专利名称：制备硫醚轭合物的方法
将细胞毒剂与抗体相连接的双官能化合物是公知的。在介导抗与肿瘤相关的抗原的免疫轭合物的形成中这些化合物一直是特别有用的。这些免疫轭合物可使有毒性的药物选择性释放至肿瘤细胞。参见例如Hermentin和Seiler，“Investigations With Monoclonal Antibody Drug Conjugates，”Behring Insti.Mitl.82197-215(1988);Gallego等人.，“Preparation of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates With Anti-Tumor Activity”.Int.J.Cancer 33737-744(1984);Arnon等人，“In Vitro和In Vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin With Anti-Tumor Antibodies，”Immunological Rev.62∶5-27(1982).
Greenfield等人最近描述了含有酰基肼化合物即3-(2-吡啶基-联硫基)丙酰肼的酸敏感的免疫轭合物的形成，所述酰基肼化合物经酰基腙键轭合至蒽环型药分子的13-酮位，并且描述了该蒽环型药衍生物与抗体分子的轭合作用(Greenfield等人，欧洲专利公告EP0328147，1989年8月16日出版，该专利相应于1988年11月16日提交的未决美国专利申请第07/270，509号和1988年2月11日提交但现已放弃的美国专利申请第07/155，181号)。后一参考文献还公开了具体的含有硫醚的连接物和轭合物，包括含有腙硫醚的免疫轭合物。
Kaneko等人(1990年5月14日提交的美国专利申请第07/522，996号，它是1991年11月21日出版的欧洲专利公告EPA0457250的等同专利)描述了含有蒽环型抗生素的轭合物的形成，该蒽环型抗生素通过蒽环型药分子C-13位上的酰基腙键与双官能连接物相结合。在Kaneko等人的发明中，连接物含有活性吡啶基联硫基或邻硝基苯基联硫基，通过这些基团，连接物与结合在细胞活性配位体上的合适基团反应，形成完整的轭合物。
D.Willner等人1992年1月23日提交的美国专利申请第824，951号(该专利并入本文作为参考)公开了用酸敏感的连接键将治疗上活性药物分子与能识别选定的靶细胞群的配位体相连接，制备治疗上活性轭合物的方法。
按Willner等人的方法形成的轭合物具有通式(I)的结构 其中D是药物部分，n是1～10，p是1～6，Y是O或NH+2Cl-，z是0或1，q是约1～10，x是配位体，和
A是迈克尔加成加合物部分。
在其优选的实施方案中，药物(蒽环型化合物，优选阿霉素)经蒽环型化合物13-酮位上的酰基腙键键合至轭合物的连接物部分。配位体(还原型抗体，优选嵌合型BR96抗体)然后通过连接物(优选马来酰亚氨基)与蒽环型化合物结合。尤其优选的实施方案中，连接键经还原的二硫基(即抗体上游离的巯基(-SH)形成。
按照上述Willner等人的美国专利申请所述，在优选的制备上述轭合物的方法中，配位体MAb-(SH)8上的巯基直接与式(Ⅱb)中间体的迈克尔加成受体(Michael Addition Receptor)反应， 生成最终的轭合物(Ⅰa)，
使用该方法，每一配位体一般可与约1～10个药物分子相连接。因此，式(Ⅰa)中q可以是约1～10。
如Willner等人的美国专利申请所述，依据所用的迈克尔加成受体部分，以方法A中所述的通用方法，使药物(或衍生的药物)与含有迈克尔加成受体的酰肼反应，可以制备式(Ⅱb)的含有腙类药物衍生物的中间体迈克尔加成受体。
方法A 其中D是阿霉素，R是马来酰亚胺部分。
例如使用可用于所述目的的还原剂，例如二硫苏糖醇(“DTT”)，通过还原天然分子(Ⅱ)中的二硫键，可以产生含有巯基的配位体(Ⅲ)(MAb-(SH)8)。
轭合反应完全后，可以使用公知的透析、色谱和/或过滤方法分离和纯化轭合物。含有轭合物的最终溶液可以冷冻干燥，产生可以安全贮存和运输的干松稳定的轭合物。用于给药目的时，冻干的产物最终可用无菌水或另一种适用稀释剂重新配制。另外，最终产物可以例如用液氮冷冻，并在给药前解冻至环境温度。
如Willner等人所述的第一个优选实施方案中，通过使阿霉素与马来酰亚氨基-(C1-C10)-烷基酰肼或其盐反应，制备式(Ⅱb)的阿霉素腙。该反应一般分两步进行。首先制备马来酰亚氨基-(C1-C10)-烷基酰肼或其盐。然后经例如色谱法和/或结晶法纯化后，使酰肼的游离碱或其盐与阿霉素盐反应。反应溶液浓缩后，收集式(Ⅱb)的含有马来酰亚胺的腙反应产物，必要时用标准的纯化技术纯化。
然后使腙与一种配位体(最优选一种抗体)反应，配位体中至少一个二硫键已被还原成至少一个巯基。如下文所述，尤其优选的配位体是一种“松驰抗体”。制备游离巯基的优选还原剂是DTT。
“松驰”抗体是其中一个或多个(或优选四个)二硫键已被还原的抗体。松驰抗体尤其优选是其中至少四个二硫桥已被还原的抗体。优选的制备松驰(即还原的)抗体的方法中，在无氧存在的惰性气氛(例如氮或氩气氛)下，尤其是用DTT进行还原反应，并进行反应产物的纯化。
如Willner等人所述的另一方法中，反应在环境条件下进行，但使用很大量的还原剂(优选DTT)，以克服已还原的二硫键可能发生的任何再氧化。在任一情形中，尽可能在反应完全后就进行产物的纯化，并优选在惰性气氛(例如氩或氮保护层)下操作。然而，优选的制备含有巯基的配位体的方法是这样的方法，即将大气氧从反应中排除。通过任一方法制得的抗体均称作“松驰”抗体。无论哪种方法制得的产物都应尽可能快地用于随后的反应，或者在避免暴露于氧的条件(优选在惰性气氛下)和约0℃下贮存。
从反应中排除氧的方法(即在惰性气氛下进行反应)中，使配位体(抗体)与过量一摩尔的DTT一起保温约30分钟至约4小时(优选约3小时)。依据所需的巯基数量，DTT/配位体的比率范围可以是约1∶1～20∶1，优选为约4∶1～10∶1，尤其优选约5∶1～7∶1。对于有氧存在下进行的还原反应，DTT/配位体的摩尔比率范围为约50∶1～400∶1，优选约200∶1～300∶1。后一反应在约20℃～50℃(优选约37℃)的温度下进行约1～4小时，优选进行1.5小时。在pH为约6～8(优选约7～7.5)时进行反应。然后用标准的纯化技术(例如透析、过滤和/或色谱法)纯化产物。优选的纯化方法为透滤法。在纯化和贮存期间，为防止巯基的再氧化，产物优选保持在避免暴露于氧的惰性气氛和约0℃的条件下。
为制备最终的式(Ⅰa)轭合物，使还原的抗体与式(Ⅱb)腙中间体反应。优选在惰性气氛于约0℃～10℃(优选于约4℃)和约6～8(优选约7.5)的pH条件下进行反应。使用标准技术(例如透析、过滤或色谱法)纯化免疫轭合物或硫醚轭合物。
根据本发明，首先提供了第一种制备相对纯的式Ⅰ结构的硫醚轭合物的方法， 其中n是约1～10的整数，q是约4～10的整数，优选7～9，并且MAb是一种免疫球蛋白(单克隆或多克隆抗体、优选单克隆抗体)配位体，包括BR96抗体;该方法包括下列步骤(a)提供一种在pH为约4～6.5(优选约5～6)的柠檬酸盐缓冲液中的式Ⅱ结构的免疫球蛋白硫醚;
(b)用pH为约6～10(优选约8～10)的磷酸盐缓冲液的溶液处理所述的柠檬酸盐缓冲的免疫球蛋白硫醚(Ⅱ)，得到pH为约6～9(优选约7～8)的免疫球蛋白硫醚的缓冲溶液;
(c)在还原步骤中，在惰性气体(例如氩)气氛下，用pH为约6～10(优选约7～8)的还原剂(优选二硫苏糖醇(DTT))的磷酸盐缓冲溶液处理所述的缓冲的免疫球蛋白硫醚，形成式Ⅲ结构的还原型免疫球蛋白硫醚的缓冲溶液，所得的缓冲溶液pH为约6～9(优选约7～8);
(d)在降低的温度(例如在约-5～25℃，优选约0℃)下，在惰性气氛中，透滤所述还原型免疫球蛋白的溶液;
(e)在透滤纯化步骤期间任意浓缩该还原型免疫球蛋白的缓冲溶液;
(f)在轭合步骤中，在惰性气氛下使该还原型免疫球蛋白的透滤纯化溶液与式Ⅳ结构的阿霉素腙的溶液反应，
形成式Ⅰ的硫醚轭合物粗品，该反应优选在氩气氛下进行约10～60分钟并且相对于还原型免疫球蛋白硫醚的每当量硫醇，阿霉素腙的使用量为约1.0～1.5当量;
(g)纯化式Ⅰ的硫醚轭合物;并且(h)收集相对纯的式Ⅰ硫醚轭合物。
上述方法示于在下文将详细讨论的反应流程Ⅲ和Ⅳ中。
本发明的另一实施方案中，提供了第二种制备相对纯的式Ⅰ的硫醚轭合物的方法，该方法包括下列步骤(a)在缓冲液交换步骤中，用pH为约6～10(优选约6～9，更优选约7～8)的磷酸盐缓冲液透滤pH为约5～6的柠檬酸盐缓冲的式Ⅱ免疫球蛋白硫醚，得到pH为约6～9(优选约7～8)的免疫球蛋白硫醚的磷酸盐缓冲溶液;
(b)在透滤步骤(a)之前或之后，任意浓缩所述免疫球蛋白硫醚的溶液;
(c)在还原反应步骤中，在惰性气氛例如氩气氛下，用还原剂[例如二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇，优选二硫苏糖醇(DTT)]的磷酸盐缓冲溶液处理所述免疫球蛋白硫醚的磷酸盐缓冲溶液(优选MAb∶DTT摩尔比率为1∶5)，生成式Ⅲ的还原型免疫球蛋白的缓冲溶液;
(d)在惰性气氛例如氩气氛下，使式Ⅲ的还原型免疫球蛋白的所述磷酸盐缓冲溶液与式Ⅳ的阿霉素腙反应，生成式Ⅰ的硫醚轭合物粗品;
(e)纯化该式Ⅰ的硫醚轭合物粗品;并且(f)收集相对纯的式Ⅰ的硫醚轭合物。
上述反应方法示于在下文将详细讨论的在反应流程Ⅲ和Ⅴ中。
反应流程Ⅳ和Ⅴ中概述的任一方法中，免疫球蛋白硫醚的磷酸盐缓冲溶液可任意用螯合剂(例如乙二胺四乙酸)处理，以除去在缓冲液、免疫球蛋白硫醚和/或反应容器中可能存在的金属杂质。
在上述方法中，在使式Ⅱ的免疫球蛋白硫醚还原成式Ⅲ的免疫球蛋白硫醚之前，必须将式Ⅱ的免疫球蛋白硫醚的pH调节至约7～8。在第一种方法(反应流程Ⅳ)中，通过加入磷酸盐缓冲液，使原来(用柠檬酸盐缓冲)的式Ⅱ硫醚的pH在约5～6的范围变为(用磷酸盐缓冲)在约7～8的范围，通过这种方法，在还原反应之前或期间进行由柠檬酸盐至磷酸盐的缓冲液交换，制得式Ⅲ的还原型硫醚;而在第二种方法(反应流程V)中，在还原反应之前的透滤步骤中，使原来(用柠檬酸盐缓冲)pH值为约5～6范围的式Ⅱ硫醚的pH改变成为(用磷酸盐缓冲)在约7～8范围内。
另外根据本发明，使用以前从未用于纯化所述物质的几种不同的新方法纯化式Ⅰ的硫醚轭合物粗品。
在第一种纯化新方法中，首先用例如乙酸纤维素膜将式Ⅰ的硫醚轭合物粗品进行过滤，使溶液澄清，然后与碳或炭在降低的温度下混合，并按下文详细叙述的方法过滤。
在第二种纯化新方法中，将式Ⅰ的硫醚轭合物粗品用Bio-BEADTMSM-2(用于增加疏水性相互作用，Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)用一批法处理/纯化，然后滤除并以基本上纯的形式收集。
在第三种纯化新方法中，通过用凝胶过滤离子交换或疏水性相互作用的柱色谱法纯化式Ⅰ的硫醚轭合物粗品。SEPHADEXTMG-25(凝胶过滤介质)是优选的凝胶过滤用介质;CM SEPHADEXTMC-25是优选的离子交换用介质，而Bio-BEADSTM是优选的疏水性相互作用用介质。
在第四种纯化新方法中，式Ⅰ的硫醚轭合物粗品优选采用带有再生的乙酸纤维素膜的Amicon搅拌池或者带有再生的乙酸纤维素柱体的AmiconCH2RS透析器或者带有聚醚砜盒(cassettes)的FiltronCentrasette，经透滤法或透析法纯化。也可以将式Ⅰ的硫醚轭合物粗品通过聚砜或亲水性聚丙烯腈进行纯化。
另外，根据本发明，还提供一种制备用于制备式Ⅰ的硫醚轭合物的中间体的方法，该方法如下文反应流程Ⅰ中所概述，并包括下列步骤(a)在弱有机酸(优选乙酸)存在下，使马来酐A与式B结构的氨基酸反应，
(其中n是1至约10的整数，优选为5)，生成一种酸缩合产物C (b)在弱有机碱(优选三乙胺)和惰性有机溶剂(优选乙腈)存在下，用环合剂(例如甲硅烷基化试剂，优选三甲基氯硅烷)处理酸C，形成D(其优选是马来酰亚氨基己酸)
(c)将D进行结晶，形成环化的结晶的酸D;
(d)在N-甲基吗啉和惰性有机溶剂(例如四氢呋喃)和肼基甲酸烷基酯(优选肼基甲酸叔丁酯)存在下用偶联试剂(优选氯甲酸异丁酯)处理D，将环化的结晶的酸D进行偶联反应，生成肼基甲酸酯E (e)用酸(优选三氟乙酸)处理，将肼基甲酸酯E脱保护，生成中间体酰肼盐F， 另外，酸D可按下法制备在惰性气氛(例如氩或氮)下，使酸B在冰乙酸或其它酸(例如甲酸或丙酸)中的溶液与马来酐A在冰乙酸中的溶液反应，直接形成酸D。
如反应流程Ⅱ所示，按Willner等人1992年1月23日提交的美国专利申请第824 951号所述方法，将阿霉素·HCl(G)与酰肼盐F缩合，生成阿霉素腙Ⅳ。
按下文所示的反应流程Ⅰ～Ⅴ中概述的方法可进行本发明的方法，其中阐述了本发明的优选实施方案。
反应流程Ⅰ
反应流程Ⅱ
反应流程Ⅲ
轭合物Ⅰ
反应流程Ⅳ
反应流程Ⅴ
如反应流程Ⅰ所示，按下法制备原料酰肼盐F使马来酐A在弱酸例如乙酸、甲酸或丙酸(优选乙酸)中的溶液与氨基酸B(其优选为6-氨基己酸(式B，其中n为5)在弱有机酸例如乙酸或任何所述的其它酸(其中溶解A)(优选乙酸)中的溶液反应，得到二酸C。采用约5∶1～0.5∶1(优选约2∶1～1∶1)范围内的B∶A摩尔比率进行上述反应，反应时间为约1～10小时，优选为约3～5小时。
将溶解在惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醚、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或甲苯，优选乙腈)中的二酸C用环合剂(例如三甲基氯硅烷(TMSCL)、六甲基二硅氮烷或类似的甲硅烷基化试剂，优选三甲基氯硅烷)和弱有机碱(例如三乙胺或二异丙基乙基胺，优选三乙胺)处理。上述环合反应采用约10∶1～1∶1(优选约5∶1～3∶1)范围内的环合剂二酸C的摩尔比率，在约25～110℃(优选50～90℃)的温度下进行约1～10小时，优选进行约3～5小时。
无需应用柱色谱法，便可以基本上纯的形式分离得到的酸D，其优选为马来酰亚氨基己酸。优选的分离方法是结晶法，例如用乙酸乙酯和己烷、或者丙酮和异丙醚结晶。
另外，酸D可用一步法按下法制备使马来酐A在冰乙酸、甲酸或丙酸(优选冰乙酸)中的溶液与氨基酸B在冰乙酸、甲酸、丙酸或乙酸酐(优选冰乙酸)中的溶液在惰性气氛例如氩或氮(优选氩)气氛下反应。
使用的A和B的摩尔比率可以和上述制备D的两步法中所述比率相同。
反应在约25～150℃(优选约100～125℃)温度下进行约1～10小时，优选进行约3～5小时。
环合的酸D按下法进行偶联反应生成肼基甲酸酯E将酸D在无水惰性有机溶液例如四氢呋喃(THF)、乙醚或乙腈中的溶液(约-15～15℃的降低的温度，优选约0～4℃)用4-甲基吗啉、三乙胺或二异丙基乙基胺在无水溶剂(例如上述D中说明的溶剂，优选THF)和氯甲酸烷基酯如氯甲酸异丁酯或新戊酰氯在无水溶剂(例如上述D中说明的溶剂，优选THF)中的溶液(约-5～5℃的温度范围，优选约0～4℃)处理。然后向反应混合物中加入肼基甲酸烷基酯(优选肼基甲酯叔丁酯)在无水溶剂(例如上述D中说明的溶剂，优选THF)中的溶液。反应在约0～25℃(优选约4～25℃)的温度范围内进行约10～30小时，优选进行约10～24小时。使用的4-甲基吗啉或等同物、氯甲酸烷基酯和肼基甲酸烷基酯对酸D的摩尔比率范围各自独立地为约0.5∶1～5∶1，优选为约2∶1～1∶1。通过结晶法，可以用乙酸乙酯和己烷或者其它溶剂混合物分离肼基甲酸酯E。
然后将得到的肼基甲酸酯E脱保护，其方法是在约-15～25℃(优选约0～4℃)的温度范围内，将E与酸例如三氟乙酸、盐酸、对甲苯磺酸或氢溴酸反应约1～24小时，优选反应约2～5小时。优选的马来酰亚氨基己酰肼TFA盐可通过用叔丁基甲基醚或乙醚沉淀而分离。
参见反应流程Ⅱ，阿霉素的腙(Ⅳ)按下法制备在惰性气氛例如氩或氮(优选氩)气氛下，在暗处使阿霉素盐酸盐G、酰肼盐F(优选马来酰亚氨基己酰肼盐)和酸(例如三氟乙酸、盐酸或乙酸，优选三氟乙酸)在无水醇(例如甲醇、乙醇或异丙醇，优选甲醇)中反应。该反应进行约1～10小时，优选进行约3～5小时。
可以分离阿霉素腙产物Ⅳ，其方法是在降低的温度下，例如在约0～10℃(优选约2～4℃)下，加入乙酸乙酯、乙腈或四氢呋喃使之直接沉淀，然后过滤收集并将产物用冷溶剂例如甲醇-乙酸乙酯混合物洗，接着用乙腈洗，并真空干燥。
再参见反应流程Ⅲ和Ⅳ，在本发明方法的第一实施方案中按下法制备式Ⅰ结构的阿霉素BR96轭合物将碱金属磷酸盐例如磷酸氢二钠的溶液(将Na2HPO4溶解在注射用水(WFI)中制备)(pH范围为约8～10，优选约8.5～9.5)加至单克隆抗体BR96(式Ⅱ)在柠檬酸盐缓冲液(CBS)(优选约10～75mM柠檬酸钠和约50～500mM氯化钠)中的溶液。柠檬酸盐缓冲液(CBS)pH范围为约4～6.5，优选为约5～6.5，更优选为约5～6，得到pH为约6～9(优选约7～8)的BR96 MAb溶液。得到的BR96 MAb溶液用氩清洗，以使O2含量降低至约10%以下(优选约5%以下)。
还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇(优选二硫苏糖醇(DTT))在磷酸盐缓冲液(PBS)中的溶液是优选的。PBS缓冲液的pH范围为约6～10，优选为约7～8，它由约1～25mM磷酸钠和约50～250mM氯化钠(约0.005M～0.02M磷酸钠和约0.05M～0.2M氯化钠)组成(其制备方法是约1～5mM NaH2PO4·H2O、约5～15mM Na2HPO4和约50～200mM NaCl中加适量水至一升，并加入1N NaOH直至pH为约7.0～8.0)。
另外，磷酸盐缓冲液可由下列成份形成
约50～200mM(0.04～0.4重量%)KCl，约5～15mM(约0.4～4重量%)Na2HPO4，约1～5mM(约0.04～0.4重量%)KH2PO4·H2O，水适量至一升，加入1NKOH至pH为约7～8。
还原剂(优选DTT)在磷酸盐缓冲液中的溶液与BR96MAbⅡ的溶液反应，摩尔比率(还原剂Ⅱ)的范围为约10∶1～5∶1，优选为约9∶1～6∶1，反应温度为约25～45℃，优选为约30～40℃，反应时间为约1～5小时，优选为约2～3小时。上述反应在惰性气氛(优选氩)下进行。
形成的还原型BR96MAbⅢ MAb-(SH)7-9与氩气清洗的磷酸盐缓冲液混合，然后在氩气氛下用Waters，Amicon或Filtron透滤系统进行透滤/浓缩，以除去杂质。
纯化的还原型BR96MAb再与阿霉素腙Ⅳ在惰性气氛(例如氩)在约-5～25℃(优选约0～5℃)的温度下进行轭合反应，采用还原型BR96 MAb∶Ⅳ的摩尔比率范围为约1∶4～1∶11，优选为约1∶8～1∶10。
参见反应流程Ⅲ和Ⅴ，式Ⅰ结构的阿霉素BR96轭合物在本发明方法的第二实施方案中按下法制备如本文所述，用透析膜(优选Filtron Minisette)，将BR96MAb(Ⅱ)在pH为约4～6(优选约5.0～5.5)的柠檬酸盐缓冲的盐水(CBS)(相对本发明方法的第一实施方案所述)中的溶液用磷酸盐缓冲液(PBS)(相对本发明方法的第一实施方案所述)进行透滤，采用的柠檬酸盐缓冲的BR96MAb与磷酸盐缓冲液的比率为1∶5，比率范围为约0.5∶1～0.125∶1(优选约0.33∶1～0.2∶1)。形成的浓度为约5～15mg/ml的磷酸盐缓冲的BR96MAb(Ⅱ)用还原剂(优选二硫苏糖醇(DTT)在磷酸盐缓冲液中的溶液)处理，使用的Ⅱ∶DTT的摩尔比率范围为约0.1∶1～1∶1，优选为0.12∶1～0.2∶1。上述反应在惰性气氛(例如氩)于约25～45℃(优选约30～40℃)的温度下进行约1～6(优选约3～4)小时。
然后如第一实施方案(反应流程Ⅳ)中所述，将还原型BR96MAb(Ⅲ)与阿霉素腙Ⅳ反应，生成轭合物粗品Ⅰ，它可按本文所述方法纯化。
从上文中可清楚看出，在本发明方法的第一实施方案中，在将免疫球蛋白硫醚Ⅱ还原后，并在其与阿霉素腙Ⅳ进行轭合反应之前，将还原型抗体Ⅲ进行缓冲液交换(用磷酸盐缓冲液处理)和纯化;而在本发明方法的第二实施方案中，在将免疫球蛋白硫醚Ⅱ还原成Ⅲ后，直接进行与腙Ⅳ的轭合反应步骤。
本发明方法的第二实施方案可包括任意浓缩柠檬酸盐缓冲的免疫球蛋白硫醚Ⅱ，该浓缩通过连续透滤(透析)步骤进行直至得到所需的浓度，优选浓度范围为约10～30mg/ml免疫球蛋白硫醚。
应注意到，在第二实施方案中可以使用更少的还原剂(DTT)，但完成反应的时间将增长。
根据本发明，从反应流程Ⅳ和Ⅴ中形成的轭合物粗品Ⅰ可以通过本文所述的任一技术(包括使用炭、柱色谱、透析和/或Bio-BEADSTM)纯化，例如轭合物粗品可通过乙酸纤维素膜过滤澄清，然后在惰性气氛(例如氩)于约0～20℃(优选约0～5℃)的温度下用炭处理。
适于本发明使用的炭实例包括1.NORITTMSX-3(优选的)2.DARCOTMG603.ADPTMPULVERIZED4.NORITTMA SUPRA5.MORITTMB SUPRA6.NORITTMUSP 22另外，根据本发明，采用下列任一方法，通过透滤或透析法，可以纯化轭合物粗品Ⅰ。
透滤法1.小规模(＜3.0克规模)a.带有再生的乙酸纤维素膜的Amicon搅拌池b.带有聚醚砜膜的Filtron搅拌池，2.大规模(＞3.0克规模)a.带有再生的乙酸纤维素螺柱体的AmiconCH2RS透析器(优选的)，b.带有再生的乙酸纤维素螺柱体的AmiconDC1OL透析器，c.带有聚醚砜盒的FiltronMinisette，d.带有聚醚砜盒的FiltronCassettes.
在氩气氛下于约0～25℃的温度下进行轭合物Ⅰ的透滤。
另外，根据本发明，轭合物粗品Ⅰ还可通过应用Bio-BEADSTM用柱色谱法进行纯化，或者优选用一批法纯化，其中将轭合物粗品优选与Bio-BEADSTMSM-2(由Bio-Rad Laboratories用聚苯乙烯二乙烯基苯制得)一起在惰性气氛(例如氩)下于约0～25℃(优选约0～25℃)的温度下搅拌约5～120分钟，优选搅拌约10～30分钟。
另外，根据本发明，轭合物粗品Ⅰ可利用使用下列方法的柱色谱来纯化Ⅰ.用下列任一凝胶进行凝胶过滤1.SEPHADEXTMG-25 MEDIUM2.SEPHADEXTMG-50 MEDIUM3.SEPHADEXTMG-25 SUPER FINE(SF)4.SEPHACRYLTMS-100 HR5.SUPEROSETM12 PG6.ULTRAGELTMACA 2027.TRYSACRYLTMGF 05;
Ⅱ.用下列任一凝胶进行离子交换1.CM SEPHAROSETMFAST FLOW2.CM SEPHADEXTMG-253.CM SEPHADEXTMG-50;或通过Ⅲ.用下列任一材料进行疏水性相互作用1.BIO-BEADSTMSM-22.BIO-BEADSTMSM-73.BIO-BEADSTMSM-164.PHENYL SEPHAROSETM6 FAST FLOW优选用CM SEPHADEXTMC-50 SEPHADEXTMG-25 SF和 CM SEPHADEXTMC-25纯化轭合物Ⅰ。
CM SEPHADEXTMC-25尤其优选用于大规模纯化，例如用于5.0g或更大规模的纯化。
通过柱色谱法进行轭合物Ⅰ的纯化如下在约0～5℃的温度下将在磷酸盐缓冲液(pH为约7～8)中的轭合物粗品装样于柱上，用磷酸盐缓冲液以约45～85ml/分钟的体积流速洗脱轭合物。
关于优选的实施方案，本发明方法的最优选方面是制备式(Ⅰ)的免疫轭合物，该免疫轭合物中的药物部分是阿霉素，配位体部分选自BR96MAb、松驰型BR96抗体、嵌合型BR96 MAb、以及它们的抗原识别片段。该实施方案的最优选的配位体是嵌合型BR96 MAb，尤其是松驰的嵌合型BR96 MAb，以及它们的抗原识别片段。
按本发明方法制备的轭合物能够靶向定位于选定的细胞群，因而和阿霉素或其衍生物一样可以治疗其相同的疾病，包括肿瘤疾病例如癌、病毒或其它病原体的感染、自身免疫性疾病以及其它的使用阿霉素的疾病。
按本发明方法制备的轭合物以药物制剂的形式对患者给药，该药物制剂包含式(Ⅰ)的轭合物和药学上适用的载体、赋形剂或稀释剂。所用的术语“药学上适用的”是指可用于治疗或诊断温血动物例如人、马、猪、牛、鼠、犬、猫或其它哺乳动物以及鸟或其它温血动物的那些药剂。给药的优选方式是非胃肠道途径，尤其是通过静脉内、肌内、皮下、腹膜内或淋巴内途径。该制剂可以用本领域技术人员熟练的载体、稀释剂或赋形剂制备。在这方面可参见例如由Osol等人编缉的Remington′s PharmaceuticalSciences，16thed.，1980，MackPublishingCompany。所述组合物可包括蛋白质(例如血清蛋白如人血清白蛋白)、缓冲剂或缓冲物质例如磷酸盐、其它盐，或电解质等等。合适的稀释剂可包括例如无菌水、等渗盐水、右旋糖稀水液、多元醇或所述醇的混合物(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)。制剂中可含有防腐剂，例如苯乙醇、羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、乙基汞硫代水杨酸钠等。必要时制剂可含有0.05～约0.2重量%的抗氧化剂，例如焦亚硫酸氢钠或亚硫酸氢钠。
对于静脉内给药，将优选如此制备制剂，以使得对患者的给药量为约0.01～1g所需的轭合物Ⅰ。优选的给药量范围为约0.2～1g轭合物Ⅰ。依据各种因素例如待治疗的疾病状态或待改善的生物学效果、轭合物的给药方式、患者的年龄、体重和身体状况以及治疗医生决定的其它因素，轭合物Ⅰ在很宽的剂量范围都是有效的。因此，对任何具体患者的给药量都必须以其个体为基础作出决定。
本领域技术人员会明白，虽然以下实施例阐述了具体试剂和反应条件，但仍可作出变化，这些变化均包括在本发明精神和范围内。然而下列实施例阐明本发明的优选实施方案。
实施例12，5-二氢-2，5-二氧代-1H-吡咯-1-己酸A.(Z)-6-[(3-羧基-1-氧代-2-丙烯基)-1-氨基]己酸于室温在约15分钟内将马来酐(15.0g，0.15mol)在冰乙酸(100ml)中的溶液加至6-氨基己酸(19.65g，0.15mol)在冰乙酸(100ml)中的溶液中并于室温搅拌3小时。过滤白色沉淀，用冷水洗涤并于50℃在真空烘箱内干燥2天，制得33.00g标题化合物，产率9.5%。该物料无需任何进一步的纯化直接用于下一步反应步骤。
m.p.170～172℃。TLCRf＝0.47，硅胶，MeOH-CHCl3(1∶1)，PMA喷雾显色。
B.2，5-二氢-2，5-二氧代-1H-吡咯-1-己酸于室温向A部分的化合物(3g，0.013mol)在乙腈(90ml)中的溶液中依次滴加三甲基氯甲硅烷(8.3ml，0.065mol)和三乙胺(9ml，0.06mol)。然后将均相混合物于回流温度加热7小时。冷却至室温后，过滤沉淀的固体(三乙胺盐酸盐)并在真空下浓缩滤液，得到棕色固体。残余物溶解在二氯甲烷(75ml)中并用中性Norit(1.5g)沸腾20分钟。将混合物经硅藻土垫过滤并用热的二氯甲烷(25ml)洗涤。真空浓缩合并的滤液，得到1.4g(50%)产物。产物粗品用丙酮和异丙醚(1∶2)结晶，得到0.91g标题化合物，产率32%。m.p.83-85℃，TLCRf＝0.26，硅胶，MeOH-CHCl3(5∶95)，PMA喷雾显色。
实施例2阿霉素(Dox)的6-马来酰亚氨基己酰腙A.2，5-二氢-2，5-二氧代-1H-吡咯-1-己酸于室温和氩气氛下，在10分钟内将6-氨基己酸(20g，0.153mol)在冰乙酸(100ml)中的溶液加至马来酐(15.0g，0.153mol)在冰乙酸(300ml)中的溶液内。室温搅拌3小时后，将白色均相反应混合物回流5小时。50℃真空下在旋转蒸发仪上除去大部分乙酸。用甲苯减压共蒸馏除去残余的乙酸。将棕色残余物(40g)溶解在二氯甲烷(250ml)中并用中性炭(20g)沸腾20分钟。热的混合物经硅藻土垫过滤并用热的二氯甲烷(2×75ml)洗涤。真空浓缩合并的滤液，得到33g褐色产物粗品。将产物粗品在EtOAc和己烷(1∶1)中结晶，分三批共得到13g产物。在EtOAc和己烷(1∶1)中重结晶，得到9.8g马来酰亚氨基己酸，产率30%，m.p.82～84℃;TLCRf＝0.25，硅胶，MeOH-CHCl3(5∶95)，PMA喷雾显色。
B.2-[6-(2，5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-1-氧代己基]肼基甲酸1，1-二甲基乙酯0～4℃下向A部分化合物(15.0g 70mmol)的无水THF(500ml)溶液中依次加入4-甲基吗啉(7.7ml，70mmol)的无水THF(20ml)溶液和氯甲酸异丁酯(9.1ml，70mmol)的无水THF(20ml)溶液。于0℃搅拌15分钟后，向反应中缓慢加入(约10分钟)肼基甲酸叔丁酯(9.24g，70mmol)的无水THF(30ml)溶液。将浅黄色均相混合物于0℃搅拌1小时，于室温搅拌24小时。用TLC监测反应进程。将反应混合物浓缩至干。残余物溶解在EtOAc(200ml)中并依次用水(2×100ml)、冰冷的0.01N HCl(100ml)、5%碳酸氢钠(100ml)和水(2×100ml)洗涤。用无水MgSO4干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩，得到黄色油状产物粗品(19.75g)，该产物经快速色谱法(硅胶230-400目)纯化，依次用35%EtOAc/己烷、50%EtOAc/己烷和75%EtOAc/己烷洗脱。合并合适的级份并真空下浓缩，得到19.6g(85%)粘稠油状标题肼基甲酸酯;TLCRf＝0.28(S.M.Rf＝0.35)，硅胶，EtOAc/己烷(7∶3)，PMA喷雾显色。
C.2，5-二氧代-1H-吡咯-1-己酰肼三氟乙酸盐于0℃将B部分的肼基甲酸酯(16.9g)溶解在三氟乙酸(60ml)中并在相同的温度下搅拌3小时。30℃高真空下在旋转蒸发仪上除去过剩的三氟乙酸。将油状残余物在0℃下用乙醚(150ml)研制，并在同一温度下搅拌2小时。过滤白色沉淀，用乙醚(50ml)洗涤并高真空下干燥过夜，得到15.0g(由A部分化合物计，65.3%)C部分的化合物;m.p.107～110℃;TLCRf＝0.35(S.M.Rf＝0.60)，硅胶，MeOH-CH2Cl2(1∶9)，UV和PMA喷雾显色。
D.阿霉素的6-马来酰亚氨基己酰腙室温氩气氛下，将阿霉素盐酸盐(5.0g，8.6mmol)、C部分的马来酰亚氨基己酰肼盐(8.75g，25.81mmol)和三氟乙酸(0.5ml，6.49mmol)在无水甲醇(1.8L)中的混合物在暗处搅拌16小时。用反相HPLC监测反应进程。反应近于完全后，于30℃减压下在旋转蒸发仪上直接在暗处将混合物浓缩至约200ml。搅拌的同时向产物的甲醇溶液中缓慢加入无水乙腈(2L)，析出标题化合物。于0～4℃保持12小时使沉淀完全。用中等孔径的多孔滤片在布氏漏斗上过滤产物。暗红色的产物用冷MeOH-CH3CN(1∶9，500ml)混合液洗涤并真空下干燥3～4小时，得到6.36g(93%)标题阿霉素腙。将上述产物溶解在甲醇(约200ml)中，如前述用无水乙腈(2L)重新沉淀，使之进一步纯化。过滤分离并干燥，得到5.42g(82%)n标题化合物;mp182～184℃;TLCRf＝0.46，硅胶，MeOH-CHCl3-AcOH(3∶7∶0.1)，2份洗脱物，UV、PMA和AA喷雾显色;HPLCHI 95.4%(Rt＝15.92)，Ⅱ2.9%阿霉素盐酸盐。
实施例3阿霉素的6-马来酰亚氨基己酰腙在5L三颈园底烧瓶中和冷却(冰水浴)搅拌下，向阿霉素盐酸盐(10.0g，17.24mmol)在无水甲醇(400ml)中的红色悬浮液中一次性加入实施例2C部分的马来酰亚氨基己酰肼三氟乙酸盐(17.53g51.72mmol)，接着加入无水甲醇(40μl)中的三氟乙酸(8μl，0.1mmol)。在同一温度下将形成的混合物搅拌5小时。反应完全后，保持温度于0～4℃，在3小时内经加料漏斗小心加入冷的(0～4℃)乙酸乙酯(4L)，同时缓慢搅拌。在有中等孔径的多孔滤片的布氏漏斗上过滤红色沉淀。该亮红色固体用冷的(0-4℃)MeOH-EtOAc混合物(1∶9;6×200ml)接着用乙腈(6×200ml)洗涤。将产物转移至500ml烧杯中，真空(～0.3mmHg)中干燥2.4小时，得到13.23g标题阿霉素腙。上述产物进一步在真空(～0.3mmHg，45℃)中干燥24小时，得到13.13g产物，产率97%，HI99.4%，IR0.4%(阿霉素)和0.2%(未知的杂质)。
实施例4阿霉素-BR96轭合物(BR96单克隆抗体与阿霉素的6-马来酰亚氨基己酰腙的轭合物)1.用DTT还原BR96，生成BR96 MAb(SH)7-9在12L三颈圆底烧瓶中，在机械搅拌下，在约20分钟内向6000ml浓度为约10mg/ml的单克隆抗体BR96在柠檬酸盐缓冲盐水(CBS缓冲液，25mM柠檬酸钠和250mM氯化钠，pH＝5.5)中的溶液中加入磷酸钠饱和溶液(二代盐，约2155ml，pH～9.0)。该溶液用超纯无菌过滤的氩气持续清洗约1小时。清洗完毕时，抗体溶液中溶解的氧含量低于5%。测定(a)了抗体浓度(7.327mg/ml，59.76g，0.3734mmol)。室温下约5分钟内向该混合物中加入二硫苏糖醇溶液(262.5ml，0.01MPBS(b)溶液，2.625mmol，7.03摩尔当量)，同时搅拌。然后在氩气氛下在水浴中于36-38℃(内温)下将反应混合物缓慢搅拌2小时使还原反应完全。将该还原型抗体转移至冷室(4°)中透滤。
注a.用Perkin Elmer Lambda 6UV/可见分光光度计以280nm处的UV吸收测定抗体浓度(mg/ml);1mg/ml＝1.4吸光度单位。
抗体的摩尔浓度计算如下MC抗体＝ (mg/ml)/160000其中160000是抗体的摩尔重量。
b.按下法制备PBS缓冲液，pH＝7.8(0.01M磷酸钠和0.1M氯化钠)NaH2PO4·H2O 0.14gNa2HPO41.28gNaCl5.85g水(WFI)适量，加至1升1NNaOH约0.5ml(加至pH为7.8)通过0.22μ乙酸纤维素膜过滤。
2.还原型BR96的透滤将第1部分的还原型抗体转移至20L带塞的聚丙烯坛内，在该坛中已在氩气氛下用蠕动泵泵入了三升氩气清洗的PBS缓冲液。在氩气氛下将坛中形成的溶液(～11L)用Filtron Centrasette透滤/浓缩单元(c)浓缩至约6L。然后将浓缩的溶液(6L)在用电磁搅拌器缓慢搅拌的同时用24L氩气清洗的PBS缓冲液进行透滤。滤液的流速为约1.1L/分钟。透滤了总共5倍体积(30L)后，将还原型抗体(5520ml)在氩气氛下转移至12L三颈圆底Morton烧瓶中。测定SH(d)和抗体(a)的浓度。
注c.由316L不锈钢制造的Centrasette透滤单元购自Filtron。使用两块总表面积为10平方英尺的Omega30K膜(用聚醚砜制备)。用装配15.9mmBioprene管的Watson-Marlow604S/R蠕动泵从溶液库中将抗体溶液泵入单元之中。压力低于20psi。
d.按照Ellman方法(Anal.Biochem.94，75-81，1979)测定巯基摩尔浓度。用PBS缓冲液将反应混合物(0.1ml)稀释至1ml，并用0.025ml Ellman试剂(50mM的5，5′-联硫基-二-(2-硝基苯甲酸)在100mM磷酸氢二钠中的溶液(DTNB)，pH7.00)处理。按相同方法用0.025ml DTNB处理一份1ml PBS缓冲液的空白对照。5分钟后在412nm处测定样品和空白对照的吸光度(A)，并按下列等式测量巯基的摩尔浓度(MCSH)MCSH= ((A样品-A空白对照)×10)/(1.415×104)其中10是稀释因子，1.415×104是2-硝基-5-硫代苯甲酸二价阴离子的摩尔吸收系数。
按下式计算巯基与抗体的摩尔比率(MR)MR= (MCSH)/(MC抗体)
3.还原型BR96的轭合在氩气氛和5℃下，在约10分钟内向上述透滤的还原型抗体的机械搅拌下的溶液中缓慢加入阿霉素腙(例如实施例3中制备的)水(WFI)溶液(661ml H2O，3.68mmol，3.05g，HI95%)。在同一温度下搅拌20分钟后，将产物粗品泵经两个0.8μ和0.2μ乙酸纤维素膜的胶囊，使产物粗品澄清。于5℃氩气氛下，向12L三颈圆底烧瓶中搅拌着的产物粗品溶液一次性地加入30g炭并搅拌15分钟(1)。产物经两个真空过滤单元(1L Corning Vacuum Filtration unit，0.45μ，随后为0.22μ)过滤。标题产物(6350ml)暂时贮存在10L带塞的聚丙烯坛内。然后测定抗体浓度和阿霉素的摩尔浓度(并因而测定抗体与阿霉素的摩尔比率)(2)。轭合物pH为7.48，抗体浓度为9.1mg/ml，摩尔比率是8.49。
将上述轭合物分成两份第一份2830ml第二份3520ml(该份用于实施例11)然后将第一份按28×100ml和5×5ml的量分装于无菌塑料瓶中在液氮中冷冻，并贮存于-80-85℃。
注1.搅拌下将炭(Fisher Scientific，Cat＃C170-500，Norit，中性)用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤，直至洗液的pH恒定于7.4，再在真空烘箱中干燥。
2.如前所述通过280nm处的吸光度，同时按下式校正阿霉素在同一波长处的吸光度，测定抗体在轭合物中的浓度(mg/ml)
(A280-(0.724×A495))/1.4其中0.724是阿霉素在280nm处吸光度的校正因子，1.4是抗体的吸光度单位。
通过下面给出的等式测定阿霉素的摩尔浓度MC阿霉素(A495)/(8.03×103)其中8.03×103是阿霉素在495nm处的摩尔吸收系数。
通过下列等式计算轭合物的摩尔比率(MR)(MC阿霉素)/(MC抗体)实施例5阿霉素-BR96轭合物(BR96单克隆抗体与阿霉素的6-马来酰亚氨基己酰腙轭合)在无菌塑料瓶中向单克隆抗体BR96的溶液(325ml，浓度为9.73mg/ml，在柠檬酸缓冲盐水(a)中)滴加二硫苏糖醇(DTT)的溶液(13.84ml，0.01M，在PBS缓冲液中，0.1384mmol(b))。在氩气氛下，在水浴中于37℃(内温)将混合物缓慢搅拌3小时使还原反应完全。起始时和其后每小时(如实施例4所述)测定巯基与抗体的摩尔比率(MR)(MR值应保持在约14，以确信链间的S-S键完全还原)(c)。将松驰型(还原型)抗体转移至冷室(4℃)中的与装配了Omega弦向膜(d)的Filtron Minisette连接的5L溶液库内。将还原型抗体用2L PBS(b)缓冲液(pH7.4)稀释并透滤/浓缩(e)至约350ml。然后在氩气氛下将溶液转移至透明无菌的塑料容器内。如上所述测定抗体浓度和巯基摩尔浓度(并因而测定巯基与抗体的MR)。将阿霉素腙的预冷溶液(如实施例3所述制备)(27.06ml，0.0063M水溶液，0.172mmol，相对于每当量巯基(f)1.1当量)在冷室(4℃)中在恒定的氩气流并同时缓慢搅拌的条件下慢慢加到松驰型抗体中。加后30分钟，将红色轭合物溶液经乙酸纤维素滤膜(0.45μ，而后0.22μ)摩擦过滤，得到的滤液(350ml)分成以下三份第一份(150ml)、第二份(100ml)、第三份(100ml)。在冷室中在氩气氛下第一份(150ml)与炭(g)(0.75g)一起搅拌10分钟，经乙酸纤维素膜(0.22μ)过滤，得到标题轭合物。然后如实施例5所述测定抗体浓度和阿霉素的摩尔浓度(并因而测定抗体与阿霉素的MR)。抗体浓度为8.18mg/ml。摩尔比率为7.96，pH为7.22。将轭合物以4×5ml和3×40ml的量分装在无菌塑料瓶中在液氮中冷冻并贮存于-80℃。
注a.将BR96在柠檬酸盐缓冲液(25mM柠檬酸钠和250mM氯化钠，pH＝5.5)中的pH用饱和磷酸氢二钠(pH9.0，约10ml)调至7.41。
b.PBS缓冲液购自Gibco LaboratoriesInc.并按下列方法改性将500ml这种PBS缓冲液(内含2.00g氯化钾、2.00g磷酸二氢钾、80.00g氯化钠和21.60g磷酸氢二钠)用注射用水(WFI)稀释至5L，并将pH用1N氢氧化钠调至7.4，将形成的溶液经0.22μ乙酸纤维素膜过滤。
c.假设由于在反应混合物中存在痕量金属如果MR变低，则应当加入另外的DTT。还原反应还可在EDTA(1mM在PBS缓冲液中的溶液)存在下进行，以螯合抗体中存在的任何氧化金属。
d.Minisette和Omega弦向膜购自Filtron。该膜由30000MW的聚醚砜制造。用Watson-Marlow604S/R蠕动泵在25～30psi的压力下将溶液泵入超滤系统。
e.透滤/浓缩的速率为65ml/分钟。监测流出物的巯基与抗体的MR。洗脱约1.6L后，流出物的MR为0.44。推定此时大多部氧化的DTT和过量的DTT已从反应混合物中除去。
f.按下式计算所需的阿霉素腙的体积((巯基的摩尔浓度)×(还原型抗体的体积)×1.1)/(6.3×10-3)其中6.3×10-3是阿霉素腙溶液的摩尔浓度，1.1是相对于每当量巯基的阿霉素腙当量数g.搅拌下用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤炭(Fisher Scientific，Cat＃7440-44-0，Norit，中性)，直至洗液的pH恒定于7.4，在真空中干燥。
实施例6制备阿霉素BR96轭合物(BR96单克隆抗体与阿霉素的6-马来酰亚氨基己酰肼轭合)的任选方法从柠檬酸盐(pH5.4)至磷酸盐(pH7.8)缓冲液的缓冲液交换将BR96 MAb溶在柠檬酸盐缓冲盐水(1)(CBS)中。在DTT还原作用之前，使用带有两Cassettes(3)的Filtron Minisette用五倍体积的PBS缓冲液(2)透滤BR96的CBS缓冲液溶液。
轭合物的制备搅拌下，在三颈园底烧瓶中，在约2～3分钟内向上述单克隆抗体BR96的溶液(480ml，pH＝7.76，0.032mmol，浓度为10.77mg/ml，在磷酸盐缓冲盐水(2)中)加入二硫苏糖醇(DTT)的溶液(16.2ml，0.01M在PBS缓冲液中的溶液，0.162mmol，5.0mol当量)。在氩气氛下在水浴中于37℃(内温)将混合物缓慢搅拌4小时。然后冰浴冷却反应混合物。将阿霉素腙的预冷溶液(如实施例3所述方法制备，56ml，0.0063M水溶液，0.356mmol)在恒定的氩气流中在搅拌下于0～4℃缓慢加到还原型抗体中。加毕20分钟，经乙酸纤维素膜(0.45μ，然后0.22μ)摩擦过滤红色轭合物溶液。形成的滤液(510ml)在冰浴中在氩气氛下于0～4℃与炭(4)(7.0g)一起搅拌15分钟。该混合物经两种乙酸纤维素膜(0.45μ，然后0.22μ)过滤，得到标题轭合物(495ml)。如实施例4所述方法测定抗体浓度和阿霉素的摩尔浓度(并因而测定抗体与阿霉素的MR)。抗体浓度为8.42mg/ml。摩尔比率为8.26，pH为7.44。然后将轭合物以4×100ml、5×5ml和2×35ml的量分装在无菌塑料瓶中在液氮中冷冻并贮存于-80℃。
注
1.BR96的柠檬酸盐缓冲溶液(25mM柠檬酸钠和250mM氯化钠，pH＝5.5)。
2.按下法制备PBS缓冲液，pH＝7.8(0.01M磷酸钠和0.1M氯化钠)NaH2PO4·H2O 0.14gNa2HPO41.28gNaCl5.85g水(WFI)适量，加至一升1NNaOH约0.7ml(加至pH为7.8)经0.22μ乙酸纤维素膜过滤。
3.Cassettes是由30000MW的聚醚砜制造的膜。
4.搅拌下用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤炭(Fisher Scientific，Cat＃7440-44-0，Norit，中性)，直至洗液pH恒定于7.4，在真空中干燥。
实施例7用Bio-BEADTM纯化阿霉素-BR96轭合物按下法通过Bio-BEADTMSM-2用一批法纯化轭合物粗品(例如实施例4或5中制备的没有用炭纯化的轭合物粗品)在冷室(4℃)中在氩气氛下将上述轭合物粗品(100ml)和Bio-BEADTMSM-2(50.0g)在无菌聚苯乙烯烧瓶中搅拌30分钟。轭合物溶液经乙酸纤维素滤膜(0.22μ)过滤，按实施例4所述方法测定MR(药物与抗体的摩尔比率)，测得MR为8.12，抗体浓度为6.74mg/ml。将轭合物以2×5ml和2×40ml的量分装在无菌塑料瓶内在液氮中冷冻并贮存于-80℃。
1.Bio-BEADTM(型号SM-2)由聚苯乙烯-二乙烯基苯制造，购自Bio-Rad Laboratories。使用前将其依次用0.5N氢氧化钠、水(洗至中性)、甲醇和水洗涤，最后在冷室中用PBS缓冲液平衡(约2小时)。
实施例8用透析法纯化阿霉素-BR96轭合物按下法通过透滤法纯化轭合物粗品(例如实施例4中制备的没有用炭纯化的轭合物粗品)(350ml)在氩气氛下在冷室中将上述轭合物转移至带有YM30螺柱体的Amicon CH2RS透析器的库中并透滤。滤液的流速为约20ml/分钟。将轭合物转移至无菌NalgenePETE瓶中。然后测定抗体浓度和阿霉素的摩尔浓度(并因而测定抗体与阿霉素的MR)。轭合物的pH为7.6。抗体浓度为9.2mg/ml，摩尔比率为8.25。将产物以3×100ml、1×20ml和2×5ml的形式分装在无菌塑料瓶内在液氮中冷冻并贮存于-80℃。
实施例9通过阳离交换纯化阿霉素-BR96轭合物A.树脂的制备、柱的装填和平衡在室温下在0.5N NaCl(2L)中使CM SEPHADEXTMC-25(1)(500g)膨胀2小时。倾析上清液水层后，湿的树脂在室温下在PBS缓冲液(2)(4L)中贮存2天。倾析PBS缓冲液并用1N NaCl(3L)替代，16小时后膨胀的树脂(3)用于装填柱子。
组装的BPG 100(Pharmacia Inc)柱(4)先用1N HCl冲洗。将在1N NaCl中膨胀的CM SEPHADEXTMC-25树脂(总体积3L)慢慢倒入柱中并装填。然后通过用PBS缓冲液(3体积)洗脱/洗涤使柱平衡(5)。用丙酮和1N NaCl作柱的试验(6)。使用前将装填好的柱子贮存于约4℃保持2天使之平衡。
B.轭合物的纯化将新制备的轭合物粗品(7)(例如实施例4中制备的没有用炭纯化的轭合物粗品)置于PBS缓冲液中(浓度(8)＝10.5mg/ml，MR＝10.0，430ml)，在4℃下在约12分钟内用蠕动泵以35ml/分钟的体积流速上样(9)至上述柱中。以约60ml的流速用PBS缓冲液洗脱轭合物。在约9分钟内收集3份洗脱液;开始一份40ml，接着是作为单一级份的在465ml中的轭合物主要部分，最后是65ml的稀的第三级份。
级份的UV分析结果如下级分IIIIII收集的体积(ml)4046565蛋白(g)0.14.360.09MR6.847.648.16回收率(%)2.096.02.0C.柱的再生和平衡当共轭物洗出后，用1N NaCl(3倍体积)洗柱，然后用PBS缓冲液(3倍体积)洗/冲洗柱，使柱再生(10)。
注1.CM SEPHADEXTMC-25是一种改性的SEPHADEXTMG-25弱阳离子交换树脂，排阻限＝3×104，颗粒粒径＝40～125μm，总的离子容量＝4～5μmol/ml。
2.PBS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，pH7.5)NaH2PO4·H2O 0.00117M;Na2HPO40.009M;NaCl 0.1M;离子浓度0.1282;电导率9.35mS。
3.500g树脂膨胀至2800ml。
4.柱的尺寸L＝36cm;D＝10cm;柱床体积约为2800ml。
5.在室温下装填和平衡柱子，并转移至冷室(4℃)中。在装载轭合物之前，使柱子在该温度平衡16小时。
流速(28psi)[体积]＝215ml/分钟;[线性]＝2.74ml/分钟/cm2。
6.在此情形下HETP是0.072。0.01～0.1之间的数值是可接受的数值(Pharmacia)。HETP(理论等板高度)＝L/N，其中L＝柱床高度(cm)，N＝理论塔板数目。N＝5.54(Ve/W1/2)2，其中Ve＝洗脱体积(ml)并且W1/2＝半高峰宽(ml)。
7.在加至柱中之前，将轭合物粗品经乙酸纤维素膜(预过滤0.44μ，然后0.22μ)摩擦过滤。
8.用PE Lambda 6UV/可见分光光度计测定抗体摩尔浓度(mg/ml)，MC抗体＝ (A280-(0.724-A495))/1.4其中0.724是阿霉素在280nm处吸光度的校正因子，1.4是抗体在280nm处的UV吸光度。
9.物料装载比率(柱床体积∶轭合物体积)＝6.5∶1。
10.柱再生和平衡耗时约1.5～2小时。
但柱子使用3次之后，在树脂的顶部观察到清晰的红色薄层。柱再生方法不能完全除去该红色。
再生和平衡后，洗脱液的UV吸光度在280nm和495nm处读数为零。
实施例10用柱色谱法纯化阿霉素-BR96轭合物柱的制备在实施例9中已描述了CM SEPHADEXTMC-25树脂的制备(如实施例9所述)、柱装填、初始洗涤和再生。
轭合物的纯化用蠕动泵，在约9分钟内以50ml/分钟的体积流速将在PBS缓冲液(如实施例9中)中的新制备的轭合物粗品(例如实施例4中制备的没有用炭纯化的轭合物粗品)(浓度＝9.01mg/ml，MR＝12.31;430ml)上样至上述柱中(如实施例9所述)(该柱在4℃平衡了16小时)。轭合物用PBS缓冲液以约60ml/分钟的流速洗脱。在约9分钟内收集三份洗脱液;开始一份是40ml级份，接着是在450ml级份中的轭合物主要部分，最后是60ml的很稀的第三级份。
级份的UV分析结果级分IIIIII收集的体积(ml)4045060蛋白质(g)0.083.660.08MR7.78.428.41回收率(%)2.095.02.0柱的再生和平衡
洗脱轭合物后，通过用1NNaCL(3倍体积)洗涤，随后用PBS缓冲液(3倍体积)洗涤/洗脱，使柱再生。
实施例11用透滤法浓缩阿霉素-BR96轭合物按下法浓缩纯化的轭合物(3520ml，浓度为8.5mg/ml)(例如实施例4中制备的轭合物)在氩气氛下在冷室中将上述轭合物转移至带有YM30再生的乙酸纤维素螺柱体之AmiconCH2RS透析器上的库中并浓缩。流速为约20ml/分钟。将轭合物浓缩至约1785ml(浓度为17.3mg/ml)并转移至无菌NalgenePETE瓶中。测定抗体浓度和阿霉素摩尔浓度(并因而测定抗体与阿霉素的MR)。轭合物的pH为7.7，抗体浓度为17.3mg/ml，摩尔比率为8.39。将产物以17×100ml、1×55ml和6×5ml的量分装在无菌塑料瓶中在液氮中冷冻并贮存于-80℃。
权利要求
1.制备下式结构的硫醚轭合物的方法， 其中n是约1～10的整数，q是4～10，MAb是一种免疫球蛋白，它是松弛嵌合型BR96抗体、BR96抗体、嵌合型BR96抗体或松弛型BR96抗体、或其抗原结合片段；该方法包括在第一种方法中，(a)提供式MAb-(SH)6-9结构的还原型免疫球蛋白硫醚的缓冲的溶液，其中含有pH为约6～9的磷酸盐缓冲液，(b)在惰性气氛下透滤该还原型免疫球蛋白硫醚的缓冲溶液，制得已透滤的溶液，(c)在惰性气氛下使所述免疫球蛋白硫醚的已透滤溶液与下式结构的阿霉素腙的溶液反应，生成硫醚轭合物粗品， 其中n如上所定义，(d)纯化该硫醚轭合物；或者该方法包括在第二种方法中，(a)提供结构式为 的免疫球蛋白硫醚的透滤的磷酸盐缓冲溶液，所说溶液的pH为约6～9，(b)在惰性气氛下用还原剂的磷酸盐缓冲溶液处理所述的免疫球蛋白硫醚的磷酸盐缓冲溶液，生成结构式为的还原型免疫球蛋白硫醚的缓冲溶液，(c)在惰性气氛下使所述还原型免疫球蛋白硫醚的缓冲溶液与下式结构的阿霉素腙溶液反应，生成硫醚轭合物粗品， 其中n如上所定义，(d)纯化硫醚轭合物。
2.根据权利要求1的方法，其中在第一种方法中所述的还原型免疫球蛋白硫醚的缓冲溶液制备如下(a)提供结构式为 的免疫球蛋白硫醚的柠檬酸盐缓冲溶液，所述的柠檬酸盐缓冲液的pH值范围为约4～6;(b)用pH为约6～10的磷酸盐缓冲液处理所述的缓冲的免疫球蛋白硫醚，制得pH为约6～9的免疫球蛋白硫醚缓冲溶液，(c)在惰性气氛下，用还原剂的磷酸盐缓冲溶液处理所述的缓冲的免疫球蛋白硫醚，形成还原型免疫球蛋白硫醚的缓冲溶液。
3.根据权利要求1的方法，其中n为5并且MAb是松弛嵌合型BR96抗体。
4.根据权利要求2的方法，其中还原剂是二硫苏糖醇。
5.根据权利要求2的方法，其中在约25～45℃的温度下，在氩气氛中将缓冲的免疫球蛋白硫醚与缓冲的还原剂间的反应进行约1～5小时。
6.根据权利要求1的方法，其中在约-5～25℃下，在氩气氛中进行还原型免疫球蛋白硫醚的缓冲溶液的透滤。
7.根据权利要求1的方法，其中在约-5～25℃的温度下，在氩气氛中将已透滤的免疫球蛋白硫醚溶液与阿霉素腙间的反应进行约10～60分钟。
8.根据权利要求2的方法，其中采用的还原剂与免疫球蛋白硫醚的摩尔比率为约10∶1～5∶1。
9.根据权利要求1的方法，其中还原型免疫球蛋白硫醚与阿霉素腙的摩尔比率为约1∶4～1∶11。
10.根据权利要求1的方法，其中相对于还原型免疫球蛋白硫醚的每当量巯基，使用阿霉素腙的量为约1.0～1.5当量。
11.根据权利要求2的方法，其中柠檬酸盐缓冲盐水含有约10mM～75mM柠檬酸钠和约50mM～500mM氯化钠，pH为约5～6.5。
12.根据权利要求2的方法，其中磷酸盐缓冲液是碱金属磷酸盐缓冲液。
13.根据权利要求2的方法，其中磷酸盐缓冲盐水含有约0.005M～0.02M磷酸钠和约0.05M～0.2M氯化钠，并且pH为约7～8。
14.根据权利要求2的方法，其中磷酸盐缓冲盐水含有约0.04～0.4%(重量)KCl，约0.4～4%(重量)Na2HPO4约0.04～0.4%(重量)KH2PO4·H2O。
15.根据权利要求1的方法，其中按下法纯化硫醚轭合物粗品过滤轭合物粗品并用碳或炭处理过滤的轭合物。
16.根据权利要求1的方法，其中通过膜过滤法纯化硫醚轭合物粗品。
17.根据权利要求16的方法，其中通过将硫醚轭合物粗品通过再生的乙酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚砜膜或亲水性聚丙烯腈膜进行纯化。
18.根据权利要求1的方法，其中用微球颗粒(beads)纯化硫醚轭合物粗品。
19.根据权利要求18的方法，其中在一批法中使用Bio-Beads。
20.根据权利要求1的方法，其中将硫醚轭合物通过含有凝胶或树脂过滤介质的色谱柱或者将轭合物通过离子交换柱，使硫醚轭合物粗品纯化。
21.根据权利要求20的方法，其中通过应用凝胶过滤法或者通过离子交换或者通过疏水的相互作用纯化所述的硫醚轭合物粗品。
22.根据权利要求1的方法，其中在第二种方法中，按下法制备结构式 的免疫球蛋白硫醚的透滤磷酸盐缓冲溶液(a)提供免疫球蛋白硫醚在柠檬酸盐缓冲盐水中的溶液，所说的柠檬酸盐缓冲盐水的pH为约4～6。(b)用pH为约6～9的磷酸盐缓冲液透滤所说的柠檬酸盐缓冲的免疫球蛋白硫醚，制得pH为约6～9的免疫球蛋白硫醚的透滤的磷酸盐缓冲溶液。
23.根据权利要求22的方法，其中在第二种方法中，在透滤步骤之前，将柠檬酸盐缓冲的免疫球蛋白硫醚溶液浓缩至约10～30mg/ml。
24.根据权利要求1的方法，其中用螯合剂处理免疫球蛋白硫醚的磷酸盐缓冲溶液，除去存在于免疫球蛋白硫醚、磷酸盐缓冲剂或两者之中的金属杂质。
25.制备下式结构的酰肼酸盐化合物的方法， 其中n为1～10，该方法包括(a)通过用包括肼基甲酸烷基酯在内的偶合试剂处理下式结构的环合的酸 使该环合的酸的晶体进行偶联反应，生成下式结构的肼基甲酸酯， 并且(b)将上述肼基甲酸酯中间体与酸反应，脱去保护基，生成酰肼酸盐。
26.根据权利要求25的方法，其中按下法制备环合的酸原料(a)在弱有机酸存在下，使马来酐与结构式为的氨基酸反应，生成下式结构的酸缩合产物， 并且(b)在弱有机碱和惰性有机溶剂存在下，用环合剂处理上述的酸，生成下式结构的环合的酸
27.根据权利要求25的方法，其中在有机酸存在下在惰性气氛中使马来酐与结构式为H2N-(CH2)n-COOH的氨基酸反应，制备环合的酸原料。
28.根据权利要求26的方法，其中马来酐与一种氨基酸即氨基己酸反应。
29.根据权利要求28的方法，其中在乙酸存在下进行马来酐与氨基己酸的反应。
30.根据权利要求29的方法，其中在环合所述酸缩合产物中使用的环合剂是三甲基氯甲硅烷或六甲基二硅氮烷，弱有机碱是三乙胺或二异丙基乙基胺，惰性有机溶剂为乙腈，结果生成马来酰亚氨基己酸。
31.根据权利要求30的方法，其中应用乙酸乙酯和己烷使马来酰亚氨基己酸结晶。
32.根据权利要求30的方法，其中在约70～100℃的温度下进行环合反应。
33.根据权利要求25的方法，其中用于偶联环合的酸的偶合剂包括肼基甲酸叔丁酯、N-甲基吗啉和氯甲酸异丁酯以及惰性有机溶剂，生成肼基甲酸酯中间体。
34.根据权利要求33的方法，其中通过用乙酸乙酯和己烷进行结晶来分离肼基甲酸酯中间体。
35.根据权利要求25的方法，其中通过肼基甲酸酯中间体与三氟乙酸反应来使肼基甲酸酯中间体脱保护，生成相应的三氟乙酸盐，或者通过使肼基甲酸酯中间体与盐酸反应而脱保护，生成相应的盐酸盐。
36.制备下式结构的肼基甲酸叔丁酯中间体的方法， 该方法包括通过先用N-甲基吗啉、氯甲酸异丁酯和惰性有机溶剂，然后在惰性有机溶剂存在下用肼基甲酸叔丁酯处理马来酰亚氨基己酸，使所说的酸进行偶联反应。
37.用透滤技术将如权利要求1所述的纯化的阿霉素-BR96轭合物浓缩至约10～50mg/ml的所需浓度的方法。
38.制备如权利要求1所述的阿霉素腙的方法，该方法包括在惰性气氛中，在酸和醇溶剂存在下，使阿霉素盐酸盐与下式结构的酰肼酸盐反应 生成阿霉素腙，并分离该阿霉素腙。
39.根据权利要求38的方法，其中所述的阿霉素腙按下法分离将阿霉素腙用乙酸乙酯、乙腈或四氢呋喃在降低的温度下处理，并过滤收集阿霉素腙，且用冷溶剂任意洗涤该腙。
全文摘要
提供了一种制备可用于治疗肿瘤疾病的硫醚轭合物的方法，该硫醚轭合物优选由BR96免疫轭合物形成，所述免疫轭合物由阿霉素的杂双官能连接物合成。在该方法中，将纯化的还原型BR96 MAb与阿霉素的6-马来酰亚氨基己酰腙轭合，并且使形成的轭合物粗品纯化。
文档编号A61P35/00GK1109886SQ9510161
公开日1995年10月11日 申请日期1995年1月27日 优先权日1994年1月27日
发明者J·K·托塔希尔, Y·彭德里, K·G·加达马塞蒂, 李文森, R·H·米勒 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司