，并将注射器拧在Suin-Lok过滤架上。倒置安装注射器和过滤架，这样，大量气体填充的脂质体泡可以升至顶部。然后轻轻地上推注射器并用此方法来过滤气体填充脂质体。
经过10.0μm过滤器压出后的气体填充脂质体残存率(挤压过程后残留的气体填充脂质体的量)为约83-92％。用手压出前，泡沫的体积为约12ml。并且水溶液的体积约为4ml。用手压出后，泡沫的体积约为10-11ml并且水溶液的体积约为4ml。
再次使用光学显微镜来测定挤压的气体填充脂质体的大小分布。测得脂质体最大的尺寸从约25到约30μm。并且可见的最小尺度约为5μm。平均大小范围约8至约15μm。
发现过滤后，90％以上的气体填充脂质体小于15μm。实施例2冷冻干燥法制备气体填充脂质体将50mg的1,2-二棕榈酰-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱(分子量734.05，粉末)(Avanti-Polar Lipids,Al-abaster,AL)称重并放入离心管中。然后用5.0ml的盐溶液(0.9％NaCl)水合。并在6.5的仪器的沉降位置涡旋10分钟。涡旋后，将全部溶液在液氮中冷冻。然后将样品放列冻干器上冷冻干燥。将样品在冻干器上保持18小时。将干燥的类脂从冻干器上取下并在5ml的盐溶液中再水合并在6.5的沉降位置涡旋10分钟。用移液管取少量该溶液放到载玻片上并在显微镜下观察。测定气体填充脂质体的大小。测得最大的脂质体尺寸约为60μm并且可见的最小尺度约为20μm。平均大小从约30到约40μm。实施例3高于类脂相变温度下的气体填充脂质体制备的实例将50mg的1,2-二棕榈酰-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱(分子量734.05，粉)(Avanti-Polar Lipids,Alabaster,AL)称重并放入离心管中。将大约2英尺的乳胶管(0.25英寸内径)象线圈一样缠绕在锥形离心管周围。然后用电线将乳胶管扎牢在离心管上。将乳胶管连接在恒温循环水浴上(VWR Scientific Model 1131)。将水浴的温度定在60℃并让循环水高速环绕通过离心管。将温度计放在类脂物溶液中并可见在42°和50℃之间。
在6.5的涡旋仪沉降位置，将类脂溶液涡流10分钟。可以看到极小量的类脂泡沫(相变温度=41℃)不形成气体填充脂质体。光学显微镜展示了溶液中具有大量的类脂颗粒。在此温度下形成的气体填充脂质体的数量少于在低于相变温度下形成的数量的3％。将溶液静置15分钟直到溶液温度平衡到室温(25℃)。然后将溶液涡旋10分钟。10分钟后，可见气体填充脂质体形成。实施例4冰冻-融化法制备气体填充脂质体将50mg的1,2-二棕榈酰-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱(分子量734.05，粉末)(Avanti-Polar Lipids,Al-abaster,AL)称重并放入离心管中。然后用5.0ml 0.9％NaCl水合。在6.5的仪器沉降位置将类脂的水溶液涡旋10分钟。涡旋后，将全部溶液在液氮中冰冻。然后将全部溶液在室温下(25℃)，在水浴中融化。将冰冻-融化过程重复8次。然后在6.5的仪器沉降位置，将水合的悬浮液涡旋10分钟。然后可见如实施例1所述的气体填充脂质体。实施例5用乳化剂(十二烷基硫酸钠)来制备气体填充脂质体准备两支离心管，每支含有50mg的DPPC。其中一只离心管中加入1摩尔％(约0.2mg的Duponol C批号2832)的十二烷基硫酸钠，另一只加入10摩尔％(2.5mgDuponol C批号2832)。两支离心管中分别加入5ml 0.9％NaCl。并在液氮中冰冻并冻干约16小时。从冻干器上取下两样品并分别加入5ml盐水。在6.5的位置，将两支管子涡旋10分钟。
测得加1摩尔％十二烷基硫酸钠的气体填充脂质体的最大尺寸为约75μm并且可见的最小尺寸为约6μm。平均大小约从15到40μm。测得加10摩尔％十二烷基硫酸钠的气体填充脂质体的最大尺寸为约90μm并且可见的最小尺寸为约6μm。平均大小约从15到35μm。
在含1摩尔％十二烷基硫酸钠的气体填充脂质体溶液中，其泡沫体积约为15ml并且其水溶液的体积约为3-4ml。在含10摩尔％十二烷基硫酸钠的气体填充脂质体溶液中，其泡沫体积也约为15ml并且其水溶液的体积约为3-4ml。实施例6测定气体填充的脂质体是否可由声处理产生将50mg的1,2-二棕榈酰-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱(A vanti-Polar Lipids,Alabaster,AL)称重并用5ml0.9％NaCl水合。代替涡旋，用Heat Systems Sonicator Ul-trasonic Processor XL(Heat Systems,Inc.,Farming-dale,NY)Model XL 2020声处理溶液。将频率为20KHz的声处理器调至其旋扭为4的位置并发出连续波。用管尖声处理10分钟。声处理后，在光学显微镜下观察溶液。没有气体填充脂质体已经产生的迹象。
接着，除去声处理器的管尖并用声处理器提供的尖帽代替。制备另一份溶液(每5ml盐水中含50mg类脂)并用这种管尖声处理。10分钟后，在光学显微镜下观察溶液，仍无气体填充脂质体的迹象。实施例7测定浓度对气体填充脂质体产生的作用本实施例测定了低浓度限的类脂是否会终止气体填充脂质体的产生。将10mg的1,2-二棕榈酰-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱(Avanti-Polar Lipids,Alabaster,AL)加到10ml盐水中。在6.5位置将类脂/盐溶液涡旋10分钟。在光学显微镜下观察溶液来测量粒子大小。测得脂质体最大的尺寸约为30至40μm并且可见的最小尺寸约为7μm平均大小从约30到约45μm。
气体填充脂质体似乎更易破碎，因为它们显示遭受破裂比前面所述的更快。因此可见，类脂的浓度是影响气体填充脂质体产生和稳定性的因素。实施例8阶式过滤将未过滤的气体填充脂质体吸入50ml注射器中并通过至少间隔150μm的阶式“核微孔”10μm滤器和8μm滤器(图3和4)。或者，例如，将样品通过许多彼此紧密相连的10μm和8μm滤器来过滤。气体填充脂质体在流速为2.0ml/min的压力下通过滤器。随后测定过滤的气体填充脂质体中气体填充类脂脂质体的产率，其得到未过滤体积的80-90％。
通过四种不同的测定脂质体大小分布的方法来筛分产生的气体填充脂质体大小。用Particle Sizing Systems Mod-el 770,Optical Sizing unit,a Zeiss Axioplaen Optical mi-croscope in terfaced to image processing Software manfac-tured by Universal Imaging，和a Coulter Counter(CoultorElectronics Limited,Lutor,Beds.,England)进行筛分。如图5和6所见，与未过滤气体填充脂质体相比，该气体填充脂质体的大小更均匀地分布在8-10μm。因此可见，过滤的气体填充脂质体大小更均匀。实施例9制备过滤的DPPC悬浮液将250mg DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)和10ml 0.9％NaCl加到50ml Falcon离心管中(Becton-dickinson,Lin-coln Park,NJ)并保持在室温(约20℃)。在氮气压力下，将悬浮液压出通过1μm核微孔(Costar,Pleasanton,CA)聚碳酸酯膜。在Particl Sizing Systems(Santa Barbara,CA)Model 370激光灯散射拣理器上筛分产生的悬浮液中粒子的大小。所有类脂粒子平均外径为1μm或更小。
另外，将相同量的DPPC悬浮液以18,000p.s.i.的压力5次通过MicrofiuidicsTM(Microfluidics Corporation,Newton,MA)微流化器。将变得不太稠的悬浮液在ParticleSizing Systems(Santa Barbara,CA)Sub micron ParticleSizer,Model 370激光灯散射拣理器上筛分大小，可见粒子大小均匀地小于1μm。已知经微流化悬浮液的粒子大小可保持稳定6个月。实施例10制备过滤的DSPC悬浮液将100mgDSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)和10ml 0.9％NaCl加到50ml Falcon离心管中(Becton Dickinson,,Lin-coln Park,NJ)。然后，在氮气压力下，以300-800 p.s.i的压力将悬浮液压出通过1μm“核微孔”(Costar,Pleasanton,CA)聚碳酸酯膜。产生的悬浮液在Particle Sizing Systems(Santa Barbara,CA)Sub Micron Partids Sizer Moelel 370激光灯散射拣理器上筛分大小。发现所有粒子的大小都为1μm或更小。
另外，将同样量的DPPC悬浮液，以18,000p.s.i.的压力5次通过MicrofiuidicsTM(Microfluidics Corporation,Newton,MA)微流化器。将变得不太稠的悬液在Sub Mi-cron Particle Sizer Systems Model 370激光灯散射拣理器上筛分大小并发现其大小均匀地小于1μm。实施例11通过压热器处理来进行过滤的类脂悬浮液的灭菌将前面实施例9和10筛分大小的DPPC和DSPC悬浮液在Barnsteadl Model C57835压热器(Barnsteadl/Ther-molyne,Dubuque,IA)中压热处理20分钟。平衡到室温后(约20℃)，用灭菌的悬浮液来滴注。实施例12经涡旋将气体滴注到过滤的在压热器中处理的类脂中将先前已压出通过1μm滤器和压热器处理20分钟的，以25mg/ml量溶在0.9％NaCl中的10ml 1,3-二棕榈酰磷脂酰胆碱溶液加到Falcon 50ml离心管中(Becton-Dickin-son,Lincoln Park,New Jersey)。将类脂悬浮液平衡到室温后(约20℃)，将液体在VWR Genie-2(120V,0.5安培，60Hz)(Scientific Industries Inc.,Bohemia,NY)上涡旋10分钟或直到整个气体填充脂质体的容积至少为原类脂水溶液体积的二倍或三倍。在离心管底部的溶液几乎完全没有无水的颗粒类脂，并产生了较大容积的含气体填充脂质体的泡沫。因此，预先压热器处理不影响类脂悬浮液形成气体填充脂质体的能力。压热器处理不改变脂质体的大小并且不减小类脂形成气体填充脂质体的能力。实施例13经振荡器摇床的振荡，将气体滴注到过滤的，经压热器处理的类脂中将前面挤压通过1μm滤器并压热器处理20分钟的，以26mg/ml量溶在0.9％NaCl中的10ml 1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱溶液加到Falcon 50ml离心管中(Becton-Dickin-son,Lincoln Park,NJ)。类脂悬浮液平衡到室温后(约20℃)，将离心管垂直放在VMR Scientific Orbital振荡器上(VMR Scientific,Cerritos,CA)并以300 r.p.m速度振荡30分钟。振荡器摇床上产生的搅拌作用产生了气体填充脂质体。实施例14经过用振摇器荡床的振荡和用油漆混合器的振荡，将气体滴注到过滤的，压热器处理的类脂中将前面压出通过1μm滤器并压热器处理20分钟的，以25mg/ml量溶在0.9％NaCl中的10ml 1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱溶液加到Falcon离心管中(Becton-Dickinson,Lincoln Park,NJ)。类脂悬浮液平衡到室温后(约20℃)，将离心管固定在1加仑空的家用油漆容器中并随后放在机械油漆混合器中，回转运动15分钟。强力混合后，取出离心管，并可见气体填充脂质体已形成。实施例15经手振荡，将气体滴注到过滤的，经压热器处理的类脂中将前面压出通过1μm核微孔滤器并压热器处理20分钟的，以25mg/ml量溶在0.9％NaCl中的10ml 1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱溶液加到Falcon 50ml离心管中(Becton-Dickinson,Lincoln Park,NJ)。类脂悬浮液平衡到室温后(约20℃)，用手用力振荡离心管10分钟。停止搅拌后，气体填充的脂质体形成。实施例16经过阶式或堆积滤器按大小过滤经压热器处理的气体填充脂质体如实施例12所述，从DPPC可制备气体填充脂质体。将产生的未过滤的脂质体吸入50ml注射器中并通过含“核微孔”(Coster,pleasanton,CA)10μm滤器和至少间隔150μm的8μm滤器的阶式滤器系列。另外，在分离样品时，可使用堆积在一起的10μm和8μm过滤集，这两种滤器彼此紧密连接。气体填充的脂质体以使其过滤速度为2.0ml/min的压力通过滤器。过滤的气体填充脂质体的容积为未过滤容积的80-90％。
通过4种不同的测定脂质体大小分布的方法来筛分产生的气体填充脂质体的大小。用Particle Sizing Systems(Santa Barbara,CA)Model 770 Optical Sizing unit，和Zeiss(Oberkochen,Germany)Axioplan optical micro-scope interfaced to image processing software(UniversalImaging,West Chester,PA)和Coulter Counter(CoulterElectronics Limited,Luton,Beds.,Englanel)来筛分大小。如图8所述，气体填充脂质体的大小与未过滤的气体填充脂质体相比更均匀地分布在8-10μm。
除了在此已描述的那些以外，本发明的各种改进对本领域技术人员来说是显而易见的。这些改进也将落入所附的权利要求的范围之内。
权利要求
1．一种制备气体填充的类脂微球体的方法，此方法包括在气体存在时，在低于类脂的凝胶态到液晶态相转变温度下振荡含有类脂的水溶液。
2．根据权利要求1的方法，其中振荡步骤包含涡旋。
3．根据权利要求1的方法，其中进一步包含过滤和加热消毒所述的类脂水溶液。
4．根据权利要求1的方法，其中进一步包含通过至少一种选择的孔大小的滤器压出过滤微球体。
5．根据权利要求4的方法，其中孔大小约为10μm或更小。
6．根据权利要求1的方法，其中进一步包含水合干燥类脂，以形成含类脂的水溶液。
7．一种制备气体填充的类脂微球体的方法，此方法包括在气体存在时振荡含类脂的水溶液，分离所得的用于诊断或治疗的气体填充的类脂微球体。
8．一种制造气体填充的脂质体微球体的方法，包括步骤为a)将含类脂的水溶液引入容器；b)将气体引入所述的容器；c)在所述的气体存在时振荡所述的类脂水溶液以滴注至少一部分所述的气体进入水溶液中，在充分的强度和持续时间内进行所述振荡以产生含有上述水溶液的气体填充的脂质体；和d)从所述的容器中提取至少一部分所述的含气体填充的脂质体泡沫。
9．根据权利要求8的方法，其中进一步包括冷却所述的水溶液的步骤。
10．根据权利要求9的方法，其中冷却所述水溶液的步骤包括在低于在所说水溶液中的所述类脂凝胶态向液晶态相转变的温度下，冷却所述的水溶液。
11．根据权利要求8的方法，进一步包括向所述的容器加压的步骤。
12．根据权利要求8的方法，进一步包括筛分所述气体填充的脂质体大小的步骤。
13．根据权利要求12的方法，其中筛分所述气体填充脂质体大小的步骤包括控制从所述容器中提取的所述气体填充的脂质体的大小。
14．根据权利要求13的方法，其中经一滤器，通过提取所述的气体填充的脂质体控制从所述容器提取的所述气体填充脂质体的大小。
15．根据权利要求13的方法，通过在所述容器内固定位置，从中提取所述气体填充的脂质体，从而控制从所述容器提取的所述气体填充的脂质体的大小。
16．根据权利要求13的方法，其中通过调整所述容器内的位置控制从所述容器提取的所述气体填充的脂质体的大小，在从所述容器提取所述气体填充的脂质体步骤中，从此位置提取所述气体填充的脂质体。
17．根据权利要求12的方法，其中筛分所述气体填充的脂质体大小的步骤包括使所述提取的气体填充的脂质体通过滤器。
18．根据权利要求12的方法，其中筛分所述气体填充的脂质体的步骤包括控制所述振荡的强度。
19．根据权利要求8的方法，进一步使从所述容器提取的所述气体填充的脂质体流入注射器而不进一步处理的步骤。
20．根据权利要求8的方法，其中振荡所述水溶液的步骤包括在每分钟至少约60次振动的频率下振荡的步骤。
21．根据权利要求8的方法，其中振荡所述水溶液的步骤包括涡旋所述水溶液的步骤。
22．根据权利要求8的方法，其中振荡所述水溶液的步骤包括振荡所述容器的步骤。
23．根据权利要求8的方法，其中振荡所述水溶液的步骤包括用充分的强度振荡所述水溶液以在约不到30分钟内产生所述的含气体填充的脂质体泡沫的步骤。
24．根据权利要求8的方法，其中振荡所述水溶液的步骤包括根据测定所述的含气体填充的脂质体泡沫控制所述振荡的持续时间的步骤。
25．根据权利要求24的方法，其中根据测定所述含气体填充的脂质体的泡沫控制所述振荡的持续时间的步骤包括振荡直至测定到所述泡沫的预测定的体积存在。
26．一种制造气体填充的脂质体的设备，包括a)一种容器；b)使含类脂的水溶液进入所述容器的装置；c)使气体进入所述容器的装置；和d)在所述容器内滴注所述气体进入所述水溶液的装置，因此在所述容器内产生含气体填充的脂质体的泡沫。
27．根据权利要求26的设备，其中所述的引入类脂水溶液的装置包括引入干燥的类脂进入所述容器的装置和引入水溶性介质进入所述容器的装置。
28．根据权利要求27的设备，其中所述引入类脂水溶液的装置进一步包括引入治疗化合物进入所述容器的装置。
29．根据权利要求26的设备，其中所述滴注所述气体进入所述水溶液的装置包括振荡所述水溶液的装置。
30．根据权利要求29的设备，其中所述振荡所述水溶液的装置包括振荡所述容器的装置。
31．根据权利要求29的设备，其中振荡所述水溶液的装置包括涡旋所述水溶液的装置。
32．根据权利要求26的设备，进一步包括冷却所述水溶液的装置。
33．根据权利要求26的设备，进一步包括从所述的容器中提取所述的泡沫的装置。
34．根据权利要求33的设备，其中从所述的容器提取所述泡沫的装置包括调节垂直位置的装置，在此位置，从所述容器中提取所述泡沫。
35．根据权利要求33的设备，其进一步包括使所述提取的气体填充的脂质体流过滤器装配的装置。
36．根据权利要求35的设备，其中所述滤器装配包括分别占居预先确定距离的第一和第二滤器。
37．根据权利要求26的设备，进一步包含筛分所述气体填充的脂质体的大小的装置。
38．根据权利要求26的设备，进一步包括和所述容器相流通的滤器。
39．根据权利要求26的设备，进一步包括加压所述容器的装置。
40．根据权利要求26的设备，进一步包括抽吸从所述容器中产生的所述气体填充的脂质体在不进一步处理情况下全部进入注射器的装置。
41．通过凝胶态振荡气体滴注方法制备的气体填充的脂质体。
42．权利要求10的方法进一步包括加压所述容器的步骤。
43．根据权利要求32的方法，其中冷却所述水溶液的步骤包括在低于所述水溶液中所述类脂从凝胶向液晶相转变温度下冷却所述水溶液。
44．根据权利要求43的方法，进一步包括加压所述容器的步骤。
45．权利要求41的气体填充的脂质体包括至少一种选自以下的类脂，包括二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、和磷脂酸和所述的脂质体进一步包括聚乙二醇。
46．权利要求41的气体填充的脂质体至少包括一种二棕榈酰类脂。
47．权利要求41的气体填充的脂质体，其相转变温度高于约20℃。
48．在权利要求8的方法中，其中所述的容器是一个注射器套管，所述的注射器也至少包括一个滤器和一个针头；所述的提取步骤包括通过从所述套管内通过一个滤器压出所述的脂质体，筛分所述气体填充的脂质体的大小。
49．权利要求8的方法，其中所述的容器是一个注射器套管。
50．权利要求49的方法，其中所述的注射器也包括至少一个滤器和一个针头；所述提取的步骤包括于所述套管内通过一个滤器压出所述脂质体筛分所述气体填充的脂质体的大小。
51．权利要求17的方法，包括抽吸所述脂质体进入注射器，所述注射器包含一个套管、至少一个滤器及一个针头；一旦抽吸所述脂质体进入所述的套管内，所述滤器就筛分所述脂质体的大小。
52．权利要求8的方法，包括压出所述的脂质体进入一个注射器套管，所述注射器也至少包括一个滤器和一个针头；一旦从所述套管内压出所述的脂质体，所述滤器就对所述脂质体的大小进行筛分。
53．权利要求8的方法，其中所述的提取步骤包括抽吸含所述含气体填充的脂质体的泡沫进入注射器，所述注射器包括一个套管、至少一个滤器及一个针头；由此筛分所述脂质体的大小。
54．权利要求33的设备，其中所述的容器是一个注射器套管，所述注射器也包至少含一个滤器和一个针头；所述的提取装置包括于所述套管内通过一个滤器压出所述脂质体筛分所述气体填充脂质体大小的装置。
55．权利要求26的设备，其中所述的容器是一个注射器套管。
56．权利要求55的设备，其中所述的注射器也包含至少一个滤器和一个针头；进一步包括在所述套管内通过一个滤器压出所述脂质体筛分所述气体填充脂质体大小的装置。
57．权利要求26的设备，其中所述容器是一个注射器套管，所述注射器也至少包括一个滤器和一个针头；这里所述的滤器是抽吸所述脂质体进入所述套管筛分所述脂质体大小的装置。
58．权利要求33的设备，其中所述的容器是一个注射器套管，所述注射器也包含至少一个滤器和一个针头；其中滤器是于所述的套管压出所述的脂质体筛分所述脂质体大小的装置。
59．权利要求33的设备，其中所述提取装置包括抽取所述含气体填充的脂质体泡沫的进入注射器的装置，所述注射器包含一个套管、至少一个滤器及一个针头；由此筛分所述脂质体的大小。
60．一种气体填充的脂质体设备，包括一个装有套管的注射器、滤器装配及一个针头，所述滤器装配在所述套管和所述针头之间接合相配，并含至少一个滤器，所述套管含通过凝胶态振荡气体滴注法制备的气体填充的脂质体。
61．权利要求60的设备，其中所述滤器装配是一个阶式的滤器装配，含第一级滤器，有一个侧对针头和一个侧对套管，第二级滤器，在所述的第一级滤器的所述的侧对针头和所述的侧对套管分别有第一和第二金属网盘，在第二金属网盘和所述第二滤器间有一O型环，其中所述第二滤器于所述第一滤器的侧对套管占居约150μm的空间。
62．权利要求61的设备，所述第一滤器和所述第二滤器有孔，所述第二滤器有约10μm的孔，所述第一滤器有一大小约为8μm的孔。
63．权利要求60的设备，其中所述滤器有孔，所述孔有约30nm-约20μm大小范围的孔。
64．权利要求60的设备，其中所述滤器有孔，所述孔的大小约为8μm。
65．权利要求58的设备，有第一滤器和一第二滤器，所述第一滤器和第二滤器有孔，所述第二滤器孔的大小约为10μm，所述第一滤器孔的大小为8μm。
66．权利要求58的设备，其中所述滤器有孔，所述孔大小范围为约30nm-约20μm。
67．权利要求58的设备，其中所述滤器有孔，所述孔的大小约为8μm。
68．权利要求59的设备，有第一滤器和第二滤器，所述第一滤器和所述第二滤器有孔，所述第二滤器孔的大小约为10μm，所述第一滤器孔的大小约为8μm。
69．权利要求59的设备，所述滤器有孔，所述孔的大小范围为约30nm-20μm。
70．权利要求59的设备，其中所述滤器有孔，所述孔的大小约为8μm。
71．权利要求1的方法，在高于环境压力下进行。
72．权利要求7的方法，在高于环境压力下进行。
73．权利要求41的气体填充的脂质体，使用时用喷雾器，所述的脂质体靶定位在肺上。
74．权利要求41的气体填充的脂质体，含有二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，所述脂质体进一步包含聚乙二醇。
全文摘要
描述了制备气体填充的脂质体的方法和设备。通过这些方法制备的气体填充的脂质体特别有用,例如,用于超声显像和治疗药物传送系统。
文档编号A61M5/31GK1215986SQ94192405
公开日1999年5月5日 申请日期1994年5月19日 优先权日1993年6月11日
发明者艾文C·安格尔, 托马斯A·弗里兹, 特里·马斯安纳格, 瓦瑞德瑞简·拉马斯瓦米, 大卫·耶柔赫尔, 吴冠礼 申请人:ImaRx药物公司, 托马斯A·弗里兹, 特里·马斯安纳格