专利名称：一种肿瘤血管生成抑制素的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是血管形成抑制素(angiogenesis inhibitor，AI)，尤其是涉及具有稳定生物活性的血管形成抑制因子(Endostatin(ES)和Angiostatin(AS))的技术领域。
实体瘤治疗方法很多，包括外科和内科疗法，但多是针对肿瘤细胞本身，而用抑制剂抑制肿瘤血管形成阻断其血液供应而抑制肿瘤生长的疗法较少，其中包括TNP-470，COL-3，IL-2，鲨鱼软骨制剂，Endostatin，Angiostatin和干扰素等。肿瘤血管是肿瘤恶性转化、生长和转移的病理基础，与传统抗癌治疗相比，抗肿瘤血管形成治疗具有许多优势①不易产生耐药性。②内皮细胞与血液直接接触，药物能直接发挥作用，剂量少疗效高。③正常成年人血管形成基本停止，抗肿瘤血管形成具有良好的特异性(副作用少)。
AS和ES是特异性地针对血管内皮细胞生长的强抑制剂，它们的作用机理目前尚不完全清楚。可能有以下几个作用途径①干扰血管内皮细胞的粘附、识别、接触抑制和生长等，与整联蛋白(Integrin)、钙粘着蛋白(Cadherin)、选择蛋白(Selectin)有关，如ES含有E-选择蛋白(E-Selectin)特异的识别区点CRD等。②干扰肿瘤细胞的粘附。恶性肿瘤细胞有许多种肝素样的受体，通过此受体与血管内皮细胞粘附而发生转移生长，ES具有特异性与这些受体结合的功能，因而阻止了肿瘤细胞的粘附和转移。
AS和ES已有基因工程产品，但用量大、疗程长(20mg/kg/d，30天，小鼠1周期)相当人的剂量(2-3mg/kg/d，180-360天1周期)。因此，如果按此方案生产一个人一天的用量(120-180mg)，需要成本10,000元左右，因而从产量上限制了上述两种产品的推广应用。
本发明的目的在于提供一种采用生化提取和中空纤维超滤制备高浓度，高产量，低成本和活性高的血管生长抑制素的制备方法。选用健康哺乳类动物的软骨、肌腱、真皮、肝、肺组织，采用生化提取和中空纤维超滤，可以制成口服液，也可制备注射药。
本发明的目的可通过以下的技术措施来达到选用健康哺乳类动物的软骨、肌腱、真皮、肝、肺组织，用任何机械方式捣碎→-20℃深冻→融解后加浓盐酸，搅拌均匀→加热→恢复至室温→冻存→融解后，离心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加蛋白酶消化或其它方法消化→离心，取上清液→过正压截留柱→取滤液→除菌→分装，包装，制备注射药或加调味剂制作抑瘤口服液。
在上述方案中，健康哺乳类动物可选自猪，牛，马，羊，狗，兔等。
在上述方案中，优选加浓盐酸的比例为每10L液体加1ml浓盐酸，浓盐酸的加入量可从1ml至数百ml。
在上述方案中，加热温度可在40-95℃范围内，优选70-80℃。加热时间为10-200分钟，优选120-180分钟。
在上述方案中，加入的用于消化的蛋白酶可以是胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，糜蛋白酶，胶原蛋白酶，弹性蛋白酶等；浓度为0.001-1％，消化时间5-4000分钟不等，优选60-120分钟。
在上述方案中，优选截留柱的截止分子量为1000-100,000道尔顿。正压0.1-1.0×104Pa，其组合方式为单柱或多柱组合使用。
在上述方案中，优选将所制备的截止分子量≤100,000道尔顿，优选≤50,000道尔顿的血管生长抑制素(AI)，在制备过程到除菌一步时加入调味剂分装成品，制成抑瘤口服液；将制备的截止分子量≤20,000，优选≤10,000道尔顿的血管生长抑制素(AI)，制成注射液，或与其它药物配伍静脉滴入给药。
本发明方法进一步的优选方案如下选用健康哺乳类动物如猪，牛，马，羊，狗，兔等的软骨、肌腱、真皮、肝、肺组织，用任何机械方式捣碎→-20℃深冻→融解后按照每10L液体加入1ml浓盐酸的比例加入浓盐酸，搅拌均匀→在40-95℃加热10-200分钟→恢复至室温→-10℃冻存→融解后，离心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加浓度为0.001-1％的蛋白酶消化5-4000分钟，或其它方法消化→离心，取上清液→过正压为0.1-1.0×104Pa的正压截留柱，截留柱的截留分子量为1000-100,000道尔顿→取滤液→除菌→分装，包装，制备注射药或加调味剂制作抑瘤口服液。
本发明的方法制备的血管生长抑制素(AI)是一类具有抑制新生血管内皮细胞增殖和肿瘤血管增生的分子量为1000-100,000的多肽或蛋白混合物。按照本发明方法制备的血管生长抑制素(AI)按每Kg体重25-100毫克腹腔注射入已接种S180-纤维肉瘤和HepA肝癌的小鼠，能抑制肿瘤血管增生和肿瘤生长。临床上可用于治疗类风湿病、糖尿病后遗症和恶性肿瘤等疾病。
下面，将用实施例进一步详述本发明。实施例1取乳猪肝脏匀浆，→-20℃深冻→融解后按照每10L液体加入1ml浓盐酸的比例加入浓盐酸，搅拌均匀→在90℃加热15分钟→恢复至室温→-10℃冻存→融解后，离心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加浓度为0.001％的胃蛋白酶消化120分钟，→离心，取上清液→过正压为1.0×104Pa的正压截留柱，截留柱的截留分子量为1000-100,000道尔顿→取截止分子量≤10,000的血管生长抑制素(AI)的滤液→除菌→分装，制备注射液，每毫升含蛋白5.0mg。实施例2取乳猪肝脏匀浆，→-20℃深冻→融解后按照每10L液体加入1ml浓盐酸的比例加入浓盐酸，搅拌均匀→在40℃加热150分钟→恢复至室温→-10℃冻存→融解后，离心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加浓度为0.01％的胃蛋白酶消化60分钟，→离心，取上清液→过正压为1.0×104Pa的正压截留柱，截留柱的截留分子量为1000-100,000道尔顿→取截止分子量≤10,000的血管生长抑制素(AI)的滤液→除菌→分装，制备注射液，每毫升含蛋白5.0mg。实施例3取鼠肝脏匀浆，→-20℃深冻→融解后按照每10L液体加入1ml浓盐酸的比例加入浓盐酸，搅拌均匀→在90℃加热150分钟→恢复至室温→-10℃冻存→融解后，离心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加浓度为1％的胃蛋白酶消化5分钟，→离心，取上清液→过正压为1.0×104Pa的正压截留柱，截留柱的截留分子量为1000-100,000道尔顿→取截止分子量≤10,000的血管生长抑制素(AI)的滤液→除菌→分装，制备注射液，每毫升含蛋白5.0mg。实施例4S180-纤维肉瘤细胞，Hep-A肝癌细胞和昆明小鼠引自中山医科大学实验动物中心。瘤细胞株接种于F12/DME培养基内(含10％小牛血清和青链霉素)，当细胞长满培养瓶壁时，用胰酶消化，将细胞用培养基配成1-2×107个/ml浓度，腹腔接种于昆明小鼠体内，0.2ml/鼠。当肿瘤细胞长满整个腹腔时，抽取腹水，离心，收取沉淀，用生理盐水将细胞稀释成1-2×108个/ml，接种于昆明小鼠背部中线皮下，0.2ml/鼠。(I)AI对KM鼠接种HepA肝癌的影响实验分对照组；预防组，于接种时注射AI 50和100mg/Kg体重连续28天；治疗组，于肿瘤长至50-100mm3时注射AI 50和100mg/Kg体重连续10天；结果见表1。
表1.对KM鼠接种HepA肝癌的影响(x±s，作用24天)4癌重(g) 抑制率(％)P值对照组 47.0±1.632预防组(28天)(25mg/kg) 43.15±1.47 55 ＜0.05(50mg/kg) 42.66±1.26 62 ＜0.01治疗组(10天)(25mg/kg) 43.50±2.29 50 ＜0.05(50mg/kg) 43.20±2.03 54 ＜0.05(II)AI对KM鼠接种S180纤维肉瘤的影响实验分对照组；阿霉素组，10mg/Kg体重连续24天；AI组，25-100mg/Kg体重连续24天；结果见表2。
表2.对KM鼠接种S180肉瘤的影响(x±s，作用24天)
n 瘤重(g) 抑制率(％) P值对照组81.76±1.03阿霉素组 40.91±0.78 48.2 ＜0.05AI组(mg/kg)10050 41.04±0.74 41.0 ＜0.0525 42.49±0.51 72.2 ＜0.0140.93±0.70 47.2 ＜0.05实施例5本发明是采用生化提取，裂解胶原蛋白，通过调控裂解速度来保证产品的生物学活性和安全性，利用中空纤维超滤技术制备血管生长抑制素(AI)；同目前最先进的基因工程生产的ES和AS相比，具有浓度高，产量高，活性相似和成本低的特点。它们的比较结果见表3。(蛋白含量测定采用改良Lowry′s法活性测定)。
表3生化提取法与基因工程法比较生化提取法基因工程法品名 AIAS产量 10mg/g组织** 4.0mg/g工程菌*多肽含量(mg/ml)5.0 0.1-0.2最佳抑瘤剂量 100-150 100-120(mg/Kg WB/日)最佳抑瘤率(％) 7090以上成本(元/mg)0.5 400用量(mg/人/日)250-300180-220药费(元/人/日)300-40030,000以上*，表中基因工程法AS的数据为估计值。**，组织是指软骨、肌腱、真皮、肝和肺组织。
从表3可以看出，用基因工程法生产AS，就目前的技术水平，其产量难以满足临床应用的需要，费用十分高昂，因此，生化提取仍不失为一种行之有效的方法。
权利要求
1.一种稳定的血管生长抑制素(AI)的制备方法，其特征是选用健康哺乳类动物的软骨、肌腱、真皮、肝、肺组织，用任何机械方式捣碎→-20℃深冻→融解后加浓盐酸，搅拌均匀→加热→恢复至室温→冻存→融解后，离心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加蛋白酶消化或其它方法消化→离心，取上清液→过正压截留柱→取滤液→除菌→分装，包装，制备注射药或加调味剂制作抑瘤口服液。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于健康哺乳类动物可选自猪，牛，马，羊，狗，兔等。
3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于加浓盐酸的比例为每10L液体加1ml浓盐酸，浓盐酸的加入量可从1ml至数百ml。
4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于加热温度可在40-95℃范围内，加热时间为10-200分钟。
5.权利要求4所述的制备方法，其特征在于加热温度可在78-80℃范围内，加热时间为120-180分钟。
6.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，加入的用于消化的蛋白酶可以是胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，糜蛋白酶，胶原蛋白酶，弹性蛋白酶等；浓度为0.001-1％，消化时间5-4000分钟不等。
7.权利要求6所述的制备方法，其特征在于，消化时间为60-120分钟不等。
8.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，截留柱的截止分子量为1000-100,000道尔顿，正压0.1-1.0×104Pa，其组合方式为单柱或多柱组合使用。
9.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所制备的截止分子量≤100,000道尔顿的血管生长抑制素(AI)，在制备过程到除菌一步时加入调味剂分装成品，制成抑瘤口服液；将制备的截止分子量≤20,000的血管生长抑制素(AI)，制成注射液，或与其它药物配伍静脉滴入给药。
10.权利要求9所述的制备方法，其特征在于，将所制备的截止分子量≤50,000道尔顿的血管生长抑制素(AI)，在制备过程到除菌一步时加入调味剂分装成品，制成抑瘤口服液；将制备的截止分子量≤10,000的血管生长抑制素(AI)，制成注射液，或与其它药物配伍静脉滴入给药。
11.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，选用健康哺乳类动物如人，猪，牛，马，羊，狗，兔等的软骨、肌腱、真皮、肝、肺组织，用任何机械方式捣碎→-20℃深冻→融解后按照每10L液体加入1ml浓盐酸的比例加入浓盐酸，搅拌均匀→在40-95℃加热10-200分钟→恢复至室温→-10℃冻存→融解后，离心→取沉淀，按每kg沉淀加水2L溶解，加浓度为0.001-1％的蛋白酶消化5-4000分钟，或其它方法消化→离心，取上清液→过正压为0.1-1.0×104Pa的正压截留柱，截留柱的截留分子量为1000-100,000道尔顿→取滤液→除菌→分装，包装，制备注射药或加调味剂制作抑瘤口服液。
全文摘要
本发明涉及一种肿瘤血管生成抑制素的生产工艺,它是一种从健康哺乳动物的软骨、肌腱、肝和肺组织中,在低温下用生物化学技术提取,中空纤维超滤制备的具有抑制血管内皮细胞生长的生物活性物质的方法。该方法提取的分子量为1000—100,000道尔顿的产物,和现有基因工程方法生产的产品相比,具有产量高、浓度高、活性相似、成本低可满足大规模生产和临床应用的需要。临床上可用于治疗类风湿病、糖尿病后遗症和恶性肿瘤等疾病。
文档编号A61K38/17GK1265891SQ9910274
公开日2000年9月13日 申请日期1999年3月4日 优先权日1999年3月4日
发明者邹清雁, 孔祥平, 曾平鲁 申请人:中国人民解放军第458医院