编码18型人乳头状瘤病毒的dna的制作方法

专利名称：编码18型人乳头状瘤病毒的dna的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码纯化的18型人乳头状瘤病毒的DNA分子及其衍生物。
附图的简要说明

图1显示了HPV18L1的核苷酸和推测的氨基酸序列。
图2是HPV18的L1蛋白质中的氨基酸变化的目录。
图3显示了HPV18L2核苷酸和推测的氨基酸序列。
图4显示了在酵母中表达的HPV18L1蛋白的免疫印迹。
图5显示了在酵母中表达的HPV18L2蛋白的免疫印迹。
图6是酵母中表达的HPV18L1蛋白形成的病毒样颗粒的电子显微图。
背景技术：
在各种动物包括人，羊，狗，猫，兔，猴，蛇和牛中都存在乳头状瘤病毒(PV)感染。乳头状瘤病毒感染上皮细胞，通常在感染位点诱导良性上皮或纤维上皮肿瘤。PV是种特异性感染因子人乳头状瘤病毒不感染非人动物。
根据它们感染的寄主，可以将乳头状瘤病毒分成明显不同的几类。根据DNA序列同源性，进一步可以将人乳头状瘤病毒(HPV)分成70多种类型。由于抗一种类型的乳头状瘤病毒感染的中和免疫性不赋予抗另一种类型的乳头状瘤病毒的免疫性，PV型似乎是类型特异性免疫源。
在人中，不同的HPV型引起不同的疾病。1，2，3，4，7，10和26-29型HPV在普通和免疫妥协的个体中引起良性疣。5，8，9，12，14，15，17，19-25，36，46-50型HPV在免疫妥协个体中引起扁平斑。6，11，34，39，41-44和51-55型HPV引起生殖器或呼吸粘膜产生良性湿疣。16和18型HPV引起生殖器粘膜的上皮发育不良并与大多数原位的和侵入的子宫颈，阴道，外阴和肛门管的癌有关。
乳头状瘤病毒是小的(50-60nm)，无包衣的，二十面体DNA病毒，它编码最多达8个早期基因和两个后期基因。病毒基因组的开放读码框架(ORF)被命名为E1至E7和L1和L2，其中“E”意指早，“L”意指晚。L1和L2编码病毒衣壳蛋白。早期(E)基因与如病毒复制和细胞转化的功能有关。
L1蛋白是较大的衣壳蛋白并且分子量为55-60kDa。L2蛋白是较小的衣壳蛋白，具有推测分子量55-60kDa和由聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量75-100kDa。免疫学数据表明在病毒壳粒中大多数L2蛋白在L1蛋白内部。L1ORF在不同乳头状瘤病毒之间是高度保守的。L2蛋白在不同乳头状瘤病毒之间几乎不保守。
已经鉴定L1和L2基因是好的免疫预防靶。对于棉尾兔乳头状瘤病毒(CRPV)和牛乳头状瘤病毒(BPV)系统的研究表明，用细菌中表达的L1和L2蛋白或使用疫苗载体的免疫方法保护动物不受病毒感染。在杆状病毒表达系统中表达乳头状瘤病毒L1基因中或使用疫苗载体导致组装成病毒样颗粒(VLP)，该病毒样颗粒已经用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。
在16型HPV后，HPV18是宫颈癌中发现的第二种最流行的HPV类型。在从世界各地收集的宫颈癌活检的5-20％中检测到HPV18(Ikenberg，H.1990.在侵袭性的生殖器癌中的人乳头状瘤病毒DNA。生殖器乳头状瘤病毒感染，G.Gross et al.，eds.p.85-112)。由于来自非洲和南美妇女的肿瘤活检比来自欧洲和北美妇女的同样的活检更频繁地含有HPV18，HPV18的感染似乎存在地理依赖性。之所以造成这些地理差异的潜在原因还未知。由于HPV18也与更具侵略性生长的癌有关并且在较温和的前体损害，CINI-II中很少发现，开发抗HPV18感染的疫苗变得尤其必要。
发明概要本发明涉及编码纯化的18型人乳头状瘤病毒(18型HPVHPV18)的DNA分子和所述DNA分子的用途。
发明的详细说明本发明涉及编码纯化的18型人乳头状瘤病毒(18型HPVHPV18)的DNA分子及其衍生物。这些衍生物包括但不限于该DNA编码的肽和蛋白质，抗该DNA的抗体或抗该DNA编码的蛋白质的抗体，含有该DNA的疫苗或含有该DNA编码的蛋白质的疫苗，含有该DNA或该DNA编码的蛋白质的免疫组合物，含有该DNA或该DNA起源的RNA或该DNA编码的蛋白质的试剂盒。
根据已知的方法如通过混合一种药学可接受载体可以配制含有该DNA或该DNA编码的蛋白质的有药学用途的组合物。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可以找到这样的载体和配制方法的例子。为了形成适于有效给药的药学可接受组合物，这样的组合物将含有有效量的DNA或蛋白质或VLP。这样的组合物可以含有起源于一种以上类型的HPV的DNA或蛋白质或VLP。
给个体施用足以治疗或诊断PV感染的量的本发明的治疗或诊断组合物。该有效量可以根据各种因素如个体的症状，体重，性别和年龄而变化。其它因素包括给药的方式。通常，该组合物将以约1ug-约1mg范围的剂量给药。
该药物组合物可以以各种途径如皮下，局部，口，粘膜，静脉内和肌肉内给个体给药。
本发明的疫苗含有DNA，RNA或该DNA编码的蛋白质，该DNA含有在寄主中诱导中和抗体形成必需的抗原决定簇。这样的疫苗给药时也是足够安全的，没有临床感染的危险；没有毒性副作用；可以以有效途径给药；稳定；并且与疫苗载体相容。
该疫苗可以以各种途径如口，肠胃外，皮下，粘膜，静脉内或肌肉内给药。给药的剂量可以随着个体的症状，性别，体重和年龄；给药的途径；和疫苗的PV类型而变化。疫苗可以以如胶囊，悬浮液，配剂，或液体溶液的剂量形式使用。疫苗可以与免疫学可接受载体一起配制。
以治疗有效量，即足以产生免疫保护应答的量施用该疫苗。治疗有效量可以根据PV的类型而变化。可以以单倍或多倍的剂量施用疫苗。
本发明的DNA和DNA衍生物可以用于配制免疫源性组合物。当将这样的组合物导入适当寄主时，能在寄主中诱导免疫应答。
DNA或它的衍生物可以用于生产抗体。本文所用的术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体，以及其片段，如，Fv，Fab和F(ab)2片段，这些片段能结合抗原或半抗原。
本发明的DNA和DNA衍生物可以用于血清型HPV感染和HPV筛选。将DNA，重组蛋白，VLP和抗体本身用于配制适用于对HPV进行检测和血清分型的试剂盒。这样的试剂盒含有适于密封地容纳于至少一个容器的分割化载体。载体将进一步含有适用于检测各种HPV类型的试剂如HPV18DNA，重组HPV蛋白或VLP或抗HPV抗体。载体也可以含有检测用工具如标记抗原或酶底物或诸如此类。
DNA和由此起源的蛋白质也用作分子量和分子大小的标志。
由于遗传密码是简并的，一个以上的密码子可用于编码特定的氨基酸，所以，氨基酸序列可以被任何一组类似的DNA寡核苷酸编码。该组只有一个成员将与HPV18序列相似，但是在适当条件下甚至存在错配DNA寡核苷酸时能够与HPV18DNA杂交。在改变的条件下，错配的DNA寡核苷酸仍然可以与HPV18DNA杂交以便允许鉴定和分离编码HPV18的DNA。
本发明的纯化的HPV18DNA或其片段可以用于分离和纯化其它来源的HPV18的同系物和片段。为了完成这一过程，可以在适当的杂交条件下将第一个HPV18DNA与含有编码HPV18的同系物的DNA的样品混合。可以将该杂交DNA复合物分离，并由此纯化编码同源DNA的DNA。
已知在编码特定的氨基酸的各种密码子中存在大量的丰余。所以，本发明还涉及那些含有替换密码子的DNA序列，这些密码子编码同样的氨基酸的最后转译。在本说明书中，将具有一个或更多替代密码子的序列定义为简并变化。同时包括在本发明范围内的是DNA序列或转译蛋白质的突变，这些突变基本上不改变表达蛋白的最后的物理特性。例如，缬氨酸代替亮氨酸，精氨酸代替赖氨酸，或天冬氨酸代替谷氨酸不会引起多肽功能的变化。
已知可以将编码一种肽的DNA的序列进行改变以便能编码具有不同于天然存在肽的特性的肽。改变所述DNA序列的方法包括，但不限于定点突变。
如本文所用，HPV18的“功能衍生物”是具有基本上与HPV18的生物学功能相类似的生物学功能(功能的或结构的)的化合物。术语“功能衍生物”将包括HPV18的“片段”，“变异体”，“简并变异体”，“类似物”和“同系物”或“化学衍生物”。术语“片段”意指HPV18的任何多肽亚群。术语“变异体”意指基本上与整个HPV18分子或其一个片段的结构和功能相似的分子。如果两个分子有基本上类似的结构或如果两个分子具有相似的生物活性，一种分子与HPV18“基本上相似”。所以，如果两个分子基本上具有相似的活性，可以认为它们是变异体，即使一个分子的结构在另一个中没有发现或即使两个氨基酸序列不同。
术语“类似物”指功能确实与整个HPV18分子或其片段相同的分子。
可以将各种方法用于分子克隆HPV18DNA。这些方法包括，但不限于，在构建含HPV18的cDNA或基因组DNA文库后在适当的表达载体系统中直接HPV18基因的功能表达。另一个方法是用根据HPV18的氨基酸序列设计的标记的寡核苷酸探针，筛选在噬菌体或质粒穿梭载体中构建的含HPV18的cDNA或基因组DNA文库。另一个方法包括用编码HPV18的部分DNA筛选在噬菌体或质粒穿梭载体中构建的含HPV18的cDNA或基因组DNA文库。这一部分DNA是通过根据纯化的HPV18的氨基酸序列设计的简并寡核苷酸引物的特异聚合酶链式反应(PCR)来扩增HPV18DNA片段得到的。另一个方法是从产生HPV18细胞分离RNA并通过体外或体内翻译系统将RNA翻译成蛋白质。将RNA翻译成肽或蛋白质将导致产生至少一部分的HPV18蛋白，这部分HPV18蛋白可以通过例如HPV18蛋白的活性或通过与抗HPV18抗体的免疫反应性得到鉴定。在这一方法中，可以分析从产生HPV18细胞分离的RNA库中至少编码一部分HPV18的RNA的存在。可以进一步分级分离RNA库以便从非HPV18 RNA纯化HPV18 RNA。分析这一方法产生的肽或蛋白质，以提供氨基酸序列，这些氨基酸序列用于提供生产HPV18 cDNA的引物，或可以分析用于翻译的RNA，它提供编码HPV18的核苷酸序列并产生用于筛选HPV18 cDNA文库的探针。这些方法是本领域已知的并能在例如，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约.1989中找到。
很明显，其它类型的文库，以及从其它细胞或细胞类型构建的文库可以用于分离编码HPV18的DNA。其它类型的文库包括，但不限于，来源于含有18型HPV的其它细胞或细胞系的cDNA文库和基因组DNA文库。
通过各种技术可以进行cDNA文库的制备。在Sambrook，J.，et al.，如上所述，可以发现cDNA文库的构建技术。很明显，也可以从适当的基因组DNA文库分离编码HPV18的DNA。通过各种技术可以进行基因组DNA文库的构建。在Sambrook，J.，et al.如上所述可以找到基因组DNA文库的构建技术。
通过分子克隆进入表达载体可以重组地表达用本文叙述的方法得到的克隆HPV18 DNA或其片段，所述表达载体含有适当的启动子和其它适当的转录调节元件，并将它转移进原核或真核寄主细胞以便产生重组HPV18。在Sambrook，J.，et al.，如上所述中详细叙述了这些操作的技术，并且是本领域已知的。
本文定义表达载体为在适当寄主中转录基因的克隆拷贝和翻译它们的mRNA所必需的DNA序列。这样的载体可以用于在各种寄主如细菌，蓝绿藻，植物细胞，昆虫细胞，真菌细胞和动物细胞中表达真核基因。特异设计的载体允许DNA在寄主如细菌-酵母或细菌-动物细胞或细菌-真菌细胞或细菌-无脊椎动物细胞之间穿梭。恰当构建的表达载体应该含有在寄主中自主复制的复制原点，可选择标志，有限数目的有用的限制酶位点，高拷贝数的潜能，和有活性的启动子。定义启动子为指导RNA聚合酶与DNA结合并启动RNA合成的DNA序列。强启动子是引起mRNAs高频启动的启动子。表达载体可以包括，但不限于，克隆载体，修饰的克隆载体，特殊设计的质粒或病毒。
各种哺乳动物表达载体可用于在哺乳动物细胞中表达HPV18 DNA或其片段。适于重组HPV18表达的商业可得哺乳动物表达载体包括，但不限于pcDNA3(Invitrogen)，pMC1neo(Stratagene)，pXT1(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC37198)，pSV2-dhfr(ATCC37146)，pUCTag(ATCC37460)，和λZD35(ATCC37565)。
各种细菌表达载体可用于在细菌细胞中表达HPV18DNA或其片段。合适的商业可得细菌表达载体包括，但不限于pET1la(Novagen)，λgt11(InVitrogen)，pcDNAII(Invitrogen)，pKK223-3(Pharmacia)。
各种真菌细胞表达载体可用于在真菌细胞中表达HPV18或其片段。适当的商业可得真菌表达载体包括，但不限于pYES2(Invitrogen)，毕赤氏酵母表达载体(Invitrogen)，和汉逊氏酵母表达(Rhein Biotech，Dusseldorf，德国)载体。
各种昆虫细胞表达载体可用于在昆虫细胞中表达HPV18或其片段。适当的商业可得昆虫细胞表达载体包括，但不限于pBlueBacIII(Invitrogen)和pAcUW51(PharMingen.Inc.)。
含有编码HPV18的DNA或其片段的表达载体可以用于在细胞，组织，器官，或动物(包括人)中表达HPV18蛋白或HPV18蛋白的片段。寄主细胞可以是原核或真核，包括但不限于细菌如大肠杆菌，真菌细胞如酵母，哺乳动物细胞包括但不限于人，牛，猪，猴和啮齿动物起源的细胞系，和昆虫细胞包括但不限于果蝇和家蚕起源的细胞系。适当的并且是商业可得的哺乳动物种类起源的细胞系包括但不限于L细胞L-M(TK-)(ATCC CCL1.3)，L细胞L-M(ATCC CCL1.2)，293(ATCC CRL1573)，Raji(ATCC CCL86)，CV-1(ATCC CCL 70)，COS-1(ATCCCRL1650)，COS-7(ATCC CRL 1651)，CHO-K1(ATCC CCL61)，3T3(ATCCCCL 92)，NIH/3T3(ATCC CRL 1658)，HeLa(ATCC CCL 2)，C127I(ATCCCRL 1616)，BS-C-1(ATCC CCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。
可以通过许多技术包括但不限于转化，转染，脂质转染，原生质体融化，和电穿孔将表达载体导入到寄主细胞中。克隆繁殖含有表达载体的细胞并各个分析以确定它们是否产生HPV18蛋白。可以通过几条途径对HPV18表达寄主细胞克隆进行鉴定，这些途径包括但不限于，与抗HPV18抗体的免疫反应性，和与寄主细胞相关的HPV18活性存在，如定义为由HPV18特异配体与表达的HPV18蛋白相互作用传导的应答的HPV18特异配体结合或信号转导。
利用体外生产合成的mRNA或天然mRNA也可以进行HPV DNA片段的表达。可以在各种无细胞系统包括，但不限于小麦胚芽提取液和网织红细胞提取液中有效翻译，以及基于细胞的系统包括，但不限于微注射进蛙卵母细胞，优选的是微注射进蛙卵母细胞来有效翻译合成的mRNA或从HPV18生产细胞分离的mRNA。
在寄主细胞中表达HPV18蛋白后，可以回收HPV18蛋白以提供纯化形式的HPV18。有几种适用的HPV18纯化方法。如本文所述，可以通过盐分级分离，离子交换层析，大小排斥层析，羟磷灰石吸附层析和疏水作用层析的各种组合或分别应用从细胞溶胞物和提取液中纯化重组HPV18蛋白。
另外，通过使用特异于全长新生HPV18，或HPV18的多肽片段的单克隆或多克隆抗体制成的免疫亲和柱可以从其它细胞蛋白分离重组HPV18。根据各种本领域已知的方法可以制备单克隆和多克隆抗体。将本文所用的单克隆或单特异抗体定义为具有HPV18的同源结合特征的单个抗体种类或多个抗体种类。本文所用的同源结合是指抗体种类与特异抗原或表位结合的能力。
很明显，可以利用生产单特异抗体的方法生产特异于HPV18多肽片段或全长新生HPV18多肽的抗体。具体地说，显而易见可以生产特异于完全功能的HPV18或其片段的单特异抗体。
本发明还涉及筛选在体内调节编码HPV18的DNA或RNA的表达以及调节HPV18蛋白的功能的化合物的方法。调节这些活性的化合物可以是DNA，RNA，肽，蛋白质，或非蛋白性质的有机分子。化合物可以通过提高或减弱编码HPV18的DNA或RNA的表达，或HPV18蛋白的功能来调节。通过各种测定方法可以检测调节编码HPV18的DNA或RNA的表达或HPV18蛋白的功能的化合物。测定方法可以是简单的“是/否”测定方法以确定是否存在表达或功能的变化。可以通过将测试样品的表达或功能与标准样品的表达或功能水平进行比较而进行定量测定。
可以制备含有HPV18 DNA，HPV18 DNA的片段，抗HPV18 DNA或HPV18蛋白的抗体，HPV18 RNA或HPV18蛋白的试剂盒。将这样的试剂盒用于检测与HPV18 DNA杂交的DNA或检测样品中HPV18蛋白或肽片段的存在。这一特征可用于各种目的包括，但不限于法医分析和流行病研究。
可以合成与编码HPV18的DNA序列互补的核苷酸序列以进行反义治疗。这些反义分子可以是DNA，DNA的稳定衍生物如偶磷代硫酸盐或甲基磷酸盐，RNA，RNA的稳定衍生物如2’-O-烷基RNA，或其它模拟的HPV18反义寡核苷酸。可以通过微注射，脂质体包被或从含有反义序列的载体表达将HPV18反义分子导入细胞。HPV18反义治疗对于减弱HPV18活性是有利的疾病的治疗特别有用。
术语“化学衍生物”描述了含有通常不是非基础分子的部分的其它化学部分的分子。这些组分能提高基础分子的溶解性，半寿期，吸收性，等等。另一种情况是，这些部分能减弱基础分子的不需要的副作用或减少基础分子的毒性。各种文章如Remington’s Pharmaceutical Sciences都叙述了这些部分的例子。
为了在使任何潜在毒性最小化时得到HPV18或它的活性最佳抑制，可以以常规测试确定的适当剂量单独使用根据本文公开的方法鉴定的化合物。另外，共同服用或依次服用其它试剂是令人满意的。
优点是本发明的化合物可以以单个的每天剂量给药，或每天总的剂量以几次分剂量施用。进一步，可以通过各种途径包括但不限于鼻内，口，皮下或以栓剂施用本发明的化合物。
为了用超过一种活性试剂联合治疗，只要活性试剂是单独的剂量配方，可以同时施用活性试剂，或可以在分开的时期单个施用。
根据各种因素包括病人的类型，种族，年龄，体重，性别和医疗条件；待治疗症状的严重性；给药的途径；病人的肾和肝功能；所用的具体化合物来选择利用本发明的化合物的剂量规则。一个普通技术人员可以容易地确定和预定用于防止，制止或抑制症状的发展所需要的药物的有效量。达到产生无毒性效能范围的药物浓度的最佳精确度需要根据靶位点得到药物的动力学的规则。这包括药物分布，平衡，和消除的情况。
在本发明的方法中，本文详细叙述的化合物可以形成活性成份，并通常基于准备给药的形式，即口服片剂，胶囊，酏剂，糖浆，栓剂，凝胶和诸如此类的适当选择的合适的药学稀释剂，赋形剂或载体(本文总称为“载体”物质)混合给药，并符合常规的药学实践。
例如，对于片剂或胶囊形式的口服给药，可以将活性药物成份与口服的，非毒性的药学可接受惰性载体如乙醇，甘油，水和诸如此类组合。此外，只要是所需要的或必需的，也可以将适当的粘合剂，润滑剂，崩解剂和着色剂掺入混合物中。适当的粘合剂包括不限于，淀粉，凝胶，天然糖如蔗糖或β-半乳糖，玉米甜味剂，天然和合成的树胶如金合欢胶，黄蓍胶或藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙烯乙二醇，蜡和诸如此类。以这些剂量形式使用的润滑剂包括，不限于油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠和诸如此类，崩解剂包括，不限于淀粉，甲基纤维素，琼脂，斑脱岩，黄原胶和诸如此类。
对于液体形式，可以将活性药物成份与适当调味的悬浮或分散剂如合成的和天然树胶，例如黄蓍胶，金合欢胶，甲基纤维素和诸如此类结合。可使用的其它分散剂包括甘油等等。对于肠胃外给药，无菌的悬浮液和溶液是如人所愿的。当需要静脉内给药时使用通常含有适当的防腐剂的等渗制剂。
可以将含有活性药物成份的局部制剂与各种本领域熟知的载体物质如乙醇，库拉索芦荟树胶，尿囊素，甘油，维生素A和E油，矿物油，PPG2十四烷基丙酸酯，和诸如此类混合以形成例如酒精溶液，局部清洁剂，清洁奶液，皮肤胶，皮肤洗液，和奶液香波或凝胶配方。
本发明的化合物也可以以脂质体释放系统形式如小的单层泡囊，大的单层泡囊和多层泡囊给药。可以从各种磷脂如胆固醇，硬脂酰胺或磷脂酰胆碱形成脂质体。
也可以通过利用单克隆抗体作为被化合物分子偶联的单个载体来释放本发明的化合物。也可以将本发明的化合物与作为可靶击的药物载体的可溶聚合物偶联。这样的聚合物包括聚乙烯基吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙基甲基丙烯酰胺酚，聚羟乙基天门冬酰胺酚，或用棕榈酰残基取代的聚乙基氧化烯聚赖氨酸。进一步，可以将本发明的化合物与一类用于获得药物的控制释放的生物降解聚合物例如，聚乳酸，聚ε-己内酯，聚羟基丁酸，聚正酯，聚乙缩醛，聚二氢吡喃，聚氰基丙烯酸酯和交联的或两亲性封闭的水凝胶共聚物偶联。
下面的实施例同样不受限制地说明本发明。
实施例1HPV18基因组的克隆用标准技术从人宫颈癌起源的细胞系，SW756(Freedman，R.S.，etal.，1982.体外，Vol18，719-726页)制备总基因组DNA。用EcoRI消化DNA并在0.8％的低熔点的琼脂糖制备性的凝胶上电泳。切下对应于长度约12kbp的DNA片段的凝胶薄片。用AgaraseTM酶(BoehringerMannheim.Inc.)消化琼脂糖并沉淀大小分级的DNA，脱磷酸，与EcoRI消化的λEMBL4臂(Stratagene，Inc.)连接。用Gigapack IIGold包装提取液(Stratagene，Inc.)包装λ文库。用根据公开的HPV18L1 DNA序列(Cole和Danos，1987，J，Mol.Biol.，Vol.193599-608基因库登记号#X05015)设计的寡核苷酸引物和SW756DNA作为模板进行的聚合酶链式反应(PCR)产生的700bp HPV18L1 DNA探针来鉴定HPV18阳性克隆。分离HPV18阳性λ克隆，它含有12kbp EcoRI片段插入物并且被命名为#187-1。
实施例2构建酵母表达载体通过利用#187-1克隆作为模板，腔门(Vent)聚合酶TM(新英格兰实验室，Inc.)，10次扩增循环(94℃，1分钟；50℃，1分钟；72℃，2分钟)和下面含有侧接BglII位点(底下划线)的寡核苷酸引物有意义引物，5’-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG-3’，反义引物，5′-GAAGATCTTTACTTCCTGGCACGTACACGCACACGC-3′.
的PCR扩增HPV18L1开放读码框架(ORF)。有意义引物在紧接HPV18L1起始甲硫氨酸密码子(黑体标出)的上游导入酵母非翻译引导序列(Kniskern，et al.，1986，基因，Vol.46135-141)。用BglII消化1.5kbp L1 PCR产物并凝胶纯化。
通过从含有来自质粒pBM272(由Mark Johnston，WashingtonUniversity，St.Louis，MO提供)的啤酒酵母双向GAL1-GAL10启动子的pUC18/双向GAL启动子质粒分离一个1.4bp SphI片段构建pGAL1-10酵母表达载体。双向启动子的每侧与一个拷贝的酵母ADH1转录终止子侧接，一个BamHI克隆位点位于GAL1启动子和ADH1转录终止子的第一个拷贝之间，一个SmaI克隆位点位于GAL10启动子和ADH1转录终止子的第二个拷贝之间。用SphI消化由pBR322，酵母LEU2d基因，和酵母2u质粒构成的酵母穿梭载体(Benjamin Hall，华盛顿大学，西雅图，WA惠赠)并与1.4kbp SphI双向GAL启动子片段连接得到pGAL1-10。用BamH1在GAL1启动子和ADH1转录终止子之间切开使pGAL1-10线性化。连接BamHI消化的载体和BglII消化的HPV18L1PCR片段并用于转化大肠杆菌DH5细胞(Gibco BRL，Inc)。分离含有HPV18L1基因的pGAL1-10质粒并命名为p191-6。
构建了协同表达HPV18L1和L2基因的酵母表达载体。用SmaI在GAL10启动子和ADH1转录终止子之间切开以便消化质粒p191-6(pGAL1-10+HPV18L1)。用下面含有侧接SmaI位点(底下划线)的寡核苷酸引物有意义引物，5′-TCCCCCGGGCACAAAACAAAATGGTATCCCACCGTGCCGCACGAC-3′，反义引物，5′-TCCCCCGGGCTAGGCCGCCACAAAGCCATCTGC-3.
通过如上所述的PCR扩增1.4kbp HPV18L2基因。有意义引物在紧接着HPV18L2起始甲硫氨酸密码子(黑体标出)的上游导入酵母非翻译引导序列(Kniskern et al.，1986，如上所述)。用SmaI消化PCR片段，凝胶纯化并与SmaI消化的p191-6质粒连接。分离含有HPV18L1和L2基因的pGAL1-10质粒并命名为p195-11。
实施例3临床样品分型将在Indianapolis，IN的退伍军人管理局医学中心(经Dr.Darron Brown同意)和在Philadelphia，PA的Albert Einstein医学中心(经Dr.Joan Adler同意)收集的宫颈活体解剖样品并冷冻在-20℃。如Brown etal.，1993(Brown.D.et al.，1993，J.Clin.Microbiol.，Vol.312667-2673)所述分离DNA。简要地说，用Braun小肢解器II(B.Braun仪器。Melsungen，德国)加工临床样品，并增溶于含有10mM EDTA和0.6％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液中。用20mM Tris pH7.4调节样品，在存在0.1mcg/mlRNase A时用50mcg/ml蛋白酶消化蛋白质，接着用酚/氯仿/异戊醇萃取。乙醇沉淀DNA并用分光光度法定量测定。
用PCR和Southern印迹分析筛选DNA样品中HPV18的存在。用下面的寡核苷酸引物有意义引物，5′-CAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATG-3′，反义引物，5′-CATCATATTGCCCAGGTACAGGAGACTGTG-3′.
通过PCR扩增HPV18L1 ORF的一个256bp的部分。根据AmpliTaqTMDNA聚合酶/基因AmpTM试剂盒(Perkin Elmer corp.)的制造商的指导确定PCR条件不同的是利用0.5μl临床样品DNA作模板并且最后反应混合物中存在每种引物10pmole，2mM dNTPs和2.0mM MgCl2。接着一个2分钟，94℃变性步骤扩增40次循环(94℃，1分钟；45℃，1分钟；72℃，1分钟)。
将PCR产物通过3.0％琼脂糖凝胶电泳，影印到尼龙膜上，与32P-标记的HPV18L1特异性寡核苷酸探针杂交。
实施例4对L1和L2基因进行DNA测序用PRIZM测序试剂盒和自动DNA ABI测序仪#373A(AppliedBiosystems)对克隆#187-1，p191-6和p195-11的HPV18L1和L2基因进行测序。为了得到共有HPV18序列，通过PCR从人临床分离物扩增L1基因DNA部分，序列分析，和已公开和要求保护的序列比较。为了这一目的，利用寡核苷酸和实施例3所述的热循环从每个临床DNA分离物扩增一个256bp片段(核苷酸817-1072)。利用实施例3所述的热循环将下面的引物，5’-5′-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG-3′和5′-CCTAACGTCCTCAGAAACATTAGAC-3′用于扩增L1DNA的氨基末端432bp部分(核苷酸1-431)。利用制造商推荐的试剂和方法将两个PCR产物分别与质粒pCRII(Invitrogen Corp.)连接。从转化体中分离质粒DNA并对那些含有EcoRI插入物的质粒进行序列分析。
实施例5分析DNA和推测的氨基酸序列图1显示了要求保护的HPV18L1的核苷酸和推测的氨基酸(aa)序列。该DNA序列起源于共有克隆#187-1，p191-6，p195-11。对要求保护的HPV18L1核苷酸序列和公开的HPV18L1序列(基因库登记号#X05015)的比较鉴定出1524bp中有20bp变化。五个核苷酸变化(89位的C-G，263位的C-A，848位的C-G，967位的G-A和1013位的C-G)导致氨基酸取代。与公开物不同的五个残基是氨基酸30，283，338位的P-R，氨基酸88位的T-N和氨基酸323位的V-I(图2)。88和323位代表保守变化而三个P-R变化确实可以改变表达的L1蛋白的物理特性。
图2显示了对来源于临床分离物(354，556，755，697，795和23号)的氨基酸序列和要求保护的序列和已公开序列的比较。临床分离物和要求保护的序列与公开序列在四个位点存在差异。在至今发现的所有分离物包括要求保护的序列中位点30，283和338编码精氨酸(R)。这与公开序列完全相反，公开序列中每个这些位点是脯氨酸(P)。另外，在分离物和要求保护的序列的88位点是天冬酰胺(N)而在公开序列中是苏氨酸(T)。最后的差异是发现在许多临床分离物和公开菌株中位点323是缬氨酸(V)而在要求保护序列和一种分离物(#23)中是异亮氨酸(I)。结论是要求保护序列代表了与临床感染相关的主要病毒序列，公开序列中缺乏含有任何30，283，338位点的脯氨酸的分离物暗示了已公开克隆是仿制物或不合逻辑的亚型。
HPV18L2的核苷酸和推测的氨基酸序列起源于克隆#187-1和p195-11的共有序列并表示在图3。一个对L2核苷酸序列和公开的HPV18序列(基因库登记号#X05015)的比较鉴定出1389bp中有40bp变化。bp差异导致14个氨基酸水平的变化氨基酸29的P→S，氨基酸33的P→N，氨基酸177的A→S，氨基酸266的D→E，氨基酸270的D→N，氨基酸346的D→G，氨基酸355的M→I，氨基酸359的V→M，氨基酸365的S→P，氨基酸369的F→S，氨基酸371的F→V，氨基酸372的F→S，氨基酸373的K→T和氨基酸409的S→P。
实施例6HPV18L2抗血清的生成用在大肠杆菌中表达的trpE-HPV18L2融合蛋白在山羊中制备HPV18L2特异性抗体。利用提供在5’-和3’-末端分别侧接HindIII和BamHI位点的寡核苷酸引物通过PCR扩增全长的L2ORF。将L2片段插入HindIII-BamHI消化的pATH23表达质粒(Koerner etal.，1991，Meth.Enzymol.Vol.194477-490)。在用3-b-吲哚丙烯酸诱导后，在大肠杆菌RR1细胞(Gibco BRL)中表达融合蛋白。通过SDS-PAGE分析不溶部分接着用考马斯蓝染色。trpE-L2融合蛋白是大肠杆菌不溶组分的主要部分。根据Pocono Rabbit Farm和实验室Inc.的用于融合蛋白抗原(蛋白质Rabbit Farm，Canadensis，PA)的标准方法用trpE-L2融合蛋白免疫接种山羊。
实施例7制备酵母菌株U9从Dr.Leland Hartwell(华盛顿大学，西雅图，WA)处得到啤酒酵母菌株2150-2-3(MATalpha，leu2-04，adel，cir0)。在30℃在YEHD培养基(Carty et al.，J.Ind Micro 2(1987)117-121)中过夜繁殖菌株2150-2-3的细胞。在无菌蒸馏水中洗涤细胞3次，重悬浮于2ml无菌蒸馏水，为了筛选ura3突变体在6个5-氟乳清酸(FOA)平板的每一个上铺0.1ml细胞悬浮液(冷泉港实验室酵母遗传学手册)。在30℃温育平板。培养基中每250ml蒸馏水含有3.5g，无氨基酸和硫酸铵的Difco酵母氮基质；0.5g 5-氟乳清酸；25mg尿嘧啶；和10.0g葡萄糖。
通过0.2um膜过滤，将培养基灭菌，然后与250ml保持在50℃的4％的Bacto-琼脂(Difco)，10ml1.2mg/ml腺苷酸溶液，和5mlL-亮氨酸溶液(180mg/50ml)混合。在每个培养皿中分配20ml得到的培养基。
在温育5天后，出现大量的克隆。通过将起始FOA平板的菌落再划线到新鲜FOA平板上分离单个菌落，然后在30℃温育平板。通过复制平板到YEHD平板和无尿嘧啶的平板上测试来自第二套FOA平板的大量菌落中ura3突变体的存在。预期的结果是在YEHD上良好生长，在无尿嘧啶培养基上不生长。得到一个显示这些特性的分离物(U9)。将它以冰冻甘油储存物(菌株#325)在-70℃储存备用。
实施例8制备一个破裂酵母MNN9基因的载体为了制备一个破裂MNN9基因的载体，必须首先从啤酒酵母基因组DNA克隆MNN9基因。这是通过标准的聚合酶链式反应(PCR)技术完成的。根据公开的酵母MNN9基因序列(酶遗传学EPO专利申请号.88117834.7，公开号.0-314-096-A2)设计PCR的全长MNN9编码序列的5’有意义引物和3’反义引物。利用了下面含有侧接HindIII位点(底下划线)的低聚脱氧核苷酸引物有意义引物5’-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TIC TCT TGT ATC G-3’反义引物5’-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3’。
用黑体字标出了MNN9基因的起始甲硫氨酸密码子。利用来自啤酒酵母菌株JRY188的基因组DNA作模板，Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)和25次扩增循环(94℃1分钟，37℃2分钟，72℃3分钟)进行PCR。用HindIII消化得到的1.2kbp PCR片段，凝胶纯化，并与HindIII消化的，碱性磷酸酶处理的pUC13(Pharmacia)连接。命名得到的质粒为pl183。
为了用酵母URA3基因破裂MNN9基因，用HindIII消化质粒pBR322-URA3(它含有1.1kbp的编码亚克隆到pBR322的HindIII位点的啤酒酵母URA3基因的HindIII片段)并且凝胶纯化1.1kbp含有功能URA3基因的DNA片段，用T4DNA聚合酶补平末端，然后与PmlI-消化的质粒pl183(在MNN9编码序列内用PmlI切)连接。得到的质粒pl199含有被功能URA3基因破裂的MNN9基因。
实施例9
构建含有破裂的MNN9基因的U9-衍生菌株1372为了破裂菌株U9(#325)中的MNN9基因，用HindIII消化30ug质粒pl199得到线性mnn9∷URA3破裂盒。用原生质体方法(Hinnen etal.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA751929-1933)用HindIII消化的pl199DNA转化菌株325的细胞，在缺乏尿嘧啶和含有1.0M的山梨醇的合成琼脂培养基上选择转化体。合成培养基每升蒸馏水含有琼脂，20g；酵母氮基质w/o氨基酸，6.7g；腺苷酸，0.04g；L-酪氨酸，0.05g；山梨醇，182g；葡萄糖，20g；和去亮氨酸溶液#2，10ml。去亮氨酸溶液#2含有每升蒸馏水L-精氨酸，2g；L-组氨酸，1g；L-亮氨酸，6g；L-异亮氨酸，6g；L-赖氨酸，4g；L-甲硫氨酸，1g；L-苯丙氨酸，6g；L-苏氨酸，6g；L-色氨酸，4g。
在30℃温育平板5天，在此期间出现大量的菌落。从10个克隆制备染色体DNA制备物，然后用EcoRI和HindIII消化。然后用1.2kbp含有MNN9基因(从质粒pl199分离)的HindIII片段作为探针通过Southern印迹杂交(J.Sambrook et al.，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版，1989)评估DNA消化物。鉴定了在Southern印迹上显示预期的DNA带移动以及通常由mnn9突变体显示的特别凝块的分离物(菌株#1372)。
实施例10构建破裂酵母HIS3基因的载体为了构建啤酒酵母HIS3基因被URA3基因破裂的破裂盒，用BamHI消化质粒YEp6(K.Struhl et al.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA761035)并凝胶纯化含有HIS3基因的1.7kbp BamHI片段，用T4DNA聚合酶补平末端，与已经用BamHI消化和用T4DNA聚合酶处理的pUC18连接。用NheI消化(在HIS3编码序列切割)得到的质粒(命名为pl501或pUC18-HIS3)并凝胶纯化载体片段，用T4DNA聚合酶补平末端，然后用牛肠碱性磷酸酶处理。通过用HindIII消化从质粒pBR322-URA3分离URA3基因并且凝胶纯化含有URA3基因的1.1kbp片段，用T4DNA聚合酶补平末端，与上面的pUC18-HIS3 NheI片段连接。得到的质粒(命名为pUC18-his3∷URA3或pl505)含有酵母HIS3基因被功能URA3基因破裂的破裂盒。
实施例11
构建由HIS3基因破裂酵母PRB1基因的载体Carnegie-Mellon大学的Dr.E.Jones(C.M.Moehle et al.1987，遗传学115255-263〕提供了含有啤酒酵母PRB1基因的质粒FP8ΔH。用HindIII加XhoI消化，凝胶纯化含有PRB1基因的3.2kbp DNA片段，用T4DNA聚合酶处理补平末端。用BamHI消化质粒pUC18，凝胶纯化，用T4DNA聚合酶处理来补平末端。将得到的载体片段与上面的PRB1基因片段连接产生质粒pUC18-PRB1。用BamHI消化含有HIS3基因的质粒YEp6。凝胶纯化得到的含有功能HIS3基因的1.7kbpBamHI片段，然后用T4DNA聚合酶处理来补平末端。用EcoRV加NcoI在PRB1编码序列内切割以消化质粒pUC18-PRB1，除去蛋白酶B活性位点和侧接序列。凝胶纯化含有pUC18中残留的PRB1编码序列5’和3’部分的5.7kbpEcoRV-NcoI片段，用T4DNA聚合酶处理来补平末端，用牛肠碱性磷酸酶去磷酸，与上述补平末端的HIS3片段连接。得到质粒(命名为pUC18-prb1∷HIS3，母株#1245)含有代替了在上面缺失的PRB1基因部分的功能HIS3基因。
实施例12构建含有MNN9和PRB1基因的破裂的U9相关的酵母菌株实施例9叙述了含有MNN9基因破裂的U9相关的菌株1372。将菌株1372的克隆分离物平铺在FOA平板上(如实施例7所述)筛选ura3突变体。得到大量的菌株1372的ura3分离物，选择一个特定的分离物(菌株12930-190-S1-1)用于随后的HIS3基因的破裂。用XbaI加EcoRI消化pUC18-his3∷URA3基因破裂载体(pl505)产生线性his3∷URA3破裂盒并通过醋酸锂方法(酶学方法194290(1991))将其用于转化菌株12930-190-S1-1。在合成的缺乏尿嘧啶的琼脂培养基上筛选Ura+转化体，在同样的培养基上再划线得到克隆分离物，然后复制平板接种到缺乏尿嘧啶或组氨酸的培养基上筛选那些Ura+和His-的分离物。选择一个分离物(菌株12930-230-1)作随后的PRB1基因的破裂。用SacI加XbaI消化PRB1基因破裂载体(pUC18-prb1∷HIS3，母株#1245)产生线性prb1∷HIS3破裂盒并用醋酸锂方法将其用于转化菌株12930-230-1。在缺乏组氨酸的琼脂培养基上筛选His+转化体并在同样的培养基上再划线得到克隆的分离物。从大量的得到的His+分离物制备基因组DNA，用EcoRI消化，然后在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。然后用放射性标记的617bp探针对PRB1基因进行Southern印迹分析，已经利用下面的低聚脱氧核苷酸引物5′TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3′5′CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3′制备了该PRB1基因。
得到了十一个分离物，它们显示了所希望的探针与2.44kbp prb∷HIS3DNA片段的杂交。这和探针与1.59kbp的野生型PRB1基因片段的杂交不同。选择一个含有需要的prb1∷HIS3破裂的这些分离物作进一步的使用并将它命名为菌株#1558。
实施例13酵母中HPV18L1和L2的表达利用质粒pl91-6(pGAL1-10+HPV18L1)和pl95-11(pGAL1-10+HPV18L1+L2)转化啤酒酵母菌株#1558(MATa，leu2-04，prb1∷HIS3，mnn9∷URA3，ade1，cir0)。克隆分离物在30℃于含有2％半乳糖的YEHD的培养基上生长88小时。收集细胞后，用玻璃珠破碎细胞沉淀并通过免疫印迹方法分析细胞溶菌物中HPV18L1和/或HPV18L2蛋白的表达。将含有25ug总细胞蛋白的样品在变性条件下通过10％Tris-甘氨酸凝胶(Novex，Inc.)电泳并电印迹到硝酸纤维滤纸上。利用抗trpE-HPV11L1融合蛋白产生的兔抗血清作为初级抗体(Brown et al.，1994，病毒学20146-54)和连接辣根过氧化物酶(HRP)的猴抗兔IgG(Amersham，Inc.)作为次级抗体免疫检测L1蛋白。用化学发光ECLTM检测试剂盒(Amersham，Inc.)处理滤纸。在L1和L1+L2共表达酵母克隆(分别是菌株1725和1727)中检测到50-55KDaL1蛋白带而在阴性对照(没有L1或L2的pGAL1-10)中没有(图4)。
利用抗trpE-HPV18L2融合蛋白产生的山羊多克隆抗血清作为初级抗体接着利用与HRP缀合的，兔抗山羊IgG(Kirkegaard和Perry实验室，Gaithersburg，MD)通过Western分析检测HPV18L2蛋白。如上所述加工滤膜。在L1+L2共表达酵母克隆(菌株1727)中检测到作为75kDa蛋白带的L2蛋白而在阴性对照或L1表达克隆中没有(图5)。
实施例14HPV18L1(菌株1725)和18L1+ΔL2(菌株1727)的发酵将菌株1725和菌株1727的表面生长的平板培养物无菌地转移到无亮氨酸的液体培养基中，该培养基含有(每L)8.5g无氨基酸和硫酸铵的Difco酵母氮基质；0.2g腺苷酸；0.2g尿嘧啶；10g琥珀酸；5g硫酸铵；40g葡萄糖；0.25gL-酪氨酸；0.1gL-精氨酸；0.3gL-异亮氨酸；0.05gL-甲硫氨酸；0.2gL-色氨酸；0.05gL-组氨酸；0.2gL-赖氨酸；0.3gL-苯丙氨酸；在灭菌前用NaOH将该培养基调节至pH5.0-5.3。在28℃，250rpm的旋转摇床上生长后，通过在储存于-70℃前加无菌甘油到最后浓度17％(w/v)制备冷冻培养物小玻璃瓶(每个冷小玻璃瓶1ml)。通过转移冷冻培养小玻璃瓶的解冻内含物和在28℃，250rpm的旋转摇床上温育29小时开始在同样的培养基中扩展接种物(500ml每2-L烧瓶)。在接种后每个菌株的发酵使用具有工作体积10L的NewBrunswick SF-116发酵器。生产培养基含有(每L)20g Difco酵母提取液；10g Sheffield Hysoy蛋白胨；20g葡萄糖；20g半乳糖；0.3ml UnionCarbide UCONLB-625防沫剂；在灭菌前将培养基pH调节至5.3。将2-L接种物烧瓶的全部内含物(500ml)转移到发酵器中，在28℃，每分钟5L空气，400rpm，3.5psi压力下温育发酵器。由于需要保持溶解氧水平高于饱和度的40％，需要增加搅拌。通过脱线葡萄糖测量(Beckman葡萄糖2分析器)和在线总光谱测定法(Perkin-Elmer1200)检测发酵的进程。在温育66小时后达到每L9.5-9.7g干细胞重的密度。用中纤维滤器(在Amicon DC-10过滤系统中的Amicon H5MP01-43柱体)浓缩培养物到约2L，用2L磷酸缓冲盐二次过滤，在分配进500-ml离心瓶中之前进一步浓缩(到约1L)通过在4℃，在8,000rpm(Sorval GS-3离心机)离心20分钟收集细胞沉淀。丢弃上清液后，在-70℃储存沉淀(总共191-208g湿细胞)直到使用。
实施例15重组HPV型18L1衣壳蛋白的纯化除非特别说明所有步骤在4℃进行。
在-70℃冷冻储存细胞。在20-23℃解冻冰冻细胞(湿重＝126g)，重悬浮于70ml“Breaking Buffer”(20mM磷酸钠，pH7.2,100mMNaCl)。分别加入蛋白酶抑制剂PMSF和pepstatinA到最后浓度为2mM和1.7μM。在约16,000psi的压力下通过于M110-Y小流体化器(Microfluidics Corp.，Newton，MA)传递4次破碎细胞不溶解物。在12,000×g离心破碎的细胞不溶解物40分钟除去细胞碎片。收集含有L1抗原的上清液体。
通过加缓冲液A以1∶5稀释上清液，并加到用缓冲液A平衡过的FractogelEMD TMAE-650(M)树脂(EM Separations，Gibbstown，NJ)的阴离子交换捕获柱(9.0cm ID×3.9cm)。在用缓冲液A洗后，用缓冲液A中0-1.0M NaCl的梯度洗脱抗原。用Bradford方法测定柱馏分的总蛋白。然后以同样的总蛋白负载用Werstern印迹和银染检测的SDS-PAGE分析这些馏分。
合并显示可比纯度和丰度的L1蛋白的TMAE馏分。用硫酸铵分级分离浓缩抗原。通过边加入固体试剂，边温和搅拌10分钟以上将溶液调节到含35％饱和硫酸铵。将样品置于冰上，允许进行沉淀4小时。在16,000×g离心样品45分钟。将沉淀重悬浮于20.0mlPBS(6.25mM磷酸钠，pH7.2，1.50mM NaCl)。
在Sephacryl 500HR树脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)的大小排阻柱(2.6cm ID×89cm)上层析重悬浮沉淀。跑柱缓冲液是PBS。用Western印迹和银染检测的SDS-PAGE分析收集的馏分。合并purest馏分。用43mmYM-100平层膜(Amicon，Beverly，MA)，在4-6psi的N2下在50ml的搅动室中浓缩得到的合并物。
用Western印迹和胶质考马斯检测的SDS-PAGE分析最后的产物。估计50％-60％L1蛋白是同质的。用Western印迹证实L1蛋白的同一性。等分最后的产物并储存于-70℃。这一过程总共得到12.5mg的蛋白质。
Bradford分析测定总蛋白用市场购买得到的考马斯Plus试剂盒(Pierce，Rockford，IL)测定总蛋白。在Milli-Q-H2O中将样品稀释到适当的水平。对于标准和微测定方法需要的体积分别是0.1ml和1.0ml。对于两种方法，都利用BSA(Pierce，Rockford，IL)产生标准曲线。根据制造商的指导进行测定。用CricketGraph软件在Macintosh Iici计算机上画出标准曲线。
SDS-PAGE和Western印迹测定所有凝胶，缓冲液，和电泳仪器是从Novex(San Diego，CA)得到的并根据制造商的指导进行。简要地说，在Milli-Q-H2O中将样品稀释成相等的蛋白质浓度并以1∶1与含有200mMDTT的样品温育缓冲液混合。在100℃温育样品15分钟并加到预先铸好的12％Tris-甘氨酸凝胶。在125V将样品电泳1小时45分钟。用更改的Heukeshoven和Dernick[电泳，6(1985)103-112]方法银染或者用市场得到的试剂盒(IntegratedSeparation Systems，Natick，MA)胶质考马斯染色将凝胶显色。
对于Western印迹试验中，在25V用40分钟时间将蛋白质转移到PVDF膜上。用Milli-Q-H2O洗膜，空气中干燥。初级抗体是抗TrpE-HPV11L1融合蛋白(Dr.Brown赠送)产生的多克隆兔抗血清。过去的实验已经证明该抗血清在Western印迹中与18型HPVL1交叉反应。用吸印缓冲液(5％的溶于6.25mM磷酸钠中的脱脂牛奶，pH7.2，150mMNaCl，0.02％NaN3)稀释抗血清制备抗体溶液。在20-23℃温育至少1小时。变换3次PBS(6.25mM磷酸钠，pH7.2，150mM NaCl)各洗涤印迹1分钟。用印迹缓冲液稀释与山羊抗兔IgG碱性磷酸酶连接的共轭抗血清(Pierce，Rockford，IL)制备次级抗体溶液。在同样条件下进行温育至少1小时。如上所述洗涤印迹，用一步NBT/BCIP底物(Pierce，Rockford，IL)检测。
实施例16电子显微镜研究在EM分析(Structure Probe，West Chester，PA)中，将每个样品的等分试样置于200目碳包衣的铜网上。将一滴2％的磷钨酸(PTA)pH7.0置于网上20秒。在透射EM检查前允许将网空气干燥。用JEOL100CX透射电子显微镜(JEOL USA，Inc.)在加速电压100kV下进行所有的显微观察。产生的显微相片最后放大100,000倍。在含有HPV18L1表达质粒中观察到病毒样颗粒大小范围50-55nm(图6)。在酵母对照样品中没有观察到VLP。
实施例17将HPV18cDNA亚克隆到表达载体为了在转染寄主细胞中表达HPV18蛋白和在体外转录/转译，将编码HPV18的cDNA亚克隆进入几个载体。这些载体包括pBluescriptIISK+(其中T7或T3启动子驱动表达)，pcDNAI/Amp(其中巨细胞病毒(CMV)启动子驱动表达)，pSZ9016-1(其中HIV长终止重复(LTR)启动子驱动表达)，和杆状病毒转移载体pAcUW51(PharMingen，Inc.)(其中多面体(PH)启动子驱动表达)，用于生产含有编码HPV18的DNA序列的重组杆状病毒。
a)pBluescript II SK+HPV18。
通过限制性EcoRI消化从λ噬菌体重新得到全长的HPV18cDNA克隆和连接进EcoRI切割的，CIP处理的pBluescriptIISK+。收集独立的亚克隆，其中HPV18的有意义方向与T7或T3启动子相接。
b)pcDNAI/AmpHPV18。
为了简化定向的克隆，用EcoRV和XbaI从pBliuscriptIISK+HPV18的纯化质粒制备物中切下HPV18，在该质粒中，HPV18DNA序列是在T7启动子的下游。纯化得到的EcoRV，XbaI HPV18片段，将其与EcoRV切割的，XcaI切割的，CIP处理的pcDNAI/Amp连接以致编码HPV18的DNA在CMV启动子的下游。
c)pSZ9016-1HPV18。
通过有限的EcoRI消化从pBluescriptIISK+HPV18切下HPV18并随后从琼脂糖凝胶上纯化1.3kb的片段。将得到的EcoRI HPV18片段与EcoRI切割，CIP处理的pSZ9016-1连接。选择HPV18的有意义方向在HIVLTR启动子下游的亚克隆。
d)pAcUW51HPV18L1。
用提供侧接BglII位点的寡核苷酸引物从克隆#187-1通过PCR扩增全长HPV18L1ORF。将L1基因插入杆状病毒转移载体pAcUW51(PharMingen，Inc.)的BamHI位点处于多面体启动子的控制下。根据Pharmingen手册叙述的方法生产含有HPV18L1表达盒的重组杆状病毒。通过有限稀释和点印迹杂交纯化重组克隆。
实施例18通过体外转录/转译和转染进寄主细胞表达HPV18多肽利用含有HPVDNA序列的载体在兔网织红细胞溶胞物，哺乳动物寄主细胞，和杆状病毒感染的昆虫细胞中驱动HPV18多肽的转译。这些实验方案基本上概况于制造商的说明中。
a)体外转录/转译。用BamHI在HPV18插入的下游消化使pBluescriptIIISK+HPV18质粒DNA(在T7方向具有HPV18)线性化。纯化线性质粒，存在m7G(5’)ppp(5’)G时利用T7RNA聚合酶，将该质粒用作模板进行转录。通过LiCl沉淀纯化得到的带帽的HPV18转录物并用于在核酸酶预处理的兔网织红血球溶解物中，在存在L-[35S]甲硫氨酸时驱动HPV18的转译。
b)在哺乳动物细胞中表达。在用pcDNAI/AmpHPV18(在CMV启动子的控制下)或pSZ9016-1HPV18(在HIVLTR启动子的控制下)转染后在哺乳动物寄主细胞中表达HPV18蛋白。在后一种情况(pSZ9016-1HPV18)，将细胞与TAT表述质粒pSZ90161TAT共转染。对于两个HPV18表达质粒，用DEAE-葡聚糖或用Lipofectamine的脂质转染(BRL)转染COS-7细胞。
c)在昆虫细胞中表达。通过体内同源重组，利用含有HPV18L1的杆状病毒转移载体pAcUW51HPV18L1生产重组杆状病毒(Autographacalifornica)。然后在用含有HPV18的重组杆状病毒感染后在生长在悬浮培养物中的Sf9(Spodopterafrugiperda)昆虫细胞中表达表位标记的HPV18L1。
实施例19通过各种方法可以检测影响HPV18活性的化合物。一个鉴定影响HPV18的化合物的方法包括(a)将测试化合物与含有HPV18的溶液混合形成混合物；(b)测定混合物中HPV18活性；和(c)将混合物中的HPV18与标准比较。
可以将影响HPV18活性的化合物配制成药物组合物。这些药物组合物可用于治疗具有HPV18感染特征的疾病和症状。
实施例20用探针检测与编码HPV18的DNA结构上相关的DNA。一个适当的探针可以来源于具有图1或图3的所有或部分核苷酸序列的DNA，具有所有或部分图1或图3的核苷酸序列或起源于图1或图3的部分序列的简并寡核苷酸的DNA编码的RNA。
权利要求
1.编码18型人乳头状瘤病毒的分离和纯化DNA分子或其功能衍生物。
2.根据权利要求1所述的分离和纯化的DNA分子，它选自图1显示的核苷酸序列，图3显示的核苷酸序列，图1显示的核苷酸序列的功能衍生物，和图3显示的核苷酸序列的功能衍生物。
3.在寄主中表达权利要求1的DNA分子的表达载体。
4.权利要求1的DNA分子编码的基本纯化的蛋白质。
5.与选自权利要求1的DNA分子，与权利要求1的DNA分子互补的RNA或权利要求1的DNA分子编码的蛋白质的化合物发生免疫反应的抗体。
6.在寄主中表达18型人乳头状瘤病毒蛋白的方法。包括(a)将权利要求4的表达载体转移入适当的寄主；和(b)在允许从表达载体表达18型人乳头状瘤病毒的条件下培养步骤(a)的寄主。
7.根据权利要求6所述的方法，其中蛋白质选自HPV18L1蛋白，HPV18L2蛋白和它们的组合。
8.能在用该组合物处理的个体中诱导免疫应答的组合物，所述组合物含有选自权利要求1的DNA分子，权利要求1的DNA分子编码的肽，与权利要求1的DNA分子互补的RNA的化合物，或它们的组合。
9.防止或治疗人乳头状瘤病毒感染的疫苗，所述疫苗含有选自由权利要求1的DNA分子，权利要求1的DNA分子编码的肽，与权利要求1的DNA分子互补的RNA的化合物，或它们的组合。
10.诱导抗人乳头状瘤病毒引起的感染或疾病的免疫应答的方法，它包括在动物中导入权利要求1的DNA分子，与权利要求1的DNA分子互补的RNA，权利要求1的DNA分子编码的蛋白质，或它们的组合。
11.包括人乳头状瘤病毒18的L1蛋白或重组L1+L2蛋白的病毒样颗粒，该病毒样颗粒的纯度至少是60％。
12.根据权利要求11所述的病毒样颗粒，其中重组L1蛋白或重组L1+L2蛋白是在酵母中产生的。
13.根据生产权利要求11所述的类病毒的方法，包括(a)用编码乳头状瘤病毒L1蛋白或乳头状瘤L2蛋白或乳头状瘤病毒L1+L2蛋白的重组DNA分子转化酵母；(b)在允许表达重组DNA分子以生产重组乳头状瘤病毒蛋白的条件下培养转化的酵母；和(c)分离重组乳头状瘤病毒蛋白以便生产权利要求1的病毒样颗粒。
14.根据权利要求13所述的方法生产的重组乳头状瘤病毒蛋白。
15.包括权利要求11所述的病毒样颗粒的疫苗。
16.包括权利要求11所述的病毒样颗粒的药物组合物。
17.防止乳头状瘤病毒感染的方法包括给寄主施用权利要求15所述的疫苗。
18.生产酵母起源的组装成病毒样颗粒的重组乳头状瘤病毒衣壳蛋白的方法，包括(a)将至少编码一个乳头状瘤病毒衣壳蛋白的乳头状瘤病毒基因克隆进载体；(b)将载体转移进入寄主细胞以便产生重组寄主细胞；(c)在允许生产乳头状瘤病毒衣壳蛋白的条件下培养重组寄主细胞；和(d)在允许形成病毒样颗粒的条件下纯化乳头状瘤病毒衣壳蛋白。
19.由权利要求18所述的方法生产的病毒样颗粒。
20.在动物中诱导免疫应答的方法包括给动物施用权利要求11所述的病毒样颗粒。
全文摘要
本发明涉及编码纯化的18型人乳头状瘤病毒及其衍生物的DNA分子。
文档编号A61K48/00GK1185176SQ96194121
公开日1998年6月17日 申请日期1996年3月18日 优先权日1995年3月22日
发明者K·J·霍夫曼, K·U·雅森, M·P·内佩尔, J·G·乔伊瑟, H·A·格奥尔格 申请人:麦克公司