专利名称：抗－hCG单克隆抗体的直接细胞毒活性的制作方法
利用定量(分析)流式细胞计量技术和一组抗定位于人绒毛膜促性腺激素(hCG)分子不同位点的表位的单克隆抗体(MAb)进行的已有研究证明用不同类型和起源的活的人癌细胞，以及人胚细胞和胎细胞表达膜相关hCG、其亚基和片段(1-8)。也已证明hCG在体内和体外用胚细胞和胎细胞表达(9，10)。所有这些发现被体内和体外人胚细胞和胎细胞以及癌细胞中存在可翻译水平的hCGβ和人促黄体生成激素β(hLHβ)的mRNA证实，表明hCGβ-hLHβ基因簇的表达构成所有癌症的生化特征。一个重要的规则在于这样的认识，即癌细胞中hCGβ-hLHβ基因簇的激活是恶性转化过程的产物，而不是病因因素(11-13)。
成功的癌症免疫治疗或免疫保护的基本需要是用恶性细胞优先表达膜相关抗原。膜相关hCG、其亚基和片段用所有癌细胞表达，无论癌细胞的类型或起源，即可实现该需要。
考虑到存在Stevens和其合作者制备的世界卫生组织(WHO)合成节育疫苗，准备用同样的疫苗治疗和预防癌症。该疫苗是基于相应于hCGβ链(hCGβ)羧基末端肽(CTP)的37个氨基酸序列(109-145)的合成肽，所述肽与白喉类毒素结合形成一种免疫原性半抗原载体复合物。合成的去甲-胞壁酰二肽用作佐剂，角鲨烯／二缩甘露醇单油酸酯为赋形剂(14-16)。
在澳大利亚进行了一期节育临床实验(17)。利用培养的正常滋养层对来自形成高滴度抗体的接种疫苗妇女的四个血清样品进行了细胞毒性研究。这些实验的结果如表1所示，其证明在存在以及缺乏补体的情况下，血清溶解滋养层细胞。
表1接种疫苗妇女的血清溶解滋养层细胞
对照，单独补体和未治疗的未怀孕妇女的血清，为阴性。
1994年，Triozzi与其合作者公开了WHO疫苗对于癌症患者的一期临床实验结果(18)。这些研究者报道在显示可测量的抗肿瘤活性的患者中，利用标准51Cr-释放检测没有观察到外周血单核细胞细胞毒性，NK细胞的活性也没有增加。同时，产生并鉴定了由合成疫苗产生的三种小鼠单克隆抗体(MAb)，命名为CTP101、CTP102和CTP103)。用从结合到牛甲状腺球蛋白上的完全hCG(完整hCG)中分离出的一种含碳水化合物的肽衍生的免疫原产生另外两种MAb，CTP104和CTP105(19)。
因为WHO疫苗的作用机制仍然没有很好地确定，因此本发明的一个目的就是确定抗hCG、其亚基或片段的MAb是否对癌细胞具有细胞毒性。更具体地说，本发明的目的在于利用抗hCG、其亚基或片段不同表位的MAb(IgG1)进行一系列实验，用来验证这些MAb对培养的子宫颈腺癌细胞的细胞毒性。
培养的子宫颈腺癌细胞是从美国典型培养物收藏中心(ATCC，Rockville，MD)得到的CCL2．0细胞。这些癌细胞在规定条件下在RPMI1640培养基中在不存在任何其它类型的人细胞的情况下生长(4，5)，RPMI1640培养基(JRH Biosciences，Lenexa，KS)含10％按规定添加离子的小牛血清(HyClone Labs．Inc．，Logan，UT)、2mM L-谷氨酰胺(Fisher Scientific Co．，Pittsburgh，PA)、1mM丙酮酸钠(JRHBiosciences)、和20mg／L庆大霉素硫酸盐(Sigma Chemical Co．，St．Louis，MO)。
研究的12个MAb中的10个从哥伦比亚大学内科和外科学院Irving临床研究中心(纽约，NY(1-3，19))得到，而MAb GK-1，一种狒狒MAb，在我们实验室制备，和AS11，一种抗hCGβ天然羧基末端肽的MAb，由免疫治疗公司(ImmunoTherapy Corporation，Santa Ana，CA)作为礼物相赠。各种MAb的特征在表2和表3中列出。
表2狒狒和小鼠抗-hCG MAb在37℃下在体外对HeLa细胞的影响HeLa细胞(美国典型培养物收藏中心CCL2．0)在规定培养基中培养。
铺板密度106个细胞／mL。细胞处理3天后用胰蛋白酶酶解，然后利用锥虫蓝计数。
应用的单克隆抗体CTP103抗合成hCGβ羧基末端肽(CTP)(CTP109-145)的小鼠MAb，也与完整hCG的天然CTP和游离hCGβ反应。
GK-1抗完整hCGβ的狒狒MAb。
阴性对照小鼠IgG、猴IgG、和PBS(无抗体)。
表3表4所示实验中使用的10种MAb的特征A105与游离hCGα或完全hCG(完整hCG)的部分反应A501与游离hCGα或完全hCG的部分反应B109仅与完全hCG结合B204与游离hCGβ和hCGβ片段结合B207仅与游离hCGβ结合B210仅与hCGβ片段结合。不结合完全hCG或游离hCGβ。CTP101和CTP102 疫苗产生的另外两种抗体。象MAb CTP103(合成肽109-145)一样，它们与合成CTP和完全hCG和游离hCGβ的CTP反应。CTP105 与完全hCG的天然CTP反应，但不与合成CTP或asialo hCG(无唾液酸的hCG)反应。AS11与完全hCG(含四个碳水化合物链)的天然CTP，游离hCGβ和合成CTP反应。
在37℃培养3天和2天后，MAb对HeLa细胞的体外影响结果分别如表2和表4所示。
表4抗hCG MAb在37℃下对HeLa细胞的体外影响细胞HeLa细胞，在规定的培养基中培养。铺板密度150，000个细胞／ml。阴性对照PBS，小鼠IgG处理两天后，将细胞用胰蛋白酶酶解，利用锥虫蓝计数。
n／d未操作。
所有上述实验的MAb中，仅三种显示剂量依赖性细胞毒活性。这三种细胞溶解性MAb是CTP103，抗合成的羧基末端肽(CTP109-145)，ASII，抗hCG的天然羧基末端肽，以及A105，抗游离hCGα表位，或二聚体的一部分。
这些数据证明与hCG、其亚基或片段反应的细胞毒MAb的存在。然而，虽然由合成羧基末端肽产生的这三种MAb具有非常相似的免疫反应性(19)，但仅一种，即MAb CTP103具有细胞毒性。抗hCGα的MAb显示具有类似特征(20)。对于抗合成CTP的MAb，另一种抗hCGα的MAb，MAb A501，无细胞毒性。
结果表明三种抗hCGβ合成羧基末端肽的MAb中仅有一种(CTP103)，和抗hCGα的MAb中仅有一种显示细胞毒活性，该结果是独特的并且是唯一的。然而，不应当认为本发明仅限于单一CTP103MAb。本领域技术人员将认识到，可以利用常规杂交瘤融合法制备抗hCGβ链羧基末端肽的其它MAb，然后利用在这里描述的方法筛选细胞毒活性，虽然可能需要筛选大量这类杂交瘤，但将鉴定具有类似结合特征和细胞毒性特征的其它MAb，本发明意欲包括所有这些MAb。本领域技术人员也将认识到，具有所需细胞毒性特征的MAb可能需要应用同样的合成肽，或具有与人绒毛膜促性腺激素β链羧基末端肽的氨基酸序列，特别是对应CTP109-145的37个氨基酸的序列具有约90％同源性的氨基酸序列的肽。
从这些数据中不能清楚地看出具有上述独特特征的CTP103的具体性质。然而，因为该研究中用到的所有MAb均为IgG1(一种分子量约150KD，具有三级结构的蛋白质)，因此存在这样的可能性，即细胞毒活性可能由于这些独特MAb的空间构型发生了改变。结果，细胞毒性MAb与那些无细胞毒性的MAb的空间构型存在差别，这使那些MAb具有特殊的细胞毒性。应当认为本发明涉及hCGβCTP部分的所有MAb，其特征在于赋予这些MAb上述性质的特殊空间构型。
本发明MAb的独特特征可以解释利用经典杂交瘤技术不能产生需要人异种骨髓瘤作为融合伙伴的，抗合成hCGβ-CTP的灵长类动物MAb。因为人异种骨髓瘤，一种人癌细胞，含有丰富的膜相关hCG、其亚基和片段，由该杂交瘤产生的细胞毒性hCG抗体将攻击异种骨髓瘤，导致杂交瘤破坏。试图避免杂交瘤的这种“自杀效应”的努力失败了。仅得到一种产生抗hCGβ表位MAb GK-1的狒狒杂交瘤，如本发明提供的数据显示，那种MAb没有细胞毒活性。这些结果表明，利用杂交瘤技术制备抗hCG和／或其亚基的灵长类动物细胞毒性MAb在生物学上也许是不可能的。
产生细胞溶解性MAb例如MAb AS11的小鼠杂交瘤不稳定。也许因为这个原因，产生抗hCGβ或其天然CTP的MAb，例如MAb AS11的杂交瘤，已经永远丧失。
由于CTP103对hCGβ的CTP109-145的特异性，CTP103不与其它激素(LH和FSH)在体内交叉反应，即使它们都具有一个共同α链。因此，它代表了一种癌症免疫治疗的理想候选。本发明提供的数据表明，CTP103在体外对癌细胞具有细胞毒性，并且这种细胞毒性是剂量依赖性的。而且，本领域技术人员都知道，体外活性是体内抗癌活性候选药物的指标。因此，这些数据表明，抗hCGβ羧基末端肽的MAb，特别是CTP103 MAb，能够用作免疫治疗剂，当将其以抗肿瘤有效量对癌施用时，它对癌细胞而不对其它细胞是毒性的。
可以按照药理学和免疫学领域技术人员已知的多种形式实现上述免疫治疗。例如，对于某种类型的肿瘤，可以通过将MAb直接注射到肿瘤中和／或通过将MAb灌输到肿瘤中施用。在例如肺癌等肿瘤中，可以通过吸入或雾化吸入施用MAb。在某些扩散肿瘤中，本发明的细胞毒性MAb可以通过IV或IM注射，例如，在含有稀释剂NaCl的缓冲血清白蛋白中施用。可以按照对患者治疗给药有效量外源抗体的已知方法配制给药的本发明的MAb，例如，配制成缓冲的、防腐的生理盐水溶液。制剂可以包括，也可以不包括一种或多种同样是本领域已知的刺激免疫系统效果的成分。作为一般原则，优选以重复剂量或延长时间段施用MAb，以使它们的效果最大化，但以这种方式给药并非必须的。对于通过IV给药MAb免疫治疗扩散肿瘤时，在延长的时间段给药本发明的MAb以增加血液中的抗体效价是尤其期望的，由此增加了MAb与癌细胞结合的可能性。
本发明的MAb也可以与毒素、化学物质、酶偶联到癌细胞表面，和／或为了增加它们的细胞毒性，与放射性同位素或放射性核素偶联。Feteanu，“生物学和药学中的标记抗体”214-309页(纽约McGraw-Hill Int′1．Book Co．，1978)中公开了大量标记技术。可以按照Wagner等20放射医学杂志(J．Nucl．Med．)428(1979)，Sundberg等17医学化学杂志(J．Med．Chem．)1304(1974)，和Saha，等6放射医学杂志542(1976)的方法引入各种金属放射性同位素，但是这些方法在于举例说明，还有本领域已知的许多其它放射性标记方法。例如，Khaw等209科学295(1980)中描述了用放射性金属标记抗体的有用方法。毒素例如白喉毒素、IL-2R-定向的假单胞菌外毒素(PE)(Pastan，等，47细胞641(1986))，和本领域技术人员已知的其它毒素可以这种方式有利地应用。如，例如，Jansen，等62免疫学研究(Immunol．Rev．)185(1982)，和Vitetta，等，37移植(Transplant)535(1984)中所述，很多方法可以用于将上述多种毒素与MAb偶联。
在本发明另一方面，治疗有效量细胞毒性MAb的给药与其它治疗方式，例如，手术、结合抗体、和／或例如Mellstedt，等18肿瘤学研讨会(Semin．Oncol．)462(1991)和Frodin，等7杂交瘤(Hybridoma)309(1988)中所述的化学治疗组合。同样，治疗可以包括将本发明的细胞毒性MAb与如干扰素的试剂按照Weiner等，48癌症研究(Cancer Res．)2568(1988)和Caulfield等，9生物应答调节杂志(J．Biol．Response Modif．)319(1990)中描述的方式给药。还可以设想，治疗可能需要协同给药控制MAb给药的毒性和／或副作用的试剂，例如，控制过敏反应或超敏反应的苯海拉明或皮质类固醇以及过敏性反应的肾上腺素的预防性应用。
虽然以
具体实施例方式
描述，但是因本发明的公开而获益的本领域技术人员将认识到，对所述实施方式可以进行某些改动，而不改变其组成部分获得预期结果的的方式。所有不偏离本发明精神的那些改变都落入下列权利要求的范围内。
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权利要求
1.结合在人绒毛膜促性腺激素β链羧基末端肽上的单克隆抗体用于制备治疗癌症的治疗组合物的用途。
2.权利要求1的用途，其中单克隆抗体是CTP-103。
3.权利要求1的用途，其中单克隆抗体是从具有与人绒毛膜促性腺激素β链羧基末端肽109-145位氨基酸序列具有约90％同源性的序列的合成肽制备的单克隆抗体。
全文摘要
利用培养的人癌细胞和12种抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)不同决定簇的单克隆抗体(MAb)进行研究,确定是否存在直接剂量依赖性细胞毒活性。使子宫颈腺癌细胞(Hela CCL2.0)在规定培养基中生长。所述细胞与每种选择剂量的MAb共培养2—3天。抗天然hCGβ羧基末端肽(CTP)的MAb,抗hCGα的MAb和由合成的hCGβ－CTP,CTP103产生的三种MAb之一具有直接剂量依赖作用。
文档编号A61K39/395GK1290176SQ98813203
公开日2001年4月4日 申请日期1998年11月19日 优先权日1997年11月19日
发明者赫南·F·埃斯维多, 加夫里尔·卡兰塔罗夫 申请人:艾利格汉尼-辛格研究会