尿多酸肽组合物的制备方法

专利名称：尿多酸肽组合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种尿多酸肽组合物、尿多酸肽组合物的制备方法以及尿多酸肽组合物在治疗及防止癌症复发方面的用途，属于药物领域。
恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见病，其发病率和死亡率都很高。可以说是目前人类死亡的主要杀手之一，尤其是晚期恶性肿瘤患者一般已失去手术、化疗、放疗等机会。传统的四大疗法各有利弊，但往往难以从根本上解决问题，因而，治愈或部分治愈恶性肿瘤，减少患者的痛苦，延长生存期，改善生活质量，在临床上是一个十分棘手的难题，故癌症疾患的攻克和治疗是各国医学界都十分关注的课题。
目前临床上继手术、化疗、放疗、免疫疗法后，有人又提出一种诱导恶性肿瘤细胞向正常细胞分化的治疗方法，一般称为细胞分化疗法。其主要机理为人恶性肿瘤细胞异常甲基转移复合酶活性升高，是可能导致肿瘤细胞不断分裂的重要原因之一，从本质上说，甲基转移复合酶的异常阻断了癌细胞的分化，从而使癌细胞不断地分裂，如能有效地抑制该酶的活性才能诱导肿瘤细胞走向正常分化。
既然异常甲基转移复合酶是癌症的核心问题，那么消除这些异常酶之后，癌细胞应该可以象正常细胞那样被诱导进行分化而变成不再分裂的终末细胞。我们的实验显示癌细胞的rRNA甲基转移酶对类似寡腺嘌呤核苷酸的寡聚核苷酸特别敏感，但是正常酶对这类的抑制剂毫无反应，这是因为正常和异常的甲基转移复合酶有很显著的差异，我们可以利用这种差异来寻求有选择性的抗癌药物，这种药物通常被称为分化诱导剂。寡腺嘌呤核苷酸是一个很理想的分化诱导剂，事实上目前广泛应用的分化诱导剂如干扰素，维甲酸，维生素D3，六甲撑二乙酰胺(HMBA)，二甲基亚砜(DMSO)和佛波脂(phorbol ester)大都是通过诱导寡腺嘌呤核苷酸来促成癌细胞的终末分化；由于癌细胞必需具有很多这些分化诱导剂的受体才能达到分化的目的，这类分化诱导剂能够影响到的癌细胞范围很小。具有很多受体的几乎都是一些特例，如毛细胞白血症细胞有很多干扰素受体，急性早幼粒白血病细胞有很多维甲酸和维生素D3受体，六甲撑二乙酰胺最能产生作用的是红白血病细胞等等，但是寡腺嘌呤核苷酸本身因为构造特殊不容易被细胞吸收，不能作为药物。
研究发现尿中含有类似寡腺嘌呤核苷酸功能的化合物，可以将异常的甲基转移复合酶改变成为正常酶，这种制剂因为没有受体的限制，所以对多种癌细胞都能够诱导分化，并促进癌细胞走向正常分化或使癌细胞凋亡，通常认为尿提取物中的有色肽为分化诱导剂(US4470970)。
Liau，M．C．在J．Exptl．Clin．Chemother．59-17，1992中公开了丁酸和苯甲酸可以作为分化帮助剂，单独或与分化诱导剂共用，用于癌症的治疗；US5783605中公开了以合成的N-烷基苯乙酰胺、苯甲酸酯类和吲哚乙酸作为分化帮助剂，用于治疗癌症。
US4470970中公开了一种可以从尿中提取、也可以合成的新型抗癌药物--抗瘤酮A10，其结构为3-苯乙酰氨基-2，6-哌啶双酮，具有抗多种癌症的作用；通常认为抗瘤酮A10具有抑制人体过多排泄体内抗癌物质--低分子量代谢物的作用；实验证明抗瘤酮A10注射剂是其开环产物，以苯乙酰谷氨酰胺和苯乙酰异谷酰胺钠盐的形式存在，见Hendry L．B．“DrugsExptl Clin．Res，1987，Suppl．171”。
事实上尿和尿的提取物的医学用途被国内外人们所认识已有几个世纪了，公元后二世纪希腊人Xenokrates用尿治疗癌症(见Turner，F．C．Effects of extracts of human urine on tumorsin mice．U．S．Public Health Service，1855，1939)；Floydc．Tumer在1939年发现从尿中产生的生长抑制物质能防止小鼠肿瘤的形成(Fleming，R．F．，Peczenik．O．Alkalinephosphatase and tumor inhibition．Nature，162，338，1948)；英国和德国对人尿中提取的未知结构物名为H-11的多肽研究(见Fleming，R．，Walters，C．L，Williams，J．L．The effectof adrenal and urinary extracts on malignant tissue．Acta．Un．Inter．can．，7，456，1951．Walters，C．L．A competitive alkaline phosphatase inhibitor from extracts ofnormal male urine．Enzymologia，20，33，1958．Von Klose，G．Chemotherapie in derNachbehandlung von Geschwulstkrankheiten．Schleswig-Holstenisches Artztenblatt，442，1962．)，在早期临床研究中有16例不宜手术的肺癌患者通过注射该提取物治疗，观察到多数病人症状缓解、延长生命且无明显的副作用；1968年Klose和Below阐明在更长期的治疗方案中用该提取物治疗49例不宜手术的肺癌患者，取得良好效果(见Klose，G．BelowR．verlaufsbeobachtungen bei Kranken mit inoperablen Lungentumoren bei Behandlungmitkombinierter interner Therapie (alkylierend Substanz und korpereigenesPolypeptid)．Krebsarzt，24，1，1969)；Burzynski(Von Burzynski，S．R．，Stolzmann，Z．，Szopa，B．et al．Antineplaston A in cancer therapy(I) physiol．Chem．Phys．，9，485，1977)用人尿提取的抗癌物抗瘤酮A10来医治晚期癌症病人21个，静滴给药有显著的抗肿瘤作用且无任何毒性，目前正在二期临床，据美国NCI报告，如按FDA规定的临床方案，该药的三期临床治疗non-Hodgkins淋巴瘤患者可能会取得抗肿瘤的预期效果(佐野鎌太郎，消灭癌症，世茂出版社，台北，台湾，1997226)，山东医科大学学报1998，264中公开了抗瘤酮A10的初步抑瘤实验，当给药量为1500mg／kg时，对S180的抑制率为28％。
由此可见，尿的提取物是一类很有前途的治疗癌症的药物，但是现有技术只是公开了尿提取物的某一组份或某些组份及其作用，在提取尿液中的有效成分时，通常由于吸附剂的不同、淋洗液及流速不同，得到的产物及收率不同，后处理时采用的工艺和方法不同，也直接影响产品的组成、性质、产率和治疗效果，如现有技术中，一般产率较低，而且将提取物浓缩过滤后不再进行处理直接用于药物制剂，由于尿提取物中可能含有各种病毒，直接应用，对人体存在不可预见的潜在危险；并且现有技术中对于组合物的提取、成分和结构的研究及其在治疗癌症方面的作用亦没有详细的报道。
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，从人尿中提取有效成分，提供一种治疗和预防癌症的药物组合物----尿多酸肽组合物。
本发明的另一个目的是确定尿多酸肽组合物的组成。
本发明的另一个目的是确定尿多酸肽组合物各个主要成分的含量。
本发明的另一个目的是公开一种制备治疗和预防癌症的药物组合物-尿多酸肽组合物及中间体的制备方法。
本发明的再一个目的是公开尿多酸肽组合物在治疗和预防癌症复发方面的用途。
为了完成上述任务，本发明采用的技术方案如下1．制备尿多酸肽组合物将新鲜尿酸化，使PH小于等于3，以保证其稳定并易于提取；过滤除去酸化尿中直径大于20微米的大颗粒；超滤除去酸化尿中分子量较大的有机物质，用乙醇浸泡吸附剂后，用醇和去离子水分别洗涤吸附剂，装吸附柱，以一定的流速将超滤后的酸化尿加入吸附柱内，用吸附剂吸附滤液中的有效成分；酸化尿中有大量的无机盐离子和有机物，在进入吸附剂后未被吸附的积存于柱内，用软水洗涤未被吸附但残留在吸附剂中的无机物及亲水性有机物，纯化有效成分；用醇洗脱吸附在硅胶柱上的有效成分；收集有色流出液，浓缩后，用碱调整PH至中性，控制PH为6．0-8．5，低温静置析出浓缩过程中形成的聚合物，经过滤除去结晶及胶体杂质，得到尿多酸肽组合物中间体。
上述中间体经冷冻干燥，可以得到干燥的尿多酸肽组合物，该原料药可以制成口服胶囊，或经过稀释、除病毒等纯化及包装制成口服液或注射液。
以蒸馏水20L溶解干燥残留物，即得尿多酸肽粗品溶液；将粗品在低温库中放置；取静置处理后的粗品上层液，在100000级洁净室内，用微孔滤纸过滤，收集滤液，即得尿多酸肽溶液；用一万分子量的超滤膜超滤，以除去热源，再经PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒过滤器过滤除病毒，细胞内毒素检测至合格，整个制备工艺见附

图1。
上述原料尿的酸化可以用盐酸、硫酸以及适合本发明的其他酸。
原料尿酸化时，控制酸化尿的PH为小于等于3，优选小于等于2，最优选1．0-1．8；酸化尿超滤的压力为1-5Mpa。
超滤除去酸化尿中分子量大于10000或大于9000的有机物质。
相对于20公斤原料尿，吸附剂的用量为5-20公斤；上述吸附剂可以选用C18柱、XAD-7、XAD-8或XAD-16以及适合本发明的其他吸附剂，优选C18柱和XAD-7，最优选XAD-7；浸泡吸附剂的醇的用量为15-25升，浸泡时间为5-20分钟；洗涤吸附剂的醇和去离子水的用量为15-25升；酸化尿加入分离柱的流速为0．1-2L／min；洗脱液蒸馏水的用量为5-30L，洗脱速度为0．1-3L／min；洗脱液醇的用量为5-20L，洗脱速度为0．1-3L／min；上述洗脱可以使用乙醇、甲醇、丙醇以及适合本发明的其他醇类，优选甲醇；上述除溶剂可以使用减压蒸馏、膜技术以及适合本发明的其它方法；减压蒸馏时，物料的温度控制在30-80℃；调整PH值时，可以用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠以及适合本发明的其他碱，优选氢氧化钠；浓缩液的PH值调整为6．0-8．5，优选PH7．0-8．0，最优选PH7．2-7．8；用碱调整PH至中性的过程，可以在流出液浓缩后干燥之前，也可以在浓缩液干燥再稀释后。
上述在低温库中放置；取静置处理后的粗品上层液，在100000级洁净室内，用微孔滤纸过滤，收集滤液，即得尿多酸肽溶液；用一万分子量的超滤膜超滤，以除去热源，再经PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒过滤器过滤除病毒的过程，可以在流出液浓缩后干燥之前，也可以在浓缩液干燥再稀释后进行。上述在低温库的温度控制在0-10℃；放置时间为80-160小时。
上述干燥可以用冷冻干燥，也可以用减压或常压干燥，优选冷冻。
整个过程的收率为原料尿的0．2-4．0％。经上述方法制备的尿多酸肽组合物可以直接用于制备各种剂型的药物。
2．尿多酸肽组合物的分离和鉴定将尿多酸肽干品稀释，用高效液相色谱法对采用上述方法制备的尿多酸肽组合物进行分离，并测定其组成，发现从健康人尿中提取的药物组合物含有四种有机酸，分别是马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸和吲哚乙酸，以及一系列多相性小分子肽，还含有较多的无机盐，根据其组成，我们称之为尿多酸肽组合物。主要包括①按照常规方法检测本发明方法制备的尿多酸肽组合物的化常数，包括外观、不溶性微粒含量、PH值、固体总重量、炽灼残渣、含氮量等；②确认本发明药物组合物中所含的有机酸；③测定有机酸含量以马尿酸，苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸、吲哚乙酸的纯品为参照标样，并且对每一种有机酸进行了定量分析，四种有机酸的含量分别为马尿酸4．17-7．94mg／ml；苯乙酰谷氨酰胺4．87-10．86mg／ml；苯乙酸0．66-4．5mg／ml；吲哚乙酸0．11-0．28mg／ml；尿多酸肽组合物中四种有机酸的总含量为26．34-57．65％；④测定肽含量采用HPLC，Waters公司专一分析柱PICO·TAGTM分别测定药物组合物的水解总氨基酸与游离氨基酸，从而计算出肽氨基酸的含量(水解总氨基酸总量与游离氨基酸含量之差值)，获知小分子肽氨基酸的含量约为7．7-10．9mg／m；⑤测定分子量用HPSEC法测定本发明尿多酸肽组合物液的分子量分布，采用美国Sigma公司多肽与小分子蛋白分子量标准品；获知三个主要峰的分子量分别为7000-9200，4000-5800，1000-2100；尿多酸肽溶液样品的分子量最大为9200，所含多肽的分子量均小于10000道尔顿，确定其所含多肽的分子量小于1万；由此可见，该品中肽基本以小分子肽的形式存在。
⑥测定尿多酸肽组合物中肽的成分，经用HPLC排阻层析法，凝胶柱Protein60分离并检测本发明尿多酸肽组合物的肽成分，得到一系列的肽峰(见附图28-30)，数量为12-15个。其中有二个十分明显的主峰，特征峰之一的保留时间为6．805-7．493，三批相对百分含量分别为15．89％、16．16％、16．27％、．16．56％、17．56，即15．89-17．56；而另一个特征峰保留时间的均值为7．722-8．824，三批相对百分含量分别为18．68％、19．27％、19．61％、19．19％、19．98％，即18．68-19．19；⑦测定无机元素的含量采用原子吸收分光光度法测定无机元素的含量，获知尿多酸肽中含有Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Cr、Co、Na、K等无机离子，总含量为5103-6126μg／ml。
⑧含氮量按中国药典1995年版附录Ⅶ D半微量法检验，测得含氮量不低于2．0mg／ml。
此外，尿多酸肽组合物中还含有微量的尿红素和维生素B2。
3．尿多酸肽组合物的药理及毒理用在体和离体试验方法，对多种瘤株细胞或他们所致的病理模型，进行了多方位的试验研究，结果如下在体试验在体试验表明本发明的药物组合物溶液剂量在100-1000mg／kg时，对裸鼠或经免疫抑制的昆明种小鼠接种人肿瘤细胞的动物模型的肿瘤有明显抑制生长作用，抑瘤率均在30％以上，其中对经免疫抑制的昆明种小鼠，肾囊膜下接种的急性早幼粒白血病HL-60细胞有显著的生长抑制作用，剂量在640mg／kg时，抑制率达64％以上，并且HL-60细胞形态上呈现明显分化现象，癌组织中出现大量中晚幼粒及成熟细胞。600mg／kg时，对裸鼠肝包膜下接种的高转移性人肝癌LCI-D20裸鼠模型，有一定的抑制肿瘤生长作用，抑瘤率约43％；并可大大减少移植性肝癌的腹腔转移，尤以高剂量(1800mg／kg)更为显著。分子生物学研究表明本发明尿多酸肽组合物溶液(1200-1800mg／kg)对上述LCI-D20肝癌组织中与增殖分化相关的原癌基因c-myc，N-ras，c-jun和c-fos的表达有非常明显的下调作用(P＜0．01)；并能有效地下调反映肿瘤侵袭和转移能力的指标MMP9基因的mRNA转录(P＜0．05)。肿瘤在生长和转移过程中有粘附分子表达的改变，整合素β1亚基是一类重要的异型粘附分子，介导异种细胞间的粘附，参与细胞的信息传导，本发明尿多酸肽组合物溶液(1200-1800mg／kg)可使整合素β1亚基的量下降(P＜0．05)；E-钙粘素是同型粘附分子，参与同种细胞间的粘附，肿瘤转移时原灶的E-钙粘素表达会有明显减少，而本发明尿多酸肽组合物溶液1800mg／kg治疗后，可增加组织中E-钙粘素含量(P＜0．05)，且上述作用均与5-FU有协同作用。本发明尿多酸肽组合物溶液剂量为100-400mg／kg时，对裸鼠接种人肝癌细胞株(Smmu7721)有一定的抑制作用，抑瘤率为51．8-83．5％。剂量为1000mg／kg时能抑制小鼠(前臂皮下接种HCP肝癌细胞)肝癌实体瘤的生长，抑制率达34％。裸鼠肝包膜接种高转移性肝癌LCI-D20瘤块后，早期肝癌组于16天切除肝癌，晚期肝癌组于22天切除肝癌，皮下注射本发明尿多酸肽组合物溶液960mg／kg，早、晚期肝癌切除后肝脏切缘处局部复发肿瘤直径均非常小于对照组(P＜0．01)，肝内和累及脏器转移灶数目也明显减少(P＜0．05)，表明对LCI-D20裸鼠肝癌高转移模型，早期和晚期肝癌切除术后的转移和复发有一定的防治作用。
离体试验本发明尿多酸肽组合物溶液对体外培养的癌细胞有生长抑制、分化诱导作用。其中对人急性早幼粒白血病HL-60细胞作生长曲线和细胞形态学研究，发现有生长抑制作用，药物作用6天后，呈量效关系，IC50为0．18mg／mL；剂量为1．2mg／mL时作用7天后，NBT细胞还原阳性百分率增多，大于50％的细胞由早幼粒向中晚期幼粒方向分化(而未用药组分化率＜3％)，即细胞核缩小，偏向一边，核浆比例减少，出现肾型核，显示细胞已向晚幼粒成熟方向分化。浓度为5mg／mL以上可抑制MHCC97高转移人肝癌细胞株的浸润性；15mg／mL以上能抑制MHCC97对纤维连接蛋白的粘附能力，而该粘附是癌细胞侵袭的始动步骤。浓度为1mg／mL时，能明显抑制人骨髓血癌细胞(HL-60)的生长，并能抑制该细胞中端粒酶的活性。以上均表明本发明尿多酸肽组合物溶液可能是一种细胞分化剂。对人肝癌细胞Smmu7721有抑制作用，其IC50及95％可信限为0．78mg／mL(0．72-0．83mg／mL)。对人肺癌细胞AGZY-83A的生长有抑制作用，呈量效关系，浓度为2．5mg／mL时抑制率约30％左右。
上述实验结果与对比文献提供的数据相比，抗癌活性明显提高。
具体实验内容如下①尿多酸肽组合物对人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)离体和在体生长抑制以及诱导分化作用以台盼兰排染法观察尿多酸肽组合物注射液对体外培养的HL-60细胞的生长抑制作用，并寻找其诱导细胞分化的浓度，以分化浓度的注射液尿多酸肽组合物注射液作用HL-60细胞7天后，再用Giemsa染色镜检。发现，＞50％的HL-60细胞由早幼粒向晚期幼粒方向分化，细胞的NBT还原反应阳性率明显增多。分化的程度与药物剂量有一定依赖性。
以肾囊膜下接种法进行体内试验，将体外培养的HL-60细胞接种于经免疫抑制的昆明种小鼠肾囊膜下，腹腔注射尿多酸肽组合物注射液。试验结果显示，尿多酸肽组合物注射液对接种于小鼠肾囊膜下的HL-60细胞有显著的生长抑制作用，剂量在640mg／kg时，抑制率达64％以上。
②本发明尿多酸肽组合物抗人原发性肝细胞肝癌生长和转移的作用。
用裸鼠以瘤块肝包膜下接种的方法，制备高转移性人肝癌裸鼠模型LCI-D20。接种后10天随机分为4组，(对照组；尿多酸肽组合物低、中、高剂量组)。第11天腹腔注射给药，连续给药20天后处死，剥离肿瘤称重，计算抑瘤率，并观察腹腔转移情况。
应用RT-PCR方法，半定量研究与肝癌相关的癌基因c-myc，N-ras，c-fos和c-jun的基因表达以及与侵袭相关的基质金属蛋白酶MMP-9的基因表达。应用Western印迹及斑点免疫印迹法，检测整合素β1和E-钙粘素的表达。应用免疫组织化学的方法对肝癌组织的增殖性细胞核抗原PCNA Ki67及E-钙粘素的表达进行半定量观察。
应用与上述模型同源的MHCC97高转移肝癌细胞株，观察本发明尿多酸肽组合物溶液对MHCC97粘附、侵润和移动的抑制作用。试验结果表明a．600-1800mg／kg的本发明尿多酸肽组合物溶液，对裸鼠肝包膜下接种的高转移性人肝癌裸鼠模型LCI-D20，有一定的抑瘤作用，抑瘤率约43％。
b．本发明尿多酸肽组合物高剂量组能抑制肝癌的腹腔转移，未发现转移结节，肿瘤呈单个生长。
c．分子生物学研究表明，高剂量本发明尿多酸肽组合物溶液对上述肝癌组织中原癌基因c-myc，N-ras，c-jun和c-fos的表达有明显的下调作用(P＜0．01)。中剂量(M组)本发明尿多酸肽组合物仅能减少N-ras的表达(P＜0．05)。本发明尿多酸肽组合物能有效地下调MMP9基因的mRNA的转录。
d．本发明尿多酸肽组合物溶液使整合素β1亚基下降，且与5-FU有协同作用；使E-钙粘素表达增加。且两者均有统计学意义。
e．细胞学实验结果表明，本发明尿多酸肽组合物在15mg／ml以上的剂量范围内能抑制MHCC97高转移细胞株对纤维连接蛋白的粘附能力。在5mg／ml浓度以上可抑制MHCC97细胞株的浸润能力，但对该细胞的运动无作用。
结论在高转移性原发性肝癌LCI-D20中，本发明尿多酸肽组合物溶液对实体瘤的生长有明显抑制作用。在高剂量(1800mg／kg)作用时能减少腹腔内转移，大多数肿瘤呈单个生长(6／8)。分子生物学研究表明，本发明尿多酸肽组合物处理能下调c-myc、N-ras、c-fos和c-jun基因的表达，能明显增加粘附分子E-钙粘素的表达，部分抑制整合素β1亚基的表达。
③尿多酸肽组合物注射液离体试验对人类血癌细胞的生长和端粒酶活性的抑制离体试验表明本发明尿多酸肽组合物溶液对人骨髓血癌细胞(HL-60)有抑制作用并呈量效关系；并且对该细胞中端粒酶的活性有抑制作用，效果随时间的延长而加强。故认为本发明尿多酸肽组合物溶液可能有促进细胞分化的作用。
④尿多酸肽组合物注射液离体和在体对人肝癌Smmu的药效研究离体试验证明本发明尿多酸肽组合物溶液对人肝癌细胞Smmu7721有抑制作用，其IC50及95％可信限为0．78mg／ml(0．72-0．83mg／ml)。在体试验表明，本发明尿多酸肽组合物溶液剂量为100-400mg／kg时，对裸鼠接种人肝癌细胞株的抑瘤率在51．8-83．5％，具有一定的抑制肿瘤生长的作用。
⑤尿多酸肽组合物注射液离体对肺癌细胞，在体对腹水性肝癌、肝癌实体瘤以及肺癌实体瘤的影响为了观察本发明尿多酸肽组合物溶液的抗肿瘤药效，进行了如下4项试验。离体试验分为7组阴性(模拟处理)对照组；受试药物5个浓度组；阳性(丝裂霉素)对照组。在体试验都分为5组阴性对照组；受试药物低、中、高三个剂量组；阳性对照组。①离体抗肿瘤作用试验将AGZY-83A细胞在5％CO2培养箱中培养，表明受试药物对人肺癌细胞的生长有抑制作用，且呈现量效关系。②在体延长腹水型肝癌动物生存期作用的试验小鼠腹腔内接种HCP肝癌细胞，受试药物能改善动物生活质量，在一定剂量时能延长动物生存期(延长率24％左右)。③在体对抗动物肝癌实体瘤作用的试验小鼠前臂皮下接种HCP肝癌细胞，受试药物能改善动物生活质量，在3种剂量时都能抑制肿瘤生长，抑制率平均可达29％左右，高剂量组可达34．5％(P＜0．05)；而丝裂霉素虽有明显抑瘤效果(P＜0．01)但使动物生活质量明显恶化。④在体对抗动物肺癌实体瘤作用的试验受试药物能改善动物生活质量，3种剂量都能抑制肿瘤的生长，有量效关系，中高剂量组抑制率平均可达20％左右；而丝裂霉素虽有明显抑瘤效果(P＜0．01)但使动物生活质量明显恶化，约1／3动物在试验终止日期前死亡。
结果证明受试药物有一定的抗肿瘤效果，且作用性质与丝裂霉素不同，前者改善而后者恶化动物生活质量。
⑥尿多酸肽组合物注射液防治裸鼠肝癌转移复发的疗效观察采用如下方法证明本发明尿多酸肽组合物溶液对裸鼠早期和晚期肝癌切除术后的转移复发有防治作用裸鼠肝癌高移模型肿瘤接种后，于转移发生前后分别进行肝癌切除术，术后皮下注射本发明尿多酸肽组合物溶液(1200mg／kg)。肿瘤接种后35天处死动物，记录动物体重、切缘复发、肝内转移和远处转移情况。结果证明①晚期肝癌切除后，本发明尿多酸肽组合物溶液组动物体重较高，肝内转移发生减少，肝湿重降低，切缘局部复发肿瘤也较小，反映远处转移的肺转移灶和转移累及的脏器数目也减少；②早期肝癌切除后，本发明尿多酸肽组合物溶液组动物肝内转移灶和转移累及脏器数目也减少，无肺内转移发生。
⑦尿多酸肽组合物注射液逆转肿瘤耐药性的研究用离体试验方法，观察到不同剂量的本发明尿多酸肽组合物溶液能有效地增加VCR对KBV200耐药性细胞的抑制作用，使KBV200耐用药细胞对VCR敏感性提高16倍。但本发明尿多酸肽组合物溶液并未引起KBV200耐药细胞中MDR1基因表达发生明显变化，也未诱导出MRP和GST-π基因表达。进一步研究表明，本发明尿多酸肽组合物溶液均可使敏感H23和耐药H1435细胞中MDR1和GST-π基因的表达随者本发明尿多酸肽组合物溶液剂量增加而减弱或消失，均未诱导出MRP基因表达。提示本发明尿多酸肽组合物溶液对KBV200和H1435耐药细胞均有不同程度的逆转肿瘤耐药的作用，而对KBV200耐药作用可能涉及P-gp以外逆转耐药途径。
⑧毒理研究急性毒性试验给小鼠和大鼠静脉推注或腹腔注射最大容积的本发明尿多酸肽组合物溶液都不能使动物致死，不能测得系列的LD值。根据最大耐受量试验，认为本发明尿多酸肽组合物溶液对小鼠iv或ip的LD50＞50ml／kg(相当2000mg／kg)。对大鼠iv或ip的LD50＞30ml／kg(相当1200mg／kg)。给小鼠iv浓缩受试物，测得LD50及其95％可信限为3794mg／kg(3165~4547mg／kg)。
长期毒性试验共用大鼠和狗二种动物进行了实验，结果表明无论大鼠和狗经过6个月的用药，给药组与模拟处理对照组相比较，各项观察指标皆无有意义的差别。说明本发明尿多酸肽组合物溶液在该种剂量连用6个月的情况下是安全的，无蓄积毒性，未发现任何对机体有害的影响。
一般药理试验所进行的实验表明，本发明尿多酸肽组合物溶液小剂量对猫和大鼠血压无明显影响；中、大剂量是猫和大鼠血压轻度和中等度下降，均为一过性。小、中、大剂量对猫心率无明显影响；中、大剂量使大鼠心率轻度减慢，但无统计学意义。除大剂量使猫和大鼠7例中各1例出现一过性节律不齐外，其余无心电和心律改变。小剂量对猫和大鼠呼吸频度和幅度无明显影响；中剂量使呼吸频度和幅度轻度增大。小、中、大剂量对猫和大鼠精神神经系统各有关指标无影响。
特殊毒性试验用微生物回复突变、微核、精子畸形和致畸4项试验进行了安全性评价。实验结果表明本发明尿多酸肽组合物溶液无致突变、致畸和生殖毒性作用。提示本发明尿多酸肽组合物溶液应用在临床上是安全的。
4．尿多酸肽组合物的药理分析尿多酸肽组合物治疗和预防癌症的主要有效成分包括分化诱导剂，分化帮助剂和抗恶病质剂。
(1)分化诱导剂分化诱导剂是尿多酸肽组合物最重要的有效成分，但含量很少，化学结构也还没有完全清楚。主要的分化诱导物质是与色素结合的有色肽和一特殊的有机酸。这两种分化诱导成分和oligoisoadenylate一样针对异常的癌蛋白质使其消失作用，将导常甲基转移复合酶改变成为正常酶，结果癌细胞就通过缺甲基核酸的合成进行终末分化而停止分裂或产生凋亡。正常细胞的生长和功能则不受尿分化诱导剂的干扰，因为正常细胞没有异常的癌因子，因此这种分化诱导剂是具有很高选择性的抗癌物质。
从酶的研究角度看，异常的甲基转移复合酶转变成正常酶是诱导癌细胞进行终末分化的一个转折点。分析细胞内AdoMet和AdoHcy的量也证明酶的变化在癌细胞分化中所起的重要作用。癌细胞的AdoMet量远比正常细胞为高，因为癌细胞的MATLT比正常细胞的MATLKm嵩出许多。癌细胞一旦分化变成终末细胞，AdoMet和AdoHcy的量也减低很多，也可以说明MATLT和SAHHLT失去致癌因素而变成MATLT和SAHHLT，这些结果从另一角度也证明我们的发现是正确的。
(2)分化帮助剂尿多酸肽组合物的主要化学成分之一是分化帮助剂，分化帮助剂是甲基转移复合酶各成员酶的抑制剂，这些抑制剂的量高到可以明显地抑制各成员酶时也有很好的分化诱导作用，但是因为病因，即异常的癌蛋白因子没有除去，分化是可逆性的，要单独用这类制剂达到抗癌作用不可能，所以我们要强调协助的功能。在剂量不大时，对癌细胞的分裂和分化并没有产生明显的作用，这种剂量却有增强分化诱导剂消除异常癌因子的功能，因此我们把这种化合物命名为分化帮助剂。尿多酸肽组合物中MAT的竞争性抑制剂有苯乙酸、吲哚乙酸和马尿酸，MT的抑制剂则有尿赤素和维生素B2。MA物抑制剂需要mM的剂量才有明显的促进作用，MT的抑制剂只需数μM的剂量就有相同的促进作用，所以MT的抑制剂有比较好的分化协助活性。
分化帮助剂虽然名为协助，其实在分化疗法中是不可或缺的角色。癌细胞用单一的分化诱导剂时总有一小部分细胸，5-10％左右，不能被诱导分化。很可能是在细胞分裂时期某些细胞特别容易受到分化诱导剂的伤害而停顿下来。分化的程序需要经过两个分裂周期，如果细胞受到伤害不能完成两个周期分裂，就不能完成终末分化，因此会有少数没有分化的细胞。造成细胞的伤害是分化诱导剂引起的，当甲基转移复合酶分化诱导剂修正去掉癌蛋白质因子，复合酶会分解成单独成员酶，它们有分解核酸的活性从而造成伤害，经过一段长时间的停顿和修复，癌细胞又恢复原状。这是临床应用单个分化诱导剂所面临的问题，维甲酸对急性早幼粒细胞白血病有良好的疗效，但缓解期只能维持数月就又复发，复发是因为有少数的癌细胞没有完全分化造成的。如果分化是在有分化帮助剂的存在下地行，不管是MAT或MT的抑制剂，则癌细胞的分化可以达到百分之百。分化帮助剂一方面可以促进分化，另一方面又可以防止分化诱导剂引起的细胞伤害使分化顺利完成，复发就可以明显减低；可以减低分化诱导剂的需求量；单用分化帮助剂也有效果，苯乙酸对星形脑瘤的治疗已经肯定。脑局部比较特殊，内在的分化诱导成分消失，所以用分化帮助剂疗效显著。
(3)尿多酸肽组合物与天然化学监察尿中的细胞分化诱导剂和分化帮助剂是人体细胞的低分子代谢产物，既然人体内有天然的抗癌物质，为什么会有癌症发生？我们发现癌症病人绝大多数从尿排泄多于正常人的低分子量代谢物质，持久的过量排泄造成体内缺乏抗癌物质，因而无法抑制细胞的增殖，终于出现床症状，越严重的病人缺失越厉害。这是一种恶性循环，到后来完全失去监控能力，这时癌细胞可以毫不受约束地繁殖下去。异常的甲基转移复合酶是一个很重要的因素，但是天然化学监控能力的破坏也是一个很重要的因素。所以要有效的克服癌症必须要同时顾及这两个因素，即要抑制异常的甲基转移复合酶，也要减低病人过度排泄天然抗癌化学物质，这样才会收到事半功倍的效果。从尿精制的抗癌制剂--尿多酸肽组合物，能兼顾到这两个因素，病人过量排泄低分子代谢物慢慢减少，等到病情好转也就恢复到正常的状态。
病人之所以排泄过量小分子量代谢物质可能是炎症的结果，有发炎的症状就有过度排泄的现象。发炎的结果促使巨噬细胞产生恶病质素(cachectin)，恶病质素的生理作用导致病人过度排泄。急性发炎因为很快恢复正常，对癌症的形成没有很大关系。慢性发炎持久的影响才会促成癌症，爱滋病人及B型肝炎病人到后来往往会发生癌症的原因也与此有关。癌细胞本身也构成慢性炎症的病源，癌细胞越繁殖，发炎的现象越严重，过度的排泄也越明显。有效地控制过度排泄对癌症的治疗是一个很重要的课题。细胞毒药物本身会促进过度排泄，对天然化学监察没有保护反而有破坏作用，不难想像细胞毒疗法的成功需要依赖所有癌细胞消除干净，否则病人经长期细胞毒药物的破坏，没有自卫能力去抑制残余的癌细胞。相反的，从尿精制的抗癌制剂中有些成分可以改善癌症人的过度排泄，病人的天然化学监察能力恢复后，就可依赖本身的自卫能力来消除残余的癌细胞，不用清除所有的癌细胞即可痊愈。这种尿抗癌制剂中的苯乙酰谷氨酰胺就有改善癌症病人过度排泄的功能，虽然这个化合物本身对异常甲基转移复合酶没有作用，对癌细胞也没有直接抑制作用，但是由于能够防止过度排泄抗癌物质，保护天然化学监察能力，对症状较轻的癌症病人也有医疗效果，同时对动物的癌变有显著的预防作用。动物细胞的癌变过程在细胞培养中比在动物体内容易进行，因为动物有天然的化学监察能力，要一段很长的促进时期去除这种自卫能力，癌细胞才能繁殖起来。一般来说，像巴豆油这种发炎促进物质可以缩短促进期，苯乙酰谷氨酰胺可以保护化学监察的能力则可预防癌症的发生。
(4)分化疗法的其它优点癌基因和抑癌基因大多是细胞分裂的调节基因，一旦癌细胞分化了，癌基因的表达会下降，而抑癌基因的表达会上升，这是分化的结果。但是有些和细胞分裂以及分化没有直接关系，而和癌细胞恶变有关联的因素也会随着癌细胞的分化而消失，例如端粒酶(telomerase)是促成癌细胞持续分裂的因子，在癌细胞分化后自然消失，我们发现癌细胞经过尿多酸肽组合物处理后也会导致telomerase消失。抑制细胞凋亡的热休克蛋白质或bcl-2也会随着癌细胞的分化而消失。扩增出来的基因也会因癌细胞分化而消失，包括扩增的myc基因，扩增的多药耐药基因。最重要的是癌细胞转移能力的消失，研究显示尿多酸肽组合物能有效地抑制肝癌的肝内以及肺转移。以上实验充分地说明癌细胞一旦分化成终末细胞就已不再是癌细胞，癌细胞本来具有的种种特性都会随着细胞的分化而消失，所以已经分化的癌细胞即使没有凋亡，对病人已不再构成威胁。
(5)细胞的分化与凋亡正常的干细胞如果缺乏生长素就会凋亡，不过一旦变成终末分化的细胞就不再受缺乏生长素的影响；同样固醇激素的靶干细胞如果缺乏固醇激素也会导致细胞的凋亡；癌细胞如果甲基转移复合酶的成员酶受到干扰或抑制也会促成细胞的凋亡。这些结果很强地暗示甲基转移复合酶和细胞的凋亡有直接的关系，如果甲基转移复合酶能够维持复合酶的状态细胞不会凋亡，否则细胞就会凋亡，所以细胞的凋亡和甲基转移复合酶以及单酶的互变有密切的关系。我们的观察显示核小体的rRNA甲基转移酶的活性和RNA分解酶的活性正好成的比的关系，很有可能甲基转移酶在复合酶中的主要功能是甲基转移，一旦分解成单独酶时就转变成核酸分解酶，这正好说明为什么oligoisoadenglate有很强的诱导核酸分解酶的活性，核酸分解酶强烈表现的结果会中止细胞的分裂而导致细胞的凋亡。这种甲基转移酶与核酸分解酶的互变关系就像微生物DNA甲基转移酶与DNA核酸分解酶同是一个酶，但有两种不同的活性一样。
细胞分化诱导剂抑制异常甲基转移复合酶的结果，会促成癌细胞的分化，也会促成癌细胞的凋亡，因此有些癌细胞分化之后即自行凋亡。我们的实验数据也显示HL-60癌细胞经尿多酸肽组合物处理后，时间一久分化的细胞数会减低，而凋亡的细胞数则在增加。虽然有些癌细胞有分化后即自行凋亡的因果关系，但这种关系并不是必然的，因为控制细胞分化和细胞凋亡的因素毕竟不同。控制癌细胞的分化，异常的甲基转移复合酶是最重要的因素，只要抑制这种酶，癌细胞一定会分化，可是决定细胞凋亡的因素很多，线粒体膜的变化、自杀基因的表达、蛋白质合成、新蛋白酶的出现、DNA的分解，以及抗凋亡的成分的多寡等等。所以分化和凋亡不是必然的因果关系，有些癌细胞向正常细胞分化后反而更不容易凋亡。
(6)尿多酸肽组合物作为辅助疗法分化疗法的缺点是不一定能使肿瘤很快地消失。细胞毒化和放疗主要在促进癌细胞的凋亡，所以肿瘤的缩小较明显，可以用来弥补分化疗法的不足。而这种疗法因为没有控制异常甲基转移复合酶而引起的严重后果，则可以用尿多酸肽组合物来补救。我们发现由于细胞毒药物引起的DNA过度甲基化，如果有细胞分化诱导剂时就不会发生，所以尿多酸肽组合物可以防止化疗因DNA过度甲基化引起的严重后果。不但如此，尿多酸肽组合物甚至可以增进放疗和化疗的效果，因为癌细胞对这两种疗法的抵抗性往往是因为癌基因或抗凋亡因素的表达过多，而这些因素会因癌细胞的分化而降低，因此分化的结果会增加放疗和细胞毒化疗的敏感度。实验已证明本来对放疗有抵抗性的癌细胞经分化诱导剂处理后会变成对放疗敏感，同样也可以增加对化疗的敏感。尿多酸肽组合物在临终病人临床应用的结果也证明可以显著增加化的疗效，并且减轻副作用，提高病人的生活质量。尿多酸肽组合物有明显抑制癌细胞转移的作用，本身又没有毒性，无疑是手术后防止复发的理想药物。
(7)分化疗法的效果分化疗法还处在萌芽阶段，Burzynski用尿抗癌制剂抗瘤酮A10医治晚期的癌症病人，有40-60％的病人达到50％以上或全部肿瘤消失，其中三分之一超出五年而无复发，这类药物最大的优点是没有副作用。
甲基转移复合酶是由MAT、MT和SAHH结合组成。有生长素时复合酶的活性提高，核糖体的产生和DNA甲基分布的复制主可以顺利进行，细胞乃得以在分裂周期运转。一旦生长素不复存在，甲基转移复合酶率先失去活性，而核酸合成酶的活性仍相当稳定，这时细胞会合成缺甲基的核酸，细胞从而由分裂转入分化，核糖体不再产生，分化基因得以表达，这样细胞就分化成终末细胞而停止分裂。
癌细胞产生特异的蛋白质因子与MAT和SAHH结合在一起，这种异常的癌因子使复合酶维持在活性很高的稳定状态，因此癌细胞无法进行终末分化而停留在分裂周期运转不息，癌细胞需要外来的抑制因素，如尿多酸肽组合物将异常甲基转移复合酶的癌因子抵消掉，那么癌细胞就会像正常细胞进行终末分化。
综上所述，尿多酸肽组合物是由新鲜人尿经科学提炼精制而成的抗癌物质，有效成分包括分化诱导剂、分化帮助剂和抗恶病质剂，分化诱导剂是异常甲基转移复合酶的特殊对抗剂；分化帮助剂是甲基转移复合酶各成员酶之抑制剂，有很强的增进分化诱导剂的诱导作用；抗过多排泄剂则能恢复病人的化学监察协能，本发明的尿多酸肽组合物综合了分化疗法的各种药物，通过其协同作用，大大提高了对癌症的治愈效果。
本发明从人尿中经提取和纯化等现代手段，制得含一定比例的肽、氨基酸衍生物、有机酸及无机微量元素的混合物质，系统进行了理化、药效、药理、毒理等系统研究，该制剂对肿瘤有分化诱导、分化帮助和抗过多排泄的协同作用，且毒性低，能促进癌细胞走向正常分化或使癌细胞凋亡，作为新型的抗肿瘤药物，在临床上可用于多种晚期恶性肿瘤的治疗，实验结果表明该药物对多种肿瘤有治疗效果且无毒性，具有很高选择性，可为癌症病人带来福音。
下面结合附图和实施例详细描述本发明药物的制备方法、药物组合物及药物组合物的药理及毒理性附图简要说明图1为尿多酸肽的制备工艺流程2为供试品溶液的色谱3尿多酸肽组合物溶液离体对肺癌细胞影响的测试组、及阴、阳性3个组的肺癌细胞生长曲线图4为马尿酸对照样品的HPLC谱5为苯乙酰谷氨酰胺对照样品的HPLC谱6为苯乙酸对照样品的HPLC谱7为吲哚乙酸对照样品的HPLC谱8为四种有机酸对照样品的HPLC谱9为尿多酸肽组合物溶液(批号980906)有机酸的HPLC谱10为尿多酸肽组合物溶液(批号980907)有机酸的HPLC谱11为尿多酸肽组合物溶液(批号980908)有机酸的HPLC谱12为尿多酸肽组合物溶液(批号980908)马尿酸确证的HPLC谱13为尿多酸肽组合物溶液(批号980908)苯乙酰谷氨酰胺确证的HPLC谱14为尿多酸肽组合物溶液(批号980908)苯乙酸确证的HPLC谱15为尿多酸肽组合物溶液(批号980908)吲哚乙酸确证的HPLC谱16为17种氨基酸国家标准品的HPLC谱17为尿多酸肽组合物溶液(批号980906)游离氨基酸的HPLC分析谱18为尿多酸肽组合物溶液(批号980907)游离氨基酸的HPLC分析谱19为尿多酸肽组合物溶液(批号980908)游离氨基酸的HPLC分析谱20为尿多酸肽组合物溶液(批号980906)水解氨基酸的HPLC分析谱21为尿多酸肽组合物溶液(批号980907)水解氨基酸的HPLC分析谱22为尿多酸肽组合物溶液(批号980908)水解氨基酸的HPLC分析谱23为肽标样分子量测定的HPLC谱24为分子量测定的标准曲线图25尿多酸肽组合物溶液(批号980906)分子量测定的HPLC谱26尿多酸肽组合物溶液(批号980907)分子量测定的HPLC谱27尿多酸肽组合物溶液(批号980908)分子量测定的HPLC谱28尿多酸肽组合物溶液(980906)肽成分分析HPLC色谱29尿多酸肽组合物溶液(980907)肽成分分析HPLC谱30尿多酸肽组合物溶液(980908)肽成分分析HPLC谱31尿多酸肽组合物溶液对体外培养的HL-60细胞生长抑制作用图32尿多酸肽组合物溶液(1．2mg／ml)作用6天对HL-60细胞生长抑制作用图33对照组作用体外培养的HL-60细胞7天后的显微摄影照片图34本发明尿多酸肽组合物溶液(1．2mg／ml)作用体外培养的HL-60细胞7天后的显微摄影照片图35RA(1μg／ml)作用体外培养的HL-60细胞7天后的显微摄影照片图36腹腔注射尿多酸肽组合物溶液对小鼠肾囊膜下生长的HL-60细胞的生长抑制作用图37尿多酸肽组合物溶液作用于小鼠肾囊膜下生长的HL-60细胞的作用7天后切片，HE染色的显微摄影照片--对照组图38尿多酸肽组合物溶液作用于小鼠肾囊膜下生长的HL-60细胞的作用7天后切片，HE染色的显微摄影照片图39维甲酸阳性对照组作用于小鼠肾囊膜下生长的HL-60细胞的作用7天后切片，HE染色的显微摄影照片图40尿多酸肽组合物溶液对肝癌组织中原癌基因表达的影响图41尿多酸肽组合物溶液对肝癌组织的MMP-9基因表达的影响图42尿多酸肽组合物溶液对肝癌组织的整合素β1亚基和E-钙粘素含量的影响图43尿多酸肽组合物溶液对MHCC97肝癌细胞株的体外浸润的抑制图44尿多酸肽组合物溶液对人原发性肝细胞肝癌裸鼠模型LCI-D20生长的抑制作用AC组(上图)L组(下图)图45尿多酸肽组合物溶液对人原发性肝细胞肝癌裸鼠模型LCI-D20生长的抑制作用BM组(上图)H组(下图)图46尿多酸肽组合物溶液对人肝细胞肝癌LCI-D20基因影响A．RNA的鉴定(甲醛变性凝胶电泳)(上左)B．尿多酸肽组合物对人肝细胞肝癌LCI-D20 MMP-9基因影响(RT-PCR)(上右)C．尿多酸肽组合物对人肝细胞肝癌LCI-D20原癌基因影响(RT-PCR)(下中)图47免疫组织化学检测人肝细胞肝癌裸鼠模型LCI-D20中E-钙粘素的表达A．肝细胞膜E-钙粘素表达阳性(上)B．正常肝细胞中E-钙粘素表达强阳性(×100)(+++)(下)图48免疫组织化学检测人肝细胞肝癌裸鼠模型LCI-D20中E-钙粘素表达阳性增多(X100)(++)图49免疫组织化学检测人肝细胞肝癌裸鼠模型LCI-D20中Ki67的表达A．尿多酸肽组合物处理组肝癌组织中Ki67的表达(×100)(+)(A)B．尿多酸肽组合物处理组肝癌组织中Ki67的表达(×100)(++)(B)C．尿多酸肽组合物处理组肝癌组织中Ki67的表达(×100)(+++)(C)图50生长于无尿多酸肽组合物和尿多酸肽组合物在剂量为1和2mg／ml时血癌细胞(HL-60cells)的生长曲线图51以剂量1或2mg／ml的尿多酸肽组合物溶液测试2，4和6天后与对照组相比，血癌细胞(HL-60cells)的增殖(细胞生存率(％))的测试图52血癌细胞在对照和两个尿多酸肽组合物剂量下的相关的端粒酶活性图53生长于有、无尿多酸肽组合物溶液的血癌细胞(HL-60cells)的相关端粒酶活性。
图54尿多酸肽组合物溶液在体对人肝癌Smmu药效研究的CTX阳性对照组瘤的外观图55尿多酸肽组合物溶液在体对人肝癌Smmu药效研究的生理盐水阴性对照组瘤的外观图56尿多酸肽组合物溶液在体对人肝癌Smmu药效研究的高剂量组瘤的外观图57尿多酸肽组合物溶液在体对人肝癌Smmu药效研究的中剂量组瘤的外观图58尿多酸肽组合物溶液在体对人肝癌Smmu药效研究的低剂量组瘤的外观图59尿多酸肽组合物溶液离体对肺癌细胞影响的测试组、及阴、阳性3个组的肺癌细胞生长曲线实施例一．尿多酸肽的制备将1mol／L盐酸溶液约450ml加入20kg新鲜尿液中，调节至pH值约为3；过滤后，收集尿液。
用超滤设备超滤在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜；将收集尿液倒入加料桶中，开始纳滤，控制压力5Mpa，流速800ml／分钟，收集分子量低于10000的低分子滤液，弃去高分子量滤液。
将C18硅胶5kg，用乙醇15L浸泡5分钟，装入袋中放置于漏斗状塑桶内，制成吸附柱，柱截面积0．018m2，用去离子水洗去乙醇，再依次用15升乙醇及25升去离子水洗涤C18硅胶各一次；然后将低分子量滤液以2L／分钟的流速加入柱中；加完后，先用25L蒸馏水以0．5L／分钟的流速洗涤C18硅胶柱；再用10L乙醇以3L／分钟的流速加入C18硅胶柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分为有效洗脱液；将收集的有效洗脱液加入真空干燥机，缓慢加热升温，控制料液温度为30℃，直到溶剂基本蒸发掉；冷冻干燥，得到尿多酸肽组合物干品。
以蒸馏水20L溶解干燥残留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氢氧化钠溶液调节尿多酸肽粗品的pH值到6．0后；将粗品在1℃的低温库中放置80小时；取静置处理后的粗品上层液，在100000级洁净室内，用微孔滤纸过滤，收集滤液，即得尿多酸肽溶液；用一万分子量的超滤膜超滤，以除去热源，再经PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒过滤器过滤除病毒，回收率为投料量的0．18％左右(体积比)，经细胞内毒素检测合格。
尿多酸肽干粉可以复合其它添加剂制成口服片剂或胶囊，尿多酸肽溶液可以制成口服液，也可以制成注射液。
实施例二．尿多酸肽的制备将1mol／L盐酸溶液约500ml加入20kg新鲜尿液中，调节至pH值约为2；过滤后收集尿液。
用超滤设备超滤在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜；将收集尿液倒入加料桶中，开启进料泵，开始纳滤，控制压力为1Mpa，流速900ml／分钟，收集分子量低于10000的低分子滤液，弃去高分子量滤液。
将XAD-8硅胶10kg，用乙醇25L浸泡20分钟，装入袋中放置于塑桶内，制成吸附柱，用去离子水洗去乙醇，再依次用25升乙醇及20升去离子水洗涤XAD-8硅胶各一次；然后将低分子量滤液以1．5L／分钟的流速加入柱中；加完后，先用20L蒸馏水以3L／分钟的流速洗涤XAD-8柱；再用15L乙醇以1．0L／分钟的流速加入XAD-8柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分为有效洗脱液；将收集的有效洗脱液加入真空干燥机，缓慢加热升温，控制料液温度为70℃，蒸发掉部分溶剂后；得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氢氧化钠溶液调节尿多酸肽粗品的pH值到8．0后；将粗品在10℃的低温库中放置160小时；取静置处理后的粗品上层液，在100000级洁净室内，用微孔滤纸过滤，收集滤液，即得尿多酸肽溶液；用一万分子量的超滤膜超滤，以除去热源，再经PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒过滤器过滤除病毒，再通过真空干燥，得到尿多酸肽组合物干品。
回收率为投料量的0．8％左右(体积比)，经细胞内毒素检测合格。
实施例三．尿多酸肽的制备将1mol／L盐酸溶液约520ml加入20kg新鲜尿液中，调节至pH值约为1．2；过滤后收集尿液。
用超滤设备超滤在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜；将收集尿液倒入加料桶中，开启进料泵，开始纳滤，控制压力为2Mpa，流速1200ml／分钟，收集分子量低于10000的低分子滤液，弃去高分子量滤液。
将XAD-7硅胶15kg，用乙醇20L浸泡10分钟，装入袋中放置于漏斗状塑桶内，制成吸附柱，用去离子水洗去乙醇，再依次用20升乙醇及15升去离子水洗涤XAD-7各一次；然后将低分子量滤液以1．0L／分钟的流速加入柱中；加完后，先用15L蒸馏水以1．5L／分钟的流速洗涤XAD-7柱；再用15L乙醇以0．5L／分钟的流速加入XAD-7柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分为有效洗脱液；将收集的有效洗脱液加入真空干燥机，缓慢加热升温，控制料液温度为80℃，直到蒸发掉溶剂；冷冻干燥，得到尿多酸肽组合物干品。
以蒸馏水20L溶解干燥残留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氢氧化钠溶液调节尿多酸肽粗品的pH值到7．4后；将粗品在5℃的低温库中放置120小时；取静置处理后的粗品上层液，在100000级洁净室内，用微孔滤纸过滤，收集滤液，即得尿多酸肽溶液；用一万分子量的超滤膜超滤，以除去热源，再经PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒过滤器过滤除病毒，回收率为投料量的2．5％左右(体积比)，经细胞内毒素检测合格。
实施例四．尿多酸肽的制备将1mol／L盐酸溶液约510ml加入20kg新鲜尿液中，调节至pH值约为1．5；过滤后收集尿液。
用超滤设备超滤在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜；将收集尿液倒入加料桶中，开启进料泵，开始纳滤，控制压力为1．5Mpa，流速1000ml／分钟，收集分子量低于9000的低分子滤液，弃去高分子量滤液。
将XAD-16 12kg，用甲醇22L浸泡23分钟，装入尼龙袋中放置于漏斗状塑桶内，制成吸附柱，柱截面积0．022m2，用去离子水洗去甲醇，再依次用17升乙醇及23升去离子水洗涤XAD-16各一次；然后将低分子量滤液以0．5L／分钟的流速加入柱中；加完后，先用22L蒸馏水以1．2L／分钟的流速洗涤XAD-16柱；再用20L甲醇以2L／分钟的流速加入XAD-16柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分为有效洗脱液；将收集的有效洗脱液加入真空干燥机，缓慢加热升温，控制料液温度为65℃，直到蒸发掉溶剂；冷冻干燥，得到尿多酸肽组合物干品。
以蒸馏水20L溶解干燥残留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氢氧化钠溶液调节尿多酸肽粗品的pH值到7．0后；将粗品在5℃的低温库中放置110小时；取静置处理后的粗品上层液，在100000级洁净室内，用微孔滤纸过滤，收集滤液，即得尿多酸肽溶液；用一万分子量的超滤膜超滤，以除去热源，再经PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒过滤器过滤除病毒，回收率为投料量的3．2％左右(体积比)，经细胞内毒素检测合格后包装为成品。
实施例五．尿多酸肽的制备将1mol／L盐酸溶液约490ml加入20kg新鲜尿液中，调节至pH值约为2．5；过滤后收集尿液。
用超滤设备超滤在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜；将收集尿液倒入加料桶中，开启进料泵，开始纳滤，控制压力为2．5Mpa，流速1100ml／分钟，收集分子量低于9000的低分子滤液，弃去高分子量滤液。
将XAD-16硅胶20kg，用乙醇17L浸泡8分钟，装入尼龙袋中放置于漏斗状塑桶内，制成吸附柱，柱截面积0．010m2，用去离子水洗去乙醇，再依次用22升乙醇及18升去离子水洗涤XAD-16各一次；然后将低分子量滤液以0．7L／分钟的流速加入柱中；加完后，先用18L蒸馏水以1．2L／分钟的流速洗涤XAD16柱；再用8L乙醇以0．8L／分钟的流速加入XAD-16柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分为有效洗脱液；将收集的有效洗脱液加入真空干燥机，缓慢加热升温，控制料液温度为60℃，直到蒸发掉溶剂；冷冻干燥，得到尿多酸肽组合物干品。
以蒸馏水20L溶解干燥残留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氢氧化钠溶液调节尿多酸肽粗品的pH值到7．0后；将粗品在5℃的低温库中放置100小时；取静置处理后的粗品上层液，在100000级洁净室内，用微孔滤纸过滤，收集滤液，即得尿多酸肽溶液。
用一万分子量的超滤膜超滤，以除去热源，再经PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒过滤器过滤除病毒，回收率为投料量的3．9％左右(体积比)，经细胞内毒素检测合格后包装为成品。
实施例六．尿多酸肽组合物的理化常数分别称取尿多酸肽组合物干粉约0．4g各四份，加入10ml去离子水，得到尿多酸肽组合物溶液，批号分别为980905、980906、980907、980908、980909每份的固含量见下表；
分别取样测试如下1．性状与溶液的颜色本发明尿多酸肽组合物溶液五批供试品(批号980905、980906、980907、980908、980909)外观均呈浅黄色、棕色至深棕色澄明液体。
2．不溶性微粒检查按中国药典1995年版二部附录IX C检验，本品均符合规定。
3．pH值按中国药典1995年版二部附录Ⅵ H检查，本发明尿多酸肽组合物溶液的pH值为
4．炽灼残渣按中国药典1995年版二部附录Ⅷ N检查，本品的炽灼残渣为
依结果炽灼残渣定为不得超过2．0％(w／v)。
5．含氮量按中国药典1995年版附录Ⅶ D半微量法检验，精密量取本品1ml测定，测定含氮量为
依结果含氮量不得低于2．0mg／ml。
6．元素测定方法原子吸收分光光度法测定结果如下所示(单位μg／ml)
实施例七．尿多酸肽组合物中有机酸结构的确认用HPLC分析确认本发明的药物组合物中主要含有四种有机酸马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸和吲哚乙酸，并测定了含量。
供试品尿多酸肽组合物，批号980908(固含量0．0405mg／ml)；参照标样购于Sigma公司的纯品，马尿酸，苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸、吲哚乙酸；方法HPLC法仪器及色谱条件Waters510高效液相色谱仪，481型检测器，U6K手动进样器，岛津C-6RA积分仪柱ZORBAX 300SB-C18 4．6×150mm 5μ流动相甲醇∶水(15∶85)0．5％乙酸流速0．6ml／min柱温35℃检测波长260nm对照品溶液的配制分别称取马尿酸、苯乙酸、苯乙酰谷氨酰胺、吲哚乙酸适量，用0．4M氢氧化钠溶液溶解并配成以下浓度的对照品溶液马尿酸6．559mg／ml，苯乙酰谷氨酰胺7．576mg／ml，苯乙酸4．09mg／ml、吲哚乙酸0．214mg／ml。
分别经0．45μm薄膜过滤，取各滤过液1μl(苯乙酰谷氨酰胺取5μl)，记录相应的色谱图，特征峰为马尿酸Rt=5．9；苯乙酰谷氨酰胺Rt1=6．3，Rt2=7．117；苯乙酸Rt=11．467；吲哚乙酸Rt=13．98，见附图4-7。
供试品溶液制备取供试品适量，经0．45μm薄膜过滤，以滤过液作为供试品溶液，进样1μl，记录相应的色谱图见图2。
确证溶液的制备分别取苯乙酸、吲哚乙酸、马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺溶液对照品溶液，与供试品溶液适量混合，经0．45μm薄膜过滤，滤过液作为加入对照品的供试液(确证溶液)。分别进样2μl，记录相应的色谱图，并与样品有机酸分析图谱比较。
马尿酸的确证(见附图12)通过与马尿酸谱图比较，可以看出加入马尿酸后的供试品色谱图中，除Rt=6．1的峰面积比未加马尿酸的样品谱图中相应位置(Rt=5．933)的峰面积明显增大外，其余各峰峰面积基本一致，从而确证样品色谱图中9#峰(Rt=5．933)即为马尿酸。
苯乙酰谷氨酰胺的确证(见附图13)通过与苯乙酰谷氨酰胺谱图比较，可以看出加入苯乙酰谷氨酰胺后的供试品色谱图中，除Rt=6．398的峰面积比未加苯乙酰谷氨酰胺的样品谱图中相应位置(Rt=6．383)的峰面积明显增大外，其余各峰峰面积基本一致，从而确证尿多酸肽样品色谱图中10#峰(Rt=6．383)即为苯乙酰谷氨酰胺。
苯乙酸的确证(见附图14)通过与苯乙酸谱图比较，可以看出加入苯乙酸后的供试品色谱图中，除Rt=11．833的峰面积比未加苯乙酸的样品谱图中相应位置(Rt=11．333)的峰面积明显增大外，其余各峰峰面积基本一致，从而确证样品色谱图中19#峰(Rt=11．333)即为苯乙酸。
吲哚乙酸的确证(见附图15)通过与吲哚乙酸谱图比较，可以看出加入吲哚乙酸后的供试品色谱图中，除Rt=13．767的峰面积比未加吲哚乙酸的样品谱图中相应位置(Rt=13．733)的峰面积明显增大外，其余各峰峰面积基本一致，从而确证样品色谱图中22#峰(Rt=11．733)即为吲哚乙酸。
实施例八．尿多酸肽组合物中有机酸含量的确定仪器、色谱条件仪器Waters510高效液相色谱仪柱ZORBAX SB-C18 3．0 mm×150mm流动相 甲醇∶水(15∶85)0．5％乙酸流速0．4ml／min
柱温35℃检测波长260nm操作A．对照品溶液的配制①马尿酸取5．7毫克溶于2．5毫升甲醇。
②苯乙酰谷氨酰胺取8．3毫克溶于2．5毫升0．4mol／L氢氧化钠溶液。
③苯乙酸取43．0毫克溶于2．5毫升甲醇。
④吲哚乙酸取4．7毫克溶于2．5毫升甲醇。
各取200μl，混匀，进样量为10μl；四种有机酸对照品的HPLC图谱见图8B．供试品溶液配制供试品批号980905(固含量0．0372mg／ml)980906、980907、980908、980909(固含量0．0409mg／ml)取原液用超纯水稀释5倍后，0．45μm薄膜过滤，进样10μl；供试品的HPLC谱图见图9-11。通过分析，四种有机酸的含量如下表所示表6．四种有机酸的含量
以上结果得出，四种有机酸的含量分别为马尿酸4．17-7．94mg／ml；苯乙酰谷氨酰胺4．87-10．86mg／ml；苯乙酸0．66-4．5mg／ml；吲哚乙酸0．11-0．28mg／ml；尿多酸肽组合物中四种有机酸的总含量为26．34-57．65％。
实施例九．尿多酸肽组合物肽氨基酸含量的测定本发明尿多酸肽组合物主成份之一是小分子肽，通过测定游离氨基酸和水解氨基酸量的方法，确定肽氨基酸的量，测试方法和结果如下一、游离氨基酸的测定方法Waters公司PICO．TAGTM氨基酸测定方法。
试剂及仪器十七种氨基酸对照品；异硫氰酸苯酯(PICO)衍生剂；三乙胺；醋酸钠；乙腈。
高压泵、梯度控制仪、紫外检测器、积分仪、柱恒温器、PICO．TAGTM工作站及氨基酸分析专用柱。
色谱条件1．流动相A液三水醋酸钠19．0g溶解于1000mL超纯水中，加三乙胺0．5mL，用冰醋酸调pH6．4，过滤。取滤液940mL加乙腈60mL；B液60％乙腈溶液；2．检测波长254nm；3．柱温38℃；4．洗脱梯度
5．样品稀释液取磷酸氢二钠710mg加超纯水1000mL溶解，用10％磷酸∶乙腈液(95∶5)调pH7．4备用。
测定方法将供试品溶液和5μL对照品溶液分别置于样品小管中，并装入反应瓶，于PICO．TAG工作站上真空干燥30分钟后，每管加10μL再干燥液(乙醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1)，真空干燥30分钟，每管加20μL衍生剂(异硫氰酸苯酯∶乙醇∶三乙胺∶水=1∶7∶1∶1)，室温放置20分钟后，真空干燥。每管加200μL样品稀释液，进样测定。
计算按外标法以国家氨基酸标准品为标准进行计算；得到游离氨基酸的含量为
水解氨基酸的测定方法方法Waters公司PICO．TAGTM氨基酸测定方法。
试剂及仪器十七种氨基酸对照品；异硫氰酸苯酯(PICO)衍生剂；三乙胺；醋酸钠；乙腈。
两台高压泵、梯度控制仪、紫外检测器、积分仪、柱恒温器、PICO．TAGTM工作站及氨基酸分析专用柱。
色谱条件1．流动相A液三水醋酸钠19．0g溶解于1000mL超纯水中，加三乙胺0．5mL，用冰醋酸调pH6．4，过滤。取滤液940mL加乙腈60mL；B液60％乙腈溶液；2．检测波长254nm；3．柱温38℃；4．洗脱梯度
5．样品稀释液取磷酸氢二钠710mg加超纯水1000mL溶解，用10％磷酸∶乙腈液(95∶5)调pH7．4备用。
测定方法将供试品溶液和5μL对照品溶液分别置于样品小管中，并装入反应瓶，于PICO．TAG工作站上真空干燥30分钟后，在反应瓶底加入含1％苯酚的6mol／L盐酸200μl后，用氮气置换空气，操作重复三次。将反映瓶装入恒温加热器(105℃水解2小时)。每管加10μL再干燥液(乙醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1)，真空干燥30分钟，每管加20μL衍生剂(异硫氰酸苯酯∶乙醇∶三乙胺∶水=1∶7∶1∶1)，室温放置20分钟后，真空干燥。每管加200μL样品稀释液，进样测定。
计算按外标法以国家氨基酸标准品为标准进行计算；得到水解氨基酸的含量为
肽氨基酸含量∶肽氨基酸=水解总氨基酸-游离氨基酸结果(1)氨基酸国家标准品(中国药品生物制品检定所分发)的HPLC色谱图(见附图16)。
(2)尿多酸肽组合物溶液的游离氨基酸的HPLC色谱图及各峰对应的游离氨基酸见附图17-19。
(3)尿多酸肽组合物溶液的水解总氨基酸的HPLC色谱图及各峰对应的游离氨基酸见附图20-22)由图16-22可见，三批尿多酸肽组合物溶液的游离氨基酸及水解氨基酸测定中，各氨基酸的保留时间与对照品(十七种氨基酸国家标准品)的保留时间基本一致。
例如十七种氨基酸国家标准品中，谷氨酸(Glu)的保留时间Rt=1．867，尿多酸肽组合物溶液(批号980906)中游离氨基酸的保留时间Rt=1．800，水解后谷氨酸的保留时间Rt=1．817；对照品中丙氨酸的保留时间Rt=6．483，尿多酸肽组合物溶液(批号980906)中游离丙基酸的保留时间Rt=6．508，水解后丙氨酸的保留时间Rt=6．308；对照品中酪氨酸的保留时间Rt=8．383，尿多酸肽组合物溶液(批号980906)中游离酪基酸的保留时间Rt=6．508，水解后酪氨酸的保留时间Rt=8．342；可见各氨基酸的保留时间与对照品中各峰的保留时间基本一致，略有漂移。
(4)尿多酸肽组合物溶液中氨基酸含量的实验结果如下
HPLC，PICO·TAGTM专一性系统检测本品游离氨基酸含量为0．8-1．3mg／ml，水解总氨基酸含量为8．5-11．4mg／ml，通过计算得出肽氨基酸量为7．7-10．9mg／ml，肽氨基酸占水解总氨基酸量为90．6-95．6％，总肽含量约为20．7-26．7％，因而该肽的成份应为本发明尿多酸肽组合物溶液的主成份之一。
实施例十．尿多酸肽组合物肽分子量的测定本发明尿多酸肽组合物中肽的分子量，目前尚未见报导，现用HPSEC法测定本发明尿多酸肽组合物溶液的分子量。
1．供试品尿多酸肽组合物溶液由本公司生产提供，批号980905、980906、980907、980908、980907。
2．肽标样由中国药品生物制品检定所提供多肽与小分子蛋白分子量标准品。
3．实验材料与方法仪器组成Waters510泵、481型检测器、U6K进样器、积分仪或工作站、pH计。
色谱条件流动相0．05％TFA10％乙腈的水溶液流速1．0ml／min柱TSK GEL G2000SW×L7．8mm×300mm 5μ。
柱温室温检测波长214nm分子量标准曲线制作称取核糖核酸酶A(M．W13700)2mg，胰岛素(M．W．5808)2mg，Somatostain(M．W．1521)2mg、6肽(M．W．564)2mg，分别溶于1ml流动相中，再各取等量混合，经0．45μm薄膜过滤后，进样1μl，记录相应的保留时间，重复进样5次，其保留时间相对标准偏差不得大于2．0％。以保留时间为横坐标，分子量对数为纵坐标进行线性回归，相关系数不得小于0．99。通过回归方程计算出对应于分子量1．0万的保留时间。
供试品测定取供试品适量，0．45μm薄膜过滤，进样1μl，记录相应的谱图，按面积归一化方法计算。
4．实验结果肽标样分子量测定的HPLC谱图见附图23。
①肽标样分子量测定结果如下表所示
②回归方程及标准曲线以前三点进行线性回归(舍6肽一点)，得回归方程，标准曲线见图24Y=6．685-0．39X，r=0．9991(线性范围Rt6．5748-90064)③根据回归方程计算，对应分子量1万的保留时间为Rt=6．88④尿多酸肽组合物溶液样品的分子量测定谱图见附图25-27，谱图中，前三个峰的保留时间均在标准曲线的线性范围内，根据回归方程计算，这三个峰(1#、2#、3#)对应的分子量如下表
三个各峰对应的分子量分别为7000--9200，4000-5800，1000-2100。
⑤尿多酸肽组合物溶液样品的分子量最大为9200，所含多肽的分子量均小于10000道尔顿，由此可见，该品中肽基本以小分子肽的形式存在。
实施例十一．尿多酸肽组合物的肽成份分析尿多酸肽组合物的主成份，除游离氨基酸及四种有机酸外，尚有一定比例的小分子肽，经用HPLC排阻层析法分离该品的肽成分，获得分子量一万以下多相性小分子肽组分。
1．供试品本公司生产提供，批号980906、980907、980908。
2．HPLC排阻层析法试剂磷酸盐缓冲液(0．02mol／L)称取磷酸二氢钾2．72g，溶于500ml超纯水中，用0．1mol／L NaOH调pH至7．4，用超纯水稀释至1000ml。
仪器及系统Waters HPLC510型泵、481型检测器、740型数据处理器柱Protein-Pak．TM60 7．8mm×300mm；流速1．0ml／min；流动相磷酸盐缓冲液(0．02mol／L)；柱温37℃；检测波长280nm。
取待测供试品5μl，进样，记录分析结果，计算出肽的相对百分含量。
3．结果经用HPLC排阻层析法，凝胶柱Protein60分离并检测本发明尿多酸肽组合物的肽成分，得到一系列的肽峰(见附图28-30)，数量为12-15个。其中有二个十分明显的主峰，特征峰之一的保留时间为6．805-7．493，三批相对百分含量分别为15．89％、16．16％、16．27％、．16．56％、17．56，即15．89-17．56；而另一个特征峰保留时间的均值为7．722-8．824，三批相对百分含量分别为18．68％、19．27％、19．61％、19．19％、19．98％，即18．68-19．19。
其结果如下
实施例十二．尿多酸肽组合物溶液对HL-60细胞离体和在体实验中的生长抑制作用以及诱导分化作用。
1．受试药物尿多酸肽组合物溶液由本公司生产提供，批号970813，玻璃瓶胶塞铝盖无菌封装，每瓶100ml，固形物含量200mg／ml2．动物小鼠为昆明种封闭群，体重18-22g，皆为雌性，由中科院上海实验动物中心提供。合格证号中科动管会005。各组动物数为8只，健康，预饲养7日。
3．饲养管理条件群养，每笼5只，室内温度、湿度、光照和通风自然，必要时开通风扇。自由摄食充足供水。实验前观察1周并记录相应情况。
4．肿瘤细胞株人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)由中科院上海药物所肿瘤药理组传代培养。
5．试剂维甲酸(RA)上海瑞金医院提供，批号961109。
环磷酰胺上海第十二制药厂生产，批号960706。
凝血酶、纤维蛋白原、RPMI-1640、NBT、PMA，均购自Sigma公司。
6．尿多酸肽组合物溶液离体对HL-60细胞生长抑制作用6．1试验方法及步骤台盼兰排染法用于观察对细胞的生长抑制情况，试验设空白对照，制剂对照，用药组和阳性对照组。
取对数生长的细胞，计数，用RPMI-1640培液配制细胞悬液，细胞数为2．0×105／ml，细胞液加入96孔板，置于37℃、CO2培养箱，药物作用6天，加台盼兰计数活细胞数，计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
以抑制率作为评价标准，计算方法如下抑制率=(对照组活细胞数-用药组活细胞数)／对照组活细胞数×100％6．2试验结果首先观察尿多酸肽组合物溶液作用6天时，对HL-60细胞的抑制作用(即量效关系试验)，试验共三批，结果合列于表7。其中一批结果作成附图31。可知本发明尿多酸肽组合物溶液对体外培养的HL-60细胞有直接生长抑制作用。药物作用细胞6天后，其IC50为0．18mg／ml。
表7不同浓度尿多酸肽组合物溶液对HL-60细胞生长的抑制作用
#μg／ml，*P＜0．01又以1．2mg／ml的尿多酸肽组合物溶液，进行了处理不同天数对HL-60细胞生长曲线抑制作用的动态观察，每日计数细胞数，结果见表8及附图32。可知对照组细胞呈线性生长，用药组细胞生长受抑制，至接种后的第6天，用药组细胞与接种时细胞数仍相近。
表8尿多酸肽组合物作用细胞不同天对HL-60细胞生长的抑制情况
6．3试验结论体外实验结果表明本发明尿多酸肽组合物溶液对HL-60细胞有明显抑制的作用，且有量效关系。药物作用6天，当浓度大于2mg／ml时，细胞全部死亡，其对HL-60细胞的IC50为0．18mg／ml，而且能使HL-60细胞生长曲线明显受到抑制(曲线变平)。
7．本发明尿多酸肽组合物溶液溶液对HL-60细胞诱导分化作用7．1试验方法及步骤7．1．1NBT还原反应药物作用细胞7天，取细胞悬液，以1000rpm的速度离心分离，收集细胞弃上清液，以PBS洗1次，加入含有TPA的NBT工作液，37℃保温45分钟，离心1000rpm收集细胞，镜检，显微镜下观察200个细胞，胞浆中有蓝紫色者为NBT还原阳性细胞，算出NBT反应阳性细胞百分数。
7．1．2形态学变化的观察药物作用细胞7天，取细胞悬液，离心1000rpm收集细胞弃上清液，细胞涂于载玻片上，晾干，用甲醇固定3分钟，缓冲液冲洗晾干，Giemsa染色，在显微镜下观察细胞形态。计数200个细胞，算出成熟细胞百分数。
7．2试验结果NBT还原反应和细胞形态学的观察结果综合列于表9。可知①药物作用HL-60细胞7天，细胞NBT还原反应阳性百分率增高，有大于50％的细胞向中、晚幼粒方向分化，与对照组相比差异在统计学上有非常显著意义(P＜0．01)。未用药组的分化率小于3％。②用药组分化成熟细胞百分率也明显高于对照组(P＜0．01)。③RA组的相应数值也都明显高于对照组(P＜0．01)，说明本试验方法有效可靠。
显微镜下细胞形态观察结果列于附图33-35。
表9尿多酸肽组合物体外作用HL-60细胞7天后的诱导分化作用
7．3试验结论体外试验表明本发明尿多酸肽组合物溶液在1．2mg／ml时对HL-60细胞有生长抑制作用，在此药物浓度作用下，HL-60细胞培养7天后NBT还原反应阳性细胞增多，有50％以上的细胞形态发生改变，细胞核缩小，偏向一边，核浆比例减少，出现肾型核。显示细胞由早幼粒向晚幼粒成熟方向分化。
8．尿多酸肽组合物溶液在体试验对人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)生长抑制及诱导分化作用8．1试验方法及步骤8．1．1试验方法体内试验选用小鼠肾囊下接种法。
8．1．2试验步骤纤维蛋白凝块的制备取对数生长期的HL-60细胞，1000×g／min离心5min，浓缩体积到1ml，其中含细胞4×107个。先后加人纤维蛋白和凝血酶工作液使之形成细胞凝块，在培液中将它切成等体积小块用于移植。
接种选用25-28g的昆明小鼠，接种前一天腹腔注射环磷酰胺(150mg／kg)以抑制其机体免疫反应。移植时将凝块插入到小鼠肾囊膜下。
8．1．3分组及剂量设置给药前动物随机分组，每组动物数为8只。本发明尿多酸肽组合物溶液溶液设320，640，1280mg／kg三个剂量组，不同剂量组用生理盐水稀释成所需浓度，阳性对照组用维甲酸(RA)，RA为目前临床上应用的肿瘤诱导分化剂。对照组用生理盐水。
8．1．4给药方法均为腹腔注射给药。本发明尿多酸肽组合物溶液溶液于接种后次日给药，连续7天。空白对照给生理盐水。
8．1．5疗效评价第8天处死动物，在解剖镜下以接目测微尺测量肿瘤长短径。
肿瘤体积=长径×短径×短径／2。
抑瘤率=(对照组瘤体积-用药组瘤体积)／对照组瘤体积×100％。
8．1．6形态观察将荷瘤鼠肾在10％甲醛中固定，用石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察形态变化。
8．2试验结果数据的统计处理用t-检验和Logit法计算ED50，均以“药理学计算与统计程序”软件进行处理。
各组试验结果列于表10(包括重复试验在内共三批)和附图36。可见随本发明尿多酸肽组合物溶液溶液剂量的增加其抑瘤率也因之上升。对第一批结果，Logit法计算本发明尿多酸肽组合物溶液溶液对小鼠荷瘤的ED50为87mg／kg。二、三批结果数值高一些。t-检验表明各用药剂量组的抑瘤率与对照组相比均有显著差异。药物在中剂量和高剂量时的抑瘤率与阳性对照组RA抑瘤率相似，给药后小鼠体重毛色均无明显不良变化。
表10不同剂量本发明尿多酸肽组合物对小鼠肾囊下HL-60细胞生长抑制作用
*P＜0．05．**P＜0．01
各组肾囊膜下生长的HL-60细胞的形态学显微照片见附图37-39。
8．3试验结论通过体内试验表明，本发明尿多酸肽组合物溶液对HL-60细胞生长有明显的抑制作用，剂量在640mg／kg时抑瘤率达到66％左右，三次重复试验结果表明，加大用药剂量后其抑瘤率依然维持在此水平，显示了分化诱导剂的非杀伤性特点。
目前体内的分化诱导试验模型不多，我们采用国际上比较成熟的方法即Fimgert的肾囊膜下接种分析法，将体外培养的人体肿瘤细胞接种于经免疫抑制的昆明小鼠肾囊膜下，用药后经固定、切片、HE染色，镜检观察细胞形态。结果发现，本发明尿多酸肽组合物溶液在640-1280mg／ml时HL-60细胞形态上呈现明显的分化现象，瘤组织中出现大量中晚幼粒及成熟细胞，其分化程度在1280ml／kg时更为明显。
实施例十三尿多酸肽组合物溶液抗人原发性肝细胞肝癌生长和转移的作用1．受试药物注射用尿多酸肽组合物由本公司生产提供。合卫药批(95)003号，批号980701，固含量200mg／ml，每瓶100ml。
2．受试动物裸小鼠品系SPF级，BALB／C裸小鼠。由中国科学院上海药物研究所实验动物部(上海市实验动物管理委员会认可并颁发和合格证的单位)提供。合格证号沪动合证字122号。体重18-22克，每组动物数为8只。
3．细胞株LCI-D20人原发性肝癌的高转移模型，由上海医科大学肝癌研究所建立。该肝癌在肝包膜下原位接种后可快速生长并有腹腔内和肺转移，转移率可达100％。
人肝癌细胞系MHCC97由上海医科大学肝癌研究所建立。该细胞与LCI-D20人原发性肝癌的高转移模型同源，具有高转移特性。
4．在体注射用尿多酸肽组合物对人原发性肝细胞肝癌生长和转移的抑制作用4．1实验方法4．1．1LCI-D20人原发性肝癌高转移裸鼠模型的制备将LCI-D20人原发性肝癌高转移瘤块在无菌条件下切割成1mm3大小备用。裸鼠预饲养7天后施行手术。裸鼠麻醉后常规消毒，打开腹腔，将瘤块行包膜下套管接种，关腹并将动物放回饲养，观察。术后无感染，伤口愈合良好。术后继续喂养10天，第11天开始给药，连续20天。
4．1．2实验分组给和给药方案对照组生理盐水低剂量组(L)注射用尿多酸肽组合物600mg／kg。
中剂量组(M)注射用尿多酸肽组合物1200mg／kg。
高剂量组(H)注射用尿多酸肽组合物1800mg／kg。
由于LCI-D20人原发性肝癌高转移裸鼠对细胞分化剂视黄酸(RA)并不敏感，无肯定的疗效，故本实验未设阳性对照组。
4．1．3实验方法和观察指标药物均为腹腔注射。模型鼠在术后继续喂养10天，第11天开始给药，连续20天。第21天处动物，剖腹观察肿瘤生长和腹腔转移的情况。
肿瘤称重并用下列公式计算抑瘤率肿瘤抑制率(％)=(1-T／C)×100式中T为给药组平均瘤重；C为对照组平均瘤重。
肝癌转移观察指标肉眼观察腹腔肿瘤的播散结节，多发结节和广泛转移的状况。
4．2实验结果
4．2．1注射用尿多酸肽组合物对人移植性高转移肝癌LCI-D20生长的抑制作用结果见表11。可知注射用尿多酸肽组合物3剂量对瘤的生长均有抑制作用。
表11注射用尿多酸肽组合物对人移植性高转移肝癌LCI-D20生长的抑制作用
*P＜0．05，**P＜0．01，按Student t-test统计处理4．2．2注射用尿多酸肽组合物对人移植性高转移肝癌LCI-D20腹腔转移的影响结果见表12。表明注射用尿多酸肽组合物治疗可大大减少移植性肝癌的腹腔转移。治疗各组均未发现广泛转移其中尤以H组的疗效显著。
表12注射用尿多酸肽组合物对人移植性高转移肝癌LCI-D20腹腔转移的影响
5．注射用尿多酸肽组合物对肝癌组织中原癌基因表达的影响5．1实验材料和方法5．1．1实验材料肝癌组织取自对照组和注射用尿多酸肽组合物处理各组。组织置于-80℃保存备用。TRIzol购自GIBOCO公司。AMV逆转录酶，Taq DNA聚合酶，Rnasin，dNTP，Oligo(dT)15购自PROMAGA公司。PCR引物由上海赛百盛公司代理在加拿大合成。引物序列如下
5．1．2 RNA提取本实验采用TRIzol一步法。50mg肝癌匀浆后加入1ml TRIzol液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。加入0．2ml氯仿，颠倒混匀，冰上放置5分钟，12000rpm，4℃离心15分钟。取约0．6ml上层液体，加入0．5ml异丙醇，室温放置30分钟，12000rpm，4℃离心10分钟。弃去上清，用预冷的75％乙醇洗两次。弃乙醇后置室温20分钟以挥发至干。每管的纯化的DNA用50μl DEPC处理的水溶解，保存在-70℃。
5．1．3逆转录反应(Reverse Transcription，RT)10μl RNA样品在70℃变性10分钟，分别加入5X逆转录缓冲液10μl，2．5mM dNTPs，12μl；AMV逆转录酶20U，RNasin50U，Oligo(dT)15200ng；用DEPC水补足体积至50μl。42℃温育1小时，95℃变性10分钟。
5．1．4多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)分别取逆转录反应物(cDNA)用于PCR反应。其体系为逆转录反应物，5μl；10xPCR缓冲液，5μl；上，下游引物各20pmol；Taq DNA聚合酶，5U；2．5mM dNTPs，2μl；15mM MgCl25μl，最后用水补足体积至50μl。反应条件为95℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，1．5分钟。共35个循环；然后72℃下延伸10分钟。PCR产物经2％琼脂糖(含0．5μg／ml的溴化乙啶)电泳，电泳图谱由VDS凝胶图象分析系统扫描分析得测定条带的积分光密度(IntegratedOptical Density，IOD)。
5．1．5计算和统计本实验以β-actin作为内参照标准。
基因相对表达值=IOD测定条带／IODβ-actinStudent t- test为统计方法。
5．2试验结果5．2．1注射用尿多酸肽组合物对移植性高转移肝癌LCI-D20组织中原癌基因表达的影响结果见表13和图40。研究表明，高剂量注射用尿多酸肽组合物(H组和H+CT组)对上述肝癌组织中原癌基因c-myc，N-ras，c-jun和c-fos的表达有明显的下调作用。中剂量(M组)注射用尿多酸肽组合物仅能减少N-ras的表达，而低剂量注射用尿多酸肽组合物(L组)对上述基因的mRNA的表达无作用。表13注射用尿多酸肽组合物对人移植性高转移肝癌LCI-D20组织中原癌基因表达的下调作用
本表数据为基因相对表达值，*P＜0．05，**P＜0．01，与对照组相比6．注射用尿多酸肽组合物对肝癌组织中基质金属蛋白酶9(Matrix Metalproteinase-9，MMP-9)基因表达的调节6．1材料和方法RT-PCR的方法同B-1-1 。
MMP-9的上游引物5′-TGGCCGGCCACTGTGCGCCCCTCCGAG-3′。下游引物5′-CACTAGGTTCACCTTCGTTCCGGGTACT-3′。扩增片段长度为633bp。PCR反应条件94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min；共40个循环，72℃延伸5min。
6．2结果结果见表14的MMP-9项和图41。MMP-9是近年来发现的，与肿瘤细胞水解细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)的能力相关，是反映肿瘤侵袭和转移能力的客观指标之一。注射用尿多酸肽组合物能有效地下调该基因的mRNA的转录。研究表明，本研究所采用的剂量范围内，呈一定的剂量效应。且与5-FU(5-氟尿嘧啶上海旭东海普药业有限公司，沪卫药准字(1995)第013013号，批号980704，制剂0．5g／10ml)有协同效果。
表14注射用尿多酸肽组合物对MMP-9基因转录的抑制作用；注射用尿多酸肽组合物治疗对肝癌组织的整合素β1亚基和E-钙粘素含量的作用
与C组相比，*P＜0．05；**P＜0．01．数据以积分光密度Mass／g组织表示。
7．注射用尿多酸肽组合物对整合素β1亚基和E-钙粘素表达的影响7．1材料和方法材料肝癌组织的收集同上。抗整合素β1亚基单克隆抗体(Anti-human Integrin β1mAb)由上海医科大学基础医学院生物化学教研组查锡良教授馈赠。抗E-钙粘素抗体(Anti-human E-Cadherin mAb)，购自Santa-Crus公司。HRP-羊抗鼠IgG，华美公司。其他试剂均为分析纯。
Western印迹法样品称重后加入裂解液RIPA1ml，冰浴放置10分钟。然后4℃下500rpm离心15分钟，取上清液。将处理的样品液上样后作SDS聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳结束后将凝胶置于半干式电转移仪中，从凝胶上直接将蛋白质转移至PVDF膜上，然后以含3％BSA的封闭液中封膜二小时后加入第一抗体，4℃过夜，第二天按常规洗涤后加入HRP标记的二抗，温育二小时后，用DAB显色。将显色后的PVDF膜晾干。在VDS图像分析系统下扫描半定量，得条带的IOD值。凝胶则作考马斯亮蓝染色以了解电转移的情况。
斑点免疫印迹(Dot Immunoblotting)先将PVDF膜放在甲醇中浸透(约3分钟)，以去离子水漂3次后，用0．02M PBS洗膜两次，然后将膜置于电杂交仪内，但形成负压后，每孔加样品原液10μl．(标本处理同Western印迹法)。标本均作双份点样，点样后将膜以含3％BSA的封闭液中封膜二小时后加入第一抗体，4℃过夜，第二天按常规洗涤后加入HRP标记的二抗，温育二小时后，用DAB显色。将显色后的PVDF膜晾干。在VDS图像分析系统下扫描半定量，得斑点的Mass值。
结果表示以IOD或Mass／g肝癌组织表示。
7．2结果肿瘤在生长和转移过程中，往往有粘附分子表达的改变。整合素β1亚基(Integrinβ1 subunit)是一类重要的异型粘附分子，介导异种细胞间的粘附，参与细胞的信息传导。而E-钙粘素(E-Cadherin)也是一类重要的同型粘附分子，参与同种细胞间的粘附；肿瘤转移时原位灶的E-钙粘素表达会有明显的减少。结果显示与对照组(C组)相比，注射用尿多酸肽组合物治疗后，M组，H组，H+CT组的整合素β1亚基量的下降有统计学意义。而H组和H+CT组的E-钙粘素的含量的上升有显著意义。见表14的相关项和图42。
8．应用免疫组织化学检测注射用尿多酸肽组合物治疗对肝癌组织的E-钙粘素和增殖性细胞核抗原Ki67的影响8．1．材料和方法材料抗人增殖性细胞核抗原Ki67抗体购自华美公司。其余试剂同上述部分。
方法1)新鲜肝癌标本用甲基纤维素(OCT)包埋后，在恒冷切片机上制备8μ冰冻切片，然后用丙酮在室温下固定10分钟，备用。
2)切片用正常羊血清封闭半小时后洗去。分别加上E-钙粘素或Ki67工作液(1∶50)，置于4℃过夜。
3)用PBS液洗去一抗，共三次，用滤纸吸去组织周围的缓冲液(以下同)，再加入生物素化二抗(抗羊或抗鼠IgG)，在室温下温育一小时。再用PBS洗去二抗后加上三抗(A+B混合物)，室温下温育一小时，然后用PBS洗去。
4)DAB溶液(0．5mg／ml)加3％ H2O25-10μl混匀后滴在切片上染色。湿片在显微镜下看到出现棕黄色颗粒，然后洗去DAB液。切片在以苏木精复染，脱水封片镜检。
5)判断标准E-钙粘素棕黄色颗粒定位于胞浆和／胞膜的癌细胞为阳性细胞。阳性细胞占肿瘤细胞总数的百分比≤5％为+；≤20％为++；＞20％为+++。
Ki67棕黄色颗粒定位于胞核的癌细胞为阳性细胞。阳性细胞占肿瘤细胞总数的百分比≤5％为+；≤20％为++；＞20％为+++。
8．2结果8．2．1注射用尿多酸肽组合物对LCI-D20肝癌组织中E-钙粘素表达的免疫组织化学检测结果见表15，显示，注射用尿多酸肽组合物可增加组织中E-钙粘素的表达。与对照组相比，治疗各组的阳性率增加。其中以M组增加最为显著。
表15免疫组织化学法对肝癌组织中E-钙粘素、Ki67检测的半定量结果
8．2．2注射用尿多酸肽组合物对LCI-D20肝癌组织中Ki67表达的免疫组织化学检测结果显示见表15右侧，各种剂量的注射用尿多酸肽组合物处理对LCI-D20肝癌组织中Ki67表达无明显的影响。
9．注射用尿多酸肽组合物对高转移人肝癌细胞株MHCC97粘附、浸润和移动性能的影响9．1注射用尿多酸肽组合物对高转移人肝癌细胞株MHCC97粘附性能的影响9．1．1材料和方法1)纤维连接蛋白包被板的制备将1mg／ml纤维连接蛋白(Fibronectin，Sigma公司)用0．01mol／L PBS稀释至10ng／ml。用无血清的DMEM培养液洗后用无血清的DMEM培养液调配至5×103细胞／50μl。以每孔100μl包被96孔酶标板，37℃，2小时温育后4℃过夜。次日以PBS洗板，再用0．1％BSA(Sigma公司)封闭，37℃，2小时。用PBS洗后待用。
2)细胞制备用0．25％胰酶；0．02％EDTA消化细胞，并用无血清的DMEM培养液洗后用无血清的DMEM培养液调配至5×103细胞50μl。
3)粘附实验在纤维连接蛋白包被板上加入已处理的人肝癌细胞MHCC97，5×103细胞／孔。对照孔加入50μl PBS；实验孔加入注射用尿多酸肽组合物至设定的浓度。每孔总体积为100μl。37℃，5％CO2孵育4小时，轻柔洗去未粘附的细胞。每孔用100μl 10％中性福尔马林固定30分钟，5％结晶紫染色10分钟。SLT210酶标仪测定光密度，波长为595nm。
4)分组对照组50μl DMEM(含5×103细胞)+50μl PBS
注射用尿多酸肽组合物实验组10mg／ml组50μl DMEM(含5×103细胞)+25μl注射用尿多酸肽组合物+25μl PBS15mg／ml组50μl DMEM(含5×103细胞)+37．5μl注射用尿多酸肽组合物+12．5μl PBS20mg／ml组50μl DMEM(含5×103细胞)+50μl注射用尿多酸肽组合物9．1．2结果结果列于表16。本实验共进行6次，其结果相同，趋势一致。除10mg／ml注射用尿多酸肽组合物与对照相比无显著差异外，15mg／ml和20mg／ml注射用尿多酸肽组合物对MHCC97高转移细胞株对纤维连接蛋白的粘附抑制作用与对照相比有显著性差异(P＜0．05)。
表16注射用尿多酸肽组合物对高转移人肝癌细胞株MHCC97粘附性能的影响
p＜0．0001，注射用尿多酸肽组合物整体与对照组相比方差分析(F检验)的结果9．2注射用尿多酸肽组合物对高转移人肝癌细胞株MHCC97浸润性能的影响、注射用尿多酸肽组合物离体对MHCC97人高转移肝癌细胞株蛋白酶的抑制作用9．2．1材料和方法用0．05mol／L TBS液(Tris-HCl，pH7．6；0．17mol／L NaCl，0．02mol／L CaCl2)配制2％琼脂糖，高压消毒，冷却至37℃时与预热的Ⅰ型胶原(Collagen Type I Solution，3mg／ml，日本和光纯药工业株式会社)按1∶1混合后，加入到24孔培养板，每孔800μl，4℃凝结过夜。次日用打孔机打孔，然后将处理好的MHCC97细胞分别加入不同的孔中，每孔20μl(含1×104细胞)。每组3孔。小心加入无血清的DMEM培液。37℃，24小时孵育。小心取出凝胶片，用生理盐水充分洗涤后，浸于0．1％考马斯亮蓝R250溶液(以45％甲醇-10％冰醋酸配制)中，室温下染色30分钟，移至45％甲醇-10％冰醋酸溶液中脱色，拍照。
细胞制备同前。注射用尿多酸肽组合物浓度设置为1．25mg／ml，2．5mg／ml和5．0mg／ml。
9．2．2结果结果见表14及附图43。对照组中，由于MHCC97细胞有分泌胶原酶和明胶酶的能力，对细胞外基质，如胶原蛋白有强的降解的能力。故本实验中，细胞外的胶原蛋白大部分被降解，所以考马斯亮蓝R250不染色或较少染色。与对照组相比，1．25mg／ml的注射用尿多酸肽组合物处理并不表现对胶原酶的抑制；而2．5mg／ml的注射用尿多酸肽组合物呈现对胶原酶的抑制；5．0mg／ml以上的注射用尿多酸肽组合物表现出最大的抑制作用。说明注射用尿多酸肽组合物能抑制MHCC97细胞的浸润性。
9．3注射用尿多酸肽组合物对高转移人肝癌细胞株MHCC97移动性能的影响9．3．1材料和方法用0．01mol／L PBS液配制0．7％琼脂糖，高压消毒，稍冷却加到24孔培养板，每孔2000μl，4℃凝结过夜。次日用打孔机打孔，然后将处理好的MHCC97细胞分别加入不同的孔中，每孔20μl(含5000个细胞)。每组3孔。小心加入含10％人AB型血清的DMEM培液1．5ml。24小时后吸去培液。分别再加含0．625mg／ml，1．25mg／ml，2．5mg／ml，5mg／ml和10mg／ml注射用尿多酸肽组合物的DMEM培液(含10％人AB型血清)。每孔加1．5ml，每组3孔。每二天换液一次，共培养5天，每24小时观测细胞的移动距离。
9．3．2结果除10mg／ml注射用尿多酸肽组合物的细胞趋变性坏死，未见明显的细胞向外移动外，其余各组与对照组相比无明显差异；细胞均有向外移动，且移动距离的差异无统计学意义。实施例十四．注射用尿多酸肽药物组合物离体试验对人类血癌细胞的生长和端粒酶活性的抑制人的骨髓血癌细胞(HL-60cells)株从长庚大学医学院临床医学研究所获得。细胞株保持在悬浮于RPMI-1640的培养基中(GIBCO，长岛，纽约)，包含10％的牛胎血清(HyClone，Ligan，UT)在5％二氧化碳和95％空气温度、37℃的培养箱中。
注射用尿多酸肽药物组合物(亦称分化诱导剂)是从新鲜人尿中纯化出来的，能引导异常甲基复合酶转变成正常甲基复合酶。注射用尿多酸肽药物组合物为本公司样品。
血癌细胞的生长曲线在有、无注射用尿多酸肽药物组合物的存在下在实验时构造出来。总细胞数是以血细胞计数器计算。细胞生存力决定于染色细胞用0．25％胎盼兰染色计数，不被染色的细胞的部份当做残存的部份。细胞形态用显微镜观察。分化情况的评定是经过观察生长能力的消失而没有失去细胞的生存力和细胞形态的改变。
细胞提取制造CHAPS细胞分解缓冲液的原料溶液[10mM Tris-盐酸(pH 7．5)，1mM氯化镁，1mM EGT，0．5％CHAPS，10％甘油(v／v)]贮藏于4℃温度中。使用前加入phenylmethanesulphonyl floride(PMSF)和巯基乙醇，使最后浓度分别为0．1和5mM。细胞的提取是将细胞悬浮于CHAPS缓冲液中，细胞数为2×103cells／ml，置于冰中培养30分钟，然后以14，000g在4℃离心30分钟，上清液移入试管用作端粒酶活性测试。蛋白质浓度用Commassie蛋白质测试剂测定(Pierce)。
端粒酶的测试端粒酶活性的定量是用PCR方法将端粒单位扩增复制(TRAP)(Kim et al．1994)。TS引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)和CX引物(5′-[CCCTAA]3 CCCTAA-3′)是用长庚仪器中心的DNA合成仪器(Model 380B，Applied Biosystems)合成。TS引物的5′-终端用T4多核苷酸激酶以[γ-32P]ATP标志。TRAP的定量，首先让端粒酶来延伸TS引物，与0．1μgTS引物，500nCi放射性元素标志的2．5mM dNTPs，20mM Tris-盐酸(pH8．2)，1．5mM氯化镁，63mM氯化钾，0．005％ Tween-20，1mM EGTA，0．1mg／ml BSA，以及2单位的Tag DNA合成酶。在反应液里也加入0．5μg的RNase A。端粒酶延伸反应后，加入0．1μg的CX引物来进行PCR扩增，总共30周期在94℃30秒，55℃30秒，然后72℃1．5分钟。PCR产物用胶电泳用54mM硼酸，1．2mM EDTA分离，DNA带型用自体放射照片和SyBr染色显示出来。染色照片在254nm紫外光照射下拍照。至于端粒酶活性的定量，TRAP产物的自体放射照片用ImageQuaNTm(Molecular Dynamics)作电脑密度扫描。每一处理过的样本除去缓冲液底值后与没有处理的样本比较相对密度。
试验结果1．注射用尿多酸肽药物组合物诱导分化后对血癌细胞繁殖的抑制图50．表示血癌细胞成长于无注射用尿多酸肽药物组合物和用两种注射用尿多酸肽药物组合物剂量使用6天的血癌细胞的生长曲线。在剂量2mg／ml时，细胞对注射用尿多酸肽药物组合物显示有毒性的反应，因为有生存力的细胞迅速地降低到1×104cell／culture的水平下。到第4天和第6天细胞数更降低到少于开始细胞数的一个对数的水平(图51)。在1mg／ml时到第4天和第5天，与对照组相比显示细胞大约减少90％。
2．注射用尿多酸肽药物组合物分化诱导后血癌细胞端粒酶的活性状态过去曾显示细胞抽取物可能因含有某些未知的因素而能减少TRAP的定量值(Bnoccoli etal．1995)。为了正确的定量我们用不同的细胞液浓度(0．01到3μg)以获得酶活性的直线幅度。图52显示血癌细胞在对照和两个注射用尿多酸肽药物组合物剂量存在下的相关的端粒酶活性。用1mg／ml浓度的注射用尿多酸肽药物组合物时，很清楚的可以看到端粒酶的密度减少，PCR产物的复杂性与密度随培养时间递减(图52C、D、E)。当血癌细胞用2mg／ml的注射用尿多酸肽药物组合物培养时，生存了2天和4天的血癌细胞的端粒酶活性两者都减到几乎不能察觉的程度(图532F、G)。当我们对血癌细胞在没有注射用尿多酸肽药物组合物存在的同样的溶液中生存了2天，4天和6天的细胞进行测试发现与在第4天和第6天收成的血癌细胞的端粒酶活性类似(没有提示资料)。这与血癌细胞在2天收成如图52第二行(B)所示的没有什么基本的不同。PCR产品的自体放射照片在生长于无注射用尿多酸肽药物组合物(第2天，B行)或注射用尿多酸肽药物组合物浓度在1mg／ml时(第2天，C行；第4天，D行；第6天，E行)的血癌细胞(HL-60cells)体外抽取物。同时以注射用尿多酸肽药物组合物浓度在2mg／ml时进行相似的测试(第2天，F行；第4天，G行)。A行，阳性对照(结果取自无细胞抽取物的端粒酶测试)。血癌细胞(HL-60cells)在第4天和第6天收成的端粒酶活性显示与第2天B行(没有显示)的照片外形基本上完全相同。
上述用自体放射照片定量PCR产物的结果如用密度器定量时可以更清楚表示端粒酶活性的消失，在1mg／ml的注射用尿多酸肽药物组合物，端粒酶的活性随培养时间递减(图53上半部)。另一方面，在第2天和第4天收成的细胞的端粒酶的活性显示有剧烈减低到不能察觉的程度(图53下半部)。结果列于图中的曲线表示相关密度的百分率(％)。设每第2，4或6天的无受试物的对照的密度为100％。密度的值数是从图3试验的自体放射照片以密度器测读软片而转换获得。每一受试例子的活性是以受试例子的端粒酶活性除无受试对照×100％。
讨论一个连续重复5’TTAGGG3’顺序是发生在真核染色体两端的端粒(Harley，1991；Blackburn，1992；de Lange，1994；Morin，1995；Kiplin，1995；Rhyu，1995)。端粒假定的功能包括下列几项(i)保护染色体末端以防止外切核酸酶和连接酶的作用；(ii)防止DNA损害调查点的活性；(iii)补偿DNA在每一次复制时末端的损失(Hartey 1992；Blackburn，1992；de Lange，1994；Kipling，1995)。端粒的六核苷酸是由核糖核酸核蛋白这种端粒酶促成的(Blackburn，1992)。有不少文献报告端粒酶的作用涉及细胞的老化和癌细胞的永恒分裂活性(Rhyu，1995)。人类细胞端粒酶的活性在胎儿和成人的睾丸和卵巢的卵泡可以测出(Kim et al．1994)。但是端粒酶的活性在大部分的人体细胞组织测不出来(Counter et al．1995；Kim et al．1994)。相对的端粒酶的活性在大部分的肿瘤和永恒的培养细胞里是能被察觉的(Kim et al．1995；Taharaet al，1995；Chadeneau et al．1995；Hiyama et al．1995)。
本研究里，我们证明了注射用尿多酸肽药物组合物是一种有效的分化诱导制剂，它可以抑制血癌细胞中端粒酶的活性。将这些细胞暴露于注射用尿多酸肽药物组合物时产生抑制作用(图50)。基于DNA分析血球记数流量的试验，这些被分化的细胞显示停留在细胞周期的G1阶段(资料没有显示)。同时也显示使用1或2mg／ml注射用尿多酸肽药物组合物时端粒酶活性的抑制与时间的长久有密切的关系，端粒酶活性的抑制很可能是因为分化的诱导而不是单纯的抗生长的效果。
因为人类端粒酶活性与癌的特殊关联，这个酶成为很好的医疗靶。对癌细胞里的端粒酶的特殊抑制或向下调节就可能限制这些细胞分裂次数，终于达到抑制肿瘤的生长。到目前为止关于体内端粒酶活性的调节知道的不多。端粒酶活性的减低细胞变成静止状态曾有过此类的报导(Holt et al．1996)。除此之外，对于几种癌细胞株以细胞分化诱导向下调节端粒酶的活性最近有一些报导。这些结果可从细胞从早幼粒白血病细胞(Shanna et al．1995；Albanell et al．1996)，红白血病(Sharma et al．1995)，骨髓细胞的血癌细胞(Zhang et al．1996)，胚胎癌(Albanellet al．，1996；Kurk et al．1996)，神经胶质瘤和黑瘤(Cheng et al．1997)等的细胞取得。然而两种小鼠细胞株和两种人的肿瘤，神经胶质瘤和黑瘤用分化诱导的方法并没有失去端粒酶活性(Cheng et al．1997)。这可能与所用以研究的癌细胞的种类不同有关。
端粒酶活性在Xenopus模型(Mantell和Greider，1994)的细胞周期抽取物的S和M阶段显示很活跃，这提示端粒酶活性并不是被染色体的DNA复制所调节。因此，一次细胞周期的停止也许不能足够抑制端粒酶的活性。另一方面，不是所有分裂的细胞需要端粒酶的活性。这种可能可以部份的解释为什么有一些分化的细胞保留繁殖的能力，而且是在没有端粒酶活性下进行分裂；同时为什么如上面所述在各种体外恶性肿瘤分化诱导结果对端粒酶活性有不同的抑制。前者显明的例子有分化的纤维细胞、淋巴细胞、良性的肿瘤和某种血癌如ALL和CML(Morin，1995；Kim et al．1994；Tahara et al．1995)。
总而言之，我们研究的结果发现注射用尿多酸肽药物组合物对血癌细胞经过细胞分化的诱导有抗肿瘤的疗效，附随的有抑制端粒酶活性的效果。端粒酶活性的抑制与剂量和时间有非常密切的关系。我们初步研究的结果显示两种人的黑瘤细胞株以0．5-4mg／ml的注射用尿多酸肽药物组合物剂量处理7天结果并没有抑制端粒酶的活性。从造血原始干细胞获得的癌细胞对分化诱导有反应而向下调节他们的端粒酶活性是很可能的，而从再回复突变得来的实体肿瘤细胞可能对端粒酶活性的分化调节没有反应。不同种类的癌细胞的端粒酶活性对分化抑制的敏感性不同，有些癌细胞可能对“分化疗法”有反应而其他的癌细胞就没有反应。然而有一点应当记住，即使对注射用尿多酸肽药物组合物治疗没有反应的肿瘤细胞，若与其它疗法如放射疗法合用时，与单独接受放射疗法相比较，发现更容易把癌细胞杀死，因此在使用注射用尿多酸肽药物组合物以前，应当取样少量癌组织鉴定其是否含有端粒酶，以确定其是否适用注射用尿多酸肽药物组合物治疗。
试验结论通过离体试验证明注射用尿多酸肽药物组合物能抑制人骨髓血癌细胞(HL-60)的生长；并能抑制该细胞中端粒酶的活性，提示注射用尿多酸肽药物组合物可能是一种细胞分化剂。
实施例十五．注射用尿多酸肽药物组合物离体和在体对人肝癌Smmu的药效研究受试药物注射用尿多酸肽药物组合物由本公司生产提供。批号970810。玻璃瓶胶塞铝盖无菌封装，每瓶100ml。固形物含量200mg／ml。外观呈深棕色澄明液。无沉淀和絮状物现象，流动性良好，振荡不起泡沫。避光室温保存。试验前直接或以无牛血清的DMEM适当稀释备用。
动物裸鼠雌雄各半，体重18-20g，中国药品生物制品检定所动物繁育场提供。健康，预饲养7日。
饲养管理条件按SPF动物要求管理饲养。群养，每笼5只，室内温度、湿度、光照和通风控制合乎标准。自由摄食充足供水。实验前观察1周并记录相应情况。
肿瘤细胞株人肝癌Smmu7721细胞，由中国药品生物制品检定所生化药物与基因工程药物室传代培养。
试剂和器材试剂培养基DMEM(Sigma)液加入10％小牛血清，青、链霉素各100单位／ml，pH调至7．2-7．4。
MTT Sigma产，以DMEM液配制成0．4mg／ml的溶液。
二甲基亚砜北京化工厂，分析纯。
环磷酰胺(CTX)200mg／支，上海华联制药有限公司。
仪器培养箱二氧化碳培养箱(Forma Scientific333型)酶标仪ETERTECH∑960型检测项目、方法及试验结果1．离体抗肿瘤试验1．1试验方法及步骤MTT法测定供试品对癌细胞的抑制作用。取对数生长期的癌细胞，用Versens消化液将细胞消化，悬浮于培养基中，将细胞浓度调至1．0×105个／ml，铺96孔细胞培养板，100μl／孔，加供试品100μl／孔，每浓度4孔，设空白对照及正常细胞对照孔，培养板置37℃5％二氧化碳培养箱中，培养72小时，弃去上清液，加入MTT液100μl／孔，置37℃5％二氧化碳培养箱中4小时，弃去上清液，加入二甲基亚砜100μl／孔，置振荡器上振荡，至颗粒溶解为止，用酶标仪测定OD值，波长550nm，回归计算IC50，即50％细胞存活浓度。OD值为4孔平均值。
1．2试验结果试验结果见表17。对照组OD值为1．131，细胞存活率定为100％。
细胞存活率=注射用尿多酸肽药物组合物各剂量组的OD均值／对照组OD均值×100％可见随着注射用尿多酸肽药物组合物浓度增加OD及细胞存活率明显减小，有密切的剂量依赖关系。
由表1数据求出注射用尿多酸肽药物组合物的IC50等于0．78±0．41(x±s-)表17不同浓度注射用尿多酸肽药物组合物离体对人肝癌Smmu7721细胞的作用
1．3结论注射用尿多酸肽药物组合物对体外人肝癌细胞的半数抑制浓度IC50在0．72-0．83mg／ml的范围内。
2．在体抗肿瘤试验2．1试验方法及步骤分组共5个组；注射用尿多酸肽药物组合物3个剂量组；阳性对照为CTX；阴性对照为生理盐水。
接种肝癌细胞悬浮液1-2×107个／鼠，背部皮下接种。接种一周后选择接种上肿瘤的裸鼠(肉眼可见小米粒大小)，随机均为分组，每组4-6只。
给药剂量供试品以生理盐水稀释成200、100、50mg／ml，腹腔注射0．2ml／只／次，即400、200、100mg／kg体重，每天1次，连续10天。
给药途径按《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》临床用药静脉给药者可用腹腔注射代替，故本实验采用腹腔注射。
2．2试验结果表18各组各批次裸鼠体内抗肿瘤试验结果
*P＜0．05，**P＜0．01连续给药10天，停药24小时后处死动物，解剖剥离瘤块，称瘤重，计算抑瘤率及与空白对照作t-测验，P＜0．05时表示差异有显著性意义。4次试验结果见表18。
计算公式抑瘤％=100×(C-T)／C式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。
5个组的瘤的外观大小见附图54-58。
2．3结论注射用尿多酸肽药物组合物剂量为100-400mg／kg裸鼠体重时，对裸鼠接种人肝癌细胞株的抑瘤率在51．8-83．5％，具有一定的抑制肿瘤生长的作用。实施例十二注射用尿多酸肽药物组合物离体对肺癌细胞，在体对腹水性肝癌、肝癌实体瘤以及肺癌实体瘤的影响受试药物注射用尿多酸肽药物组合物本公司生产提供。共3个批号960601，960606，960608。玻璃瓶胶塞铝盖无菌封装，每瓶100mL。固形物含量40mg／mL。外观呈深棕色澄明液。无沉淀和絮状物现象，流动性良好，振荡不起泡沫。避光室温保存。
试验前直接或以生理盐水适当稀释应用。
动物小鼠为昆明种封闭群，体重18-22g，皆为雌性，由中国医科大学实验动物部(辽宁省实验动物管理委员会认可并颁发合格证书单位，沈阳110001)提供，合格证号辽实动字第521号。健康，预饲养7日。
C57／BL纯系黑鼠体重18-21g，皆为雌性，由中国医科大学实验动物部提供，合格证号辽实动字第532号。健康，预饲养7日。
饲养管理条件群养，每笼5只，室内温度、湿度、光照和通风自然，冬季有暖气，必要时开通风扇。饲料为沈阳市实验动物饲料厂提供的实验动物鼠全价颗粒饲料，标准代号DB21-741-93，自由摄食充足供水。实验前观察1周并记录相应情况。
4．肿瘤细胞株(1)人肺癌细胞株AGZY-83A，引自鞍山市肿瘤研究所。用于离体试验。
(2)肝癌细胞株HCP，中科院上海药物研究所药理研究室提供。液氮保存。用于小鼠腹水瘤及实体瘤模型。
(3)鼠肺癌细胞株Lewis肺癌，中科院上海医药工业研究院药物所提供。用C57／BL鼠进行实体瘤造型。
试剂和器材RPMI培养粉 美国JR Scientific Inc生产。
小牛血清天津系列化制品所生产。
丝裂霉素日本Kyowa Hakko Kogyo有限公司生产，批号098AFC。
24孔培养板美国Corning(New York)产品。
检测项目、方法及试验结果1．离体抗肿瘤作用1．1试验方法(1)试验分组、浓度及给药方案设计分为以下7组阴性(模拟处理)对照组加RPMI／1640培养液；低浓度组加受试药物(0．157mg／mL)；中浓度组加受试药物(0．313mg／mL)；高浓度组加受试药物(0．625mg／mL)；超高浓度组(2组)加受试药物(1．25或2．5mg／mL)；阳性对照组加丝裂霉素(0．01mg／mL)。
每组设3个重复孔。
(2)方法及步骤先将AGZY-83A细胞复苏培养，待细胞生长旺盛时，将细胞制成为1×104个／mL的浓度，向24孔板内每孔加1mL，再按上述分组加入等容相应药液，置37℃5％CO2培养箱内，每隔24小时用0．4％台盼兰染色计数死、活细胞数，连续计测7天。
(3)计算公式细胞生长抑制率(％)=(1-各组活细胞数／阴性对照组活细胞数)×1001．2试验结果试验结果列于表19，可知受试药物在一定浓度时对癌细胞有一定的抑制作用，且有量-效关系。但浓度较高浓度组再大时(1．25或2．5mg／mL)抑制作用并不再增加，因而测不到具体的IC50值。
表19各组对人肺癌细胞的抑制率(％，第7天3个孔均值)
阳性对照组 丝裂霉素阴性对照、高浓度及阳性对照组的生长曲线如图3所示。
1．3试验结论由以上结果可知离体试验中受试药物对人肺癌细胞的生长有抑制作用，且呈现量-效关系。但作用强度和性质与丝裂霉素不同，后者使细胞迅速死亡，不再生长。这说明受试药物不是典型的细胞毒剂。
2．在体延长腹水型肝癌动物生存期作用的试验2．1试验方法(1)肿瘤造型将液氮保存的肝癌细胞复苏后，接种于小鼠腹腔内使形成腹水。抽出腹水收取癌细胞，用生理盐水稀释使癌细胞密度为2×106个／mL。取75只小鼠，每只小鼠腹腔接种0．2mL(4×105个癌细胞)，随机分组，24小时后开始试验。
(2)试验分组、剂量及给药方案设计分为以下5组(每组15只小鼠)。受试药物高剂量为1250mg／kg，相当人临床用量(167mg／kg)的7．5倍。丝裂霉素剂量为1mg／kg，亦相当人临床用量的8倍左右。
阴性(模拟处理)对照组iv生理盐水；低剂量组iv受试药物(6．25mg／20g)；中剂量组iv受试药物(12．5mg／20g)；高剂量组iv受试药物(25．0mg／20g)；阳性对照组iv丝裂霉素(0．02mg／20g)。
药物以生理盐水稀释(高剂量组不稀释)，每只小鼠经尾静脉iv盐水或药液0．5mL／20g，每天一次，连续14天。
(3)方法及步骤各组连续给药14天后停止iv，但继续饲养观察动物一般状况，记录各组各动物的死亡时间及死时体重。
(4)计算公式生命延长率(％)=100×(T-C)／CT……各组的半均生存天数C……阴性对照组的平均生存天数2．2结果如上试验先后共进行了两批，结果合并列于表20。除表内数据外还重点观察了动物的一般状态(食欲、精神状态、活动、皮毛)。丝裂霉素组动物，皆有食欲不佳、精神不振、萎蘼、活动少、皮毛无光和瘦小；而受试物组与阴性对照组则无此情况。
表20各组动物死时体重、生存天数及生命延长率的均值
结果表明受试药物较之丝裂霉素能改善动物生活质量，动物体重不减少；在一定剂量时能延长动物生存期，有量效关系，虽然未达＞30％的疗效标准，但延长率可达24％左右。
3．在体对抗动物肝癌实体瘤作用的试验31试验方法(1)肿瘤造型将液氮冻存的HCP肝癌细胞株复苏后，接种于小鼠前臂皮下，形成肿瘤后，取出肿瘤，制备癌细胞悬液。取50只小鼠，每只小鼠按3×105个癌细胞接种于小鼠前臂皮下。随机分为5组，每组10只。称体重，24小时后开始试验。
(2)试验分组、剂量及给药方案设计分为以下5组(每组10只小鼠)阴性(模拟处理)对照组iv生理盐水；低剂量组iv受试药物(5．0mg／20g)；中剂量组iv受试药物(10．0mg／20g)；高剂量组iv受试药物(20．0mg／20g)；阳性对照组iv丝裂霉素(0．03mg／20g)。
药物以生理盐水稀释(高剂量组不稀释)，每只小鼠经尾静脉iv盐水或药液0．5mL／20g，每天一次，连续14天。
(3)方法及步骤各组连续给药14天后，用乙醚处死小鼠，称体重，剥离出肿瘤并称瘤重。肉眼观察后取主要脏器与瘤一并放入中性福尔马林中固定。
(4)计算公式肿瘤抑制率(％)=(1-T／C)100T……各组的平均瘤重C……阴性对照组的平均瘤重3．2结果如上试验先后共进行了三批，结果合并列于表20。除表内数据外还重点观察了动物的一般状态(食欲、精神状态、活动、皮毛)。丝裂霉素组动物，皆有食欲不佳、精神不振、萎蘼、活动少、皮毛无光和瘦小；而受试物组与阴性对照组则无此情况，且受试物组动物状态还好于阴性对照组。试验过程中各组动物均有死亡。
表21各组动物存活数、瘤重及抑制率的均值(x±s)
** P＜0．01，*P＜0．05结果表明受试药物在3种剂量时都能抑制肿瘤的生长，有量效关系，抑制率平均可达29％左右，高剂量组可达34．5％，与阴性对照相比差异在统计学上有尚显著的意义(P＜0．05)。受试药物能改善动物生活质量，而丝裂霉素虽有明显抑瘤效果但使动物生活质量明显恶化。
4．在体对抗动物肺癌实体瘤作用的试验41试验方法(1)肿瘤造型将两只已皮下荷Lewis肺癌株的C57黑鼠处死，75％乙醇消毒皮肤，切皮取出瘤块，剪碎研磨后，过200目网、离心，用生理盐水调细胞浓度为1×106个／mL，共28mL。取70只C57／BL纯系黑鼠，每只皮下注射0．25mL。按体重组间一致原则分为5组，每组10只。24小时后开始试验。
(2)试验分组、剂量及给药方案设计分为以下5组(每组10只小鼠)阴性(模拟处理)对照组ip生理盐水；低剂量组ip受试药物(5．0mg／20g)；中剂量组ip受试药物(10．0mg／20g)；高剂量组ip受试药物(20．0mg／20g)；阳性对照组ip丝裂霉素(0．025mg／20g)。
药物以生理盐水稀释，每只小鼠ip盐水或药液0．5mL／20g，每天一次，连续10天。
(3)方法及步骤各组连续给药10天后，颈椎脱臼处死小鼠，称体重，剥离出肿瘤并称瘤重。肉眼观察后取主要脏器与瘤一并放入中性福尔马林中固定。
(4)计算公式肿瘤抑制率(％)=(1-T／C)×100T……各组的平均瘤重C……阴性对照组的平均瘤重4．2结果如上试验先后共进行了三批，结果合并列于表22。除表内数据外还重点观察了动物的一般状态(食欲、精神状态、活动、皮毛)。丝裂霉素组动物，皆有食欲不佳、精神不振、萎蘼、活动少、皮毛无光泽和瘦小；而受试物组与阴性对照组则无此情况，动物进食饮水和活动状态良好，皮毛顺滑有光泽。试验过程中各组动物均有死亡。
表22各组动物存活数、瘤重及抑制率的均值(x±s)
**P＜0．01结果表明受试药物在3种剂量时都能抑制肿瘤的生长，有量效关系，中高剂量组抑制率平均可达20％左右。受试药物能改善动物生活质量，而丝裂霉素虽有明显抑瘤效果(P＜0．01)但使动物生活质量明显恶化，约1／3动物在试验终止日期前死亡。
试验总结4项试验的结果证明了注射用尿多酸肽药物组合物有一定程度的抗肿瘤药效。①离体抗肿瘤作用试验表明受试药物对人肺癌细胞的生长有抑制作用，且呈现量效关系。②在体延长腹水型肝癌动物生存期作用的试验受试药物能改善动物生活质量，在一定剂量时能延长动物生存期(延长率24％左右)。③在体对抗动物肝癌实体瘤作用的试验受试药物能改善动物生活质量，在3种剂量时都能抑制肿瘤生长，抑制率平均可达29％左右，高剂量组可达34．5％(P＜0．05)；而丝裂霉素虽有明显抑瘤效果(P＜0．01)但使动物生活质量明显恶化。④在体对抗动物肺癌实体瘤作用的试验受试药物能改善动物生活质量，3种剂量都能抑制肿瘤的生长，有量效关系，中高剂量组抑制率平均可达20％左右；而丝裂霉素虽有明显抑瘤效果(P＜0．01)但使动物生活质量明显恶化，约1／3动物在试验终止日期前死亡。故认为受试药物有一定的抗肿瘤效果，且作用性质与丝裂霉素不同，前者改善而后者恶化动物生活质量。
实施例十六．尿多酸肽药物组合物防治裸鼠肝癌转移复发的疗效观察肝癌的转移复发是目前影响肝癌疗效的主要因素之一。即使是小肝癌早期根治性切除后，五年复发率也高达43．5％[1]。本实验在裸鼠肝癌转移发生前后行肝癌切除术，术后采用尿多酸肽药物组合物皮下注射，观察在体试验其是否有防治裸鼠肝癌转移复发的疗效。
受试药物尿多酸肽药物组合物由本公司生产提供，批号970508。玻璃瓶胶塞铝盖无菌封装，每瓶100ml。固形物含量40mg／ml。外观呈深棕色澄明液。无沉淀和絮状物现象，流动性良好，振荡不起泡沫，避光室温保存。试验前直接或以生理盐水适当稀释应用。
动物裸鼠为BALB／CA品系，雄性，上海药物研究所提供。鼠龄4-6周，体重17-20g。共13只。健康，预饲养7日。
饲养管理条件按SPF动物要求管理饲养。群养，每笼5只，室内温度、湿度、光照和通风控制合乎标准。自由摄食充足供水。实验前观察1周并记录相应情况。
肿瘤细胞株瘤源为上海医科大学中山医院肝癌研究所LCI-D20□裸鼠肝癌高转移模型，断颈处死动物，开腹取肿瘤组织，将其切成0．2×0．2×2cm3大小，置于4℃的生理盐水中备用。
试验方法动物模型的制作裸鼠用1％戊巴比妥钠40-50ng／kg腹腔注射麻醉；左上腹横切口约1cm，将肝脏暴露于切口处，切开肝包膜0．3cm，将瘤块植于肝内，8-0无损伤外科缝线缝合肝包膜固定瘤块，将肝脏轻轻送回腹腔，关腹。麻醉清醒后送回笼内饲养，术后自由进食。
本模型动物于种植后第19天发生转移。实验动物随机分二组，早期癌组于接种后16天行肝癌切除术，晚期肝癌组于接种后22天行肝癌切除术。以上述同样方法麻醉动物后，取右上腹横切口，长约1cm，将肝脏暴露于切口下，仔细观察肝内种植瘤生长的范围，在距肿瘤边缘约0．2cm处绞锁缝合正常肝组织，局部切除肝癌组织。检查局部无肝癌组织残留后，按压片刻，无活动出血后关腹。皮下注射生理盐水1ml，麻醉清醒后送回笼内饲养，自由进食。
药物用量与注射方案为增强疗效同时合用钙离子和Vit C。混合溶液配制；尿多酸肽药物组合物注射液1ml(40mg)+10％葡萄酸钙0．1ml+Vit C 0．5ml(250mg)。药量为每只动物每天皮下注射1．6ml。早期肝癌组在接种后16-24天连续皮下注射共9天，晚期肝癌组接种后23-31天连续皮下注射共9天。对照组注射等容的生理盐水。
观察指标于接种后35天，裸鼠称重后以摘眼球放血的办法处死动物，取双肺称重后，放于10％福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，每个蜡块间隔50μm切取5μm厚切片一张，连续10张，双侧肺共20张，记录转移灶的数目。完整取出肝组织，记录肉眼肝内转移灶数目、分布及切缘复发情况。切缘复发灶大小按(肿瘤最大径+与其垂直的肿瘤直径)÷2计算，观察记录转移累及脏器的数目。
试验结果1．裸鼠体重改变早期肝癌切除对照组平均体重为24．3±2．1g，尿多酸肽药物组合物组为25．8±1．9g，虽然尿多酸肽药物组合物组稍高，但经过计量资料t-检验统计学处理，差异无显著性(P＞0．05)。
晚期肝癌切除对照组平均体重为21．3±1．8g，尿多酸肽药物组合物组为25．1±2．0g。经统计学分析，尿多酸肽药物组合物组比对照组体重增高差异有显著性(P＜0．05)。
2．肝内局部转移复发情况表23不同治疗组肝癌内转移复发情况(x±s)
*与相应对照组比较P＜0．05，**与相应对照组比较P＜0．01正常裸鼠肝脏为7个叶，早期肝癌切除对照组5只动物均出现肝内转移灶，转移灶数目7．2个，累及叶数为3．7个。尿多酸肽药物组合物组5只动物有3只发生转移，转移灶数目2．6个，累及叶数1．8个。晚期肝癌切除对照组5只动物均出现肝内转移灶，最多为22个，所有7个叶均受累；最少肝内转移灶1个，但较大同时累及3个叶；平均转移灶数目8．6个，累及叶数4．6个。尿多酸肽药物组合物组5只动物只有3只发生肝内转移，转移灶数目1．0个，累及叶数1．2个。因本组数据离散度较大，未做统计学分析，但从以上数据可看出，尿多酸肽药物组合物组早期和晚期裸鼠肝癌切除后的肝内转移均较对照组轻。(见表23)肝湿重早期切除二组无差别(P＞0．05)，晚期切除尿多酸肽药物组合物组明显减轻。
早、晚期切除切缘局部复发尿多酸肽药物组合物组肿瘤直径均较对照组小，但与对照组比较早期切除时在统计学上差异有显著性(P＜0．01)．晚期切除时二组比较差异无显著性(P＞0．05)。
3．肺远处血行转移情况表24不同治疗组肝癌肺内转移情况(x±s)
*与相应对照组相比P＜0．05双肺共连续切片20张，在光镜下计数转移灶发生的数目之和。2个对照组5只动物均见肺转移灶，早期肝癌切除尿多酸肽药物组合物组无肺转移发生，晚期肝癌切除只有3只动物有转移灶，相应的二组比较统计学上均有显著性．肺湿重治疗与否均无差别。
4．转移灶发生部位肺瘤接种后35天观察，除上述肝原位转移灶和肺远处转移灶外，尚可见切口、肠系膜、生殖腺、肝门部、肾下极、脾门、膈肌、胰腺上缘转移，早、晚期肝癌切除后应用尿多酸肽药物组合物都可以抑制远处转移的程度。结果见表25。
表25不同组转移灶累及脏器(x±s)
*与相应对照组相比P＜0．05讨论与结论恶性肿瘤细胞无论在形态、功能和代谢上均类似于未分化的胚胎细胞，分化诱导剂可使肿瘤细胞的生物学和免疫学特性向正常细胞转化。目前已取得较好临床应用的是全反式视黄酸对早幼粒细胞白血病的治疗，85．4％的病人可获完全缓解。研究表现，细胞表面粘附分子在细胞未成熟期表达较高，随着细胞成熟表达下降。肝癌的高转移与细胞表面的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)高表达有关。
尿多酸肽药物组合物是一种细胞分化诱导剂，我们希望它能诱导细胞分化成熟，使肝癌切除术后残留的癌细胞或有癌变倾向的细胞逆转；也希望因此降低癌细胞表面粘附分子的表达，使其转移能力下降。
实验结果表明裸鼠肝癌转移发生后行局部肿瘤切除后应用尿多酸肽药物组合物，肝内转移发生减少，肝湿重降低，切缘局部复发肿瘤也较少，能有效抑制内转移和复发。反映远处转移的肺转移灶数目和转移累及的脏器的数目也减少，因此认为尿多酸肽药物组合物能降低裸鼠晚期肝癌的转移复发。裸鼠肝癌转移发生前行局部肝癌切除后行尿多酸肽药物组合物治疗，肝内转移灶和转移累及脏器数目也减少，无肺内转移发生，证明其对裸鼠早期肝癌切除术后的转移复发也有良好的防治效果。
实施例十七．注射用尿多酸肽药物组合物逆转肿瘤耐药的初步研究受试药物注射用尿多酸肽药物组合物由本公司生产提供。批号980508。玻璃瓶胶塞铝盖无菌封装，每瓶100ml。固形物含量40mg／ml。外观呈棕褐色半透明液。无沉淀和絮状物现象，流动性良好，振荡不起泡沫。避光室温保存。
试验前直接或以生理盐水适当稀释应用。
肿瘤细胞株人口腔磷状上皮癌细胞(KB)VCR耐用药株(KBV200)，由军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物学实验室保存。
人肺癌细胞(H23)，肺癌ADR、CDDP耐药株(H1435)由台湾馈赠。
试剂长春新碱(VCR)北京医科大学实验厂产生。
盐酸阿霉素(ADR)深圳万乐药业产品。
顺铂(DDP)齐鲁制药厂产品。
维拉帕米(Ver)江苏连云港制药厂产品。
噻唑兰(MTT)、异硫氰酸胍、RNasin、AMV逆转录酶均系Promega公司产品。
Taq DNA聚合酶宝生生物公司产品。
试验方法及结果1．试验方法细胞耐药逆转取对数生长期细胞，胰酶消化，调节细胞浓度3-5×104／ml，0．1ml／孔接种于96孔细胞培养板，培养1d，实验组分别加注射用尿多酸肽药物组合物0．4、0．8、1．2mg／ml。实验对照组加Ver 6μg／ml。单独作用组加抗癌药。平行3孔。继续培养3d，弃去培养液，每孔加0．4mg／ml的MTT200μl，培养4h，弃去MTT，每孔加DMSO 150μl，待溶解后，于Anthos2010酶标仪，在570nm处测光吸收值。实验对照组以单加Ver为对照孔，实验组以单加注射用尿多酸肽药物组合物为对照孔，求出半数抑制浓度IC50。
引物设计MDR1基因引物取自其cDNA序列5′(2596～2615bp)；(2733～2725bp)；扩增片段167bp。MRP基因引物取自其cDNA序列5′(4670～4691bp)；3′(4988～500bp)；扩增片断336bp。GST-π基因引物取自其cDNA序列5′(863～882bp)；3′(1192～1213bp)；扩增片段350bp。β-肌动蛋白(β-actin)基因引物取自其cDNA序列5′(346～367bp)；3′(558～580bp)；扩增片断234bp。上述各引物均为上海医科大学肝病研究所设计，上海生工公司合成。
细胞总RNA提取接种细胞3-5×105／瓶，贴壁培养48小时，至细胞生长对数期，实验组给以注射用尿多酸肽药物组合物至终浓度2mg／ml、4mg／ml。与对照组共同培养48小时后，胰酶消化，PBS洗涤离心后，采用异硫氰酸胍、酚-氯仿一步法提取细胞总RNA。
逆转录-PCR方法取细胞总数RNA 1μg，5×RT缓冲液4μl，10μg／ml oligo(dT)，0．5mmol／LdNTP Mix，65预变性5min，冰浴3min，加RNasin 10u，AMV逆转录酶10u，42反应60min，合成cDNA第一条链。在2μl上述cDNA产物加入10×PCR缓冲液2μl、MDRl、MRP、GST-π、β-actin引物各10pmol／L、Tap DNA聚合酶1u，(总体系统20μl)进行PCR扩增。循环参数为95变性40s，55退火40s，72延伸1min，30个循环，72补平10min。
PCR产物定量分析取扩增产物10μl，行2％琼脂糖电泳，溴化乙锭染色。Kodak DigitalScience凝胶成像系统照相，1D软件定量分析各条带的含量，计算MDR1、MRP、GST-π与β-actin的化值。
2．试验结果2．1注射用尿多酸肽药物组合物注射液对肿瘤敏感和耐药细胞的抑制作用结果列于表26。可知注射用尿多酸肽药物组合物，对KB和KBV200以及H23和H1435的敏感和耐药两类肿瘤细胞株，在抑制作用的敏感性上均无明显差异。
表26注射用尿多酸肽药物组合物对各类肿瘤细胞抑制作用的敏感性
2．2注射用尿多酸肽药物组合物协同化疗药对耐药逆转作用的影响实验中我们以钙通道阻滞剂维拉帕米(Ver)，作为有效对照组。结果列于表27。可知非毒性浓度6μg／ml的Ver与VCR联合应用，能有效降低KBV300细胞的IC50值，从4．38μmol／L降至0．083μmol／L，逆转耐药倍数为52倍。而0．4mg／ml的注射用尿多酸肽药物组合物与VCR协同作用，同样能增强VCR对KBV200耐药细胞的毒性，使耐受VCR的KBV300的细胞的IC50值从4．38μmol／L降至0．266μmol／L，逆转耐药倍数为16倍。与单独VCR作用组相比，P值＜0．01。0．8mg／ml和1．2mg／ml(IC20、IC30)的注射用尿多酸肽药物组合物能有效逆转KBV200对VCR的耐受，介逆转程度不如0．4mg／ml(IC50)剂量组。
表27注射用尿多酸肽药物组合物与VCR联用对KBV200耐药性的逆转作用
☆指IC50时所需VCR浓度，**P＜0．01*，与单独VCR组相比2．3注射用尿多酸肽药物组合物对MDR1、MRP、GST-π耐用药相关基因表达的影响2．3．1KB和KBV200细胞MDR1、MRP、GST-π基因表达4mg／ml的注射用尿多酸肽药物组合物作用KB细胞48h后，均诱导出MDR1、MRP、GST-π基因弱表达。KBV200细胞为基因高表达细胞株，随着注射用尿多酸肽药物组合物剂量的增加，MDR1基因的表达量有增加趋势，但差异较小。均未诱导出MRP和GST-π基因的表达。
2．3．2H23和H1435细胞MDR1、MRP、GST-π基因表达H23和H1435细胞在未给药前均有MRP和GST-π基因的表达，H23细胞H1435基因的表达经注射用尿多酸肽药物组合物诱导后而消失，对GST-π基因表达影响不大。给药前后未见MRP基因表达。H1435细胞MDR1和GST-π基因表达量均随注射用尿多酸肽药物组合物剂量增加而下降。未诱导出MRP基因的表达。
讨论及结论肿瘤多药耐药性的分子基础是多方面的。由于抗肿瘤药物的长期作用，并诱导细胞相关基因的表达和调控异常，从而引起与耐药相关的蛋白质在结构、功能及表达水平发生改变，导致耐药性。耐药产生的机制主要有(1)P-糖蛋白(P-gp)泵出理论，减少细胞内药物蓄积，与多耐药基因(MDR1)和多药耐药相关蛋白(MRP)过表达有关。(2)通过细胞内解毒系统，促进药物代谢或降低细胞内药物毒性，与谷胱苷肽S-转移酶(GSTs)表达水平有关。因此，MDR1、MRP、和GST-π在耐药中起着极其重要的作用。肿瘤多药耐药性逆转，近年研究较多的是针对P-gp通过增加药物在MDR细胞中的蓄积而增强化疗药物的细胞毒性作用。本实验是以具有抗肿瘤作用的注射用尿多酸肽药物组合物药物，在研究其逆转肿瘤多药耐药性。
我们以Ver为逆转有效对照组，平行观察注射用尿多酸肽药物组合物在耐药逆转达中的作用。草药初步结果表明，0．4mg／ml注射用尿多酸肽药物组合物能有效地增加VCR对KBV200耐药细胞的毒性，与VCR联合作用，使KBV200细胞的IC50值从4．38μmol／L降至0．26μmol／L，逆转耐药倍数为16倍。KBV200为耐药(MDR相关)细胞，其耐药机理主要是由于P-糖蛋白过表达导致药物外排的增多所致[1]。我们的实验结果表明，注射用尿多酸肽药物组合物并未引起耐药KBV200细胞中MDR1基因发生明显变化，也未诱导出MRP和GST-π基因表达。因此，仅从MDR1基因过表达的角度来解释肿瘤细胞MDR现象是片面的。我们的实验结果提示，注射用尿多酸肽药物组合物逆转MDR介导的多药耐药性可能不是依赖P-gp的功能，而是参与其它逆转耐药途径而发挥其作用。
我们的实验还观察到，注射用尿多酸肽药物组合物对逆转MDR耐药作用与所需药物浓度有密切关系，当药物浓度在IC50即0．4mg／ml时，逆转耐药作用最强，优于注射用尿多酸肽药物组合物的高剂量浓度。这种注射用尿多酸肽药物组合物剂量增加且逆转程度降低的现象，可能性是注射用尿多酸肽药物组合物与VCR药物的相互作用，抵消了VCR的有效浓度。
从耐药基因表达的实验结果表明，注射用尿多酸肽药物组合物对人肺癌细胞，无论是敏感H23和耐药H1435细胞中MDR1和GST-π基因的表达量随着注射用尿多酸肽药物组合物剂量增加而减弱或消失。均未诱导出MRP基因表达。这一结果提示，注射用尿多酸肽药物组合物对人肺癌H1435耐药也可有逆转肿瘤耐药的作用。
权利要求
1．一种尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于将新鲜尿酸化，使PH小于等于3，以保证其稳定并易于提取；过滤除去酸化尿中的大颗粒；超滤除去酸化尿中分子量较大的有机物质，用醇浸泡吸附剂后用乙醇和去离子水分别洗涤吸附剂，装吸附柱，以一定的流速将超滤后的酸化尿加入吸附柱内，用吸附剂吸附滤液中的有效成分；酸化尿中的无机盐离子和有机物在进入吸附剂后未被吸附的积存于柱内，用软水洗涤未被吸附但残留在吸附剂中的无机物及亲水性有机物，纯化有效成分；用醇洗脱吸附在吸附柱上的有效成分；收集有色流出液，除溶剂浓缩后，干燥得到尿多酸肽干品，加水溶解，用碱调整PH至中性，低温静置析出浓缩过程中形成的结晶、聚合物，过滤除去结晶及胶体等杂质，得到尿多酸肽药物组合物中间体，经除热源、除病毒等工艺进一步纯化。
2．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的酸化可以用盐酸、硫酸，酸化至PH小于3。
3．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于酸化至PH1．0-2．5。
4．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于优选酸化至PH1．2-1．8。
5．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用超滤的方法除去分子量大于1万的有机物质。
6．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用超滤的方法除去分子量大于9000的有机物质。
7．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用C18、XAD-6、XAD-7和XAD-16作为吸附剂吸附尿中的有效成分，优选C18和XAD-7。
8．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用软水洗涤去除酸化尿中的无机盐离子，以及在进入硅胶柱后未被吸附而积存于柱内的有机物，以纯化有效成分。
9．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用乙醇、甲醇洗脱吸附在硅胶柱上的有效成分，优选甲醇。
10．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用减压蒸馏或膜技术除溶剂浓缩收集的有效成分。
11．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用冷冻干燥或真空干燥的方法干燥产物，优选冷冻干燥。
12．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠调整产物的PH值，优选氢氧化钠。
13．根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于回收率为投料量体积比的0．2--4％左右。
14．尿多酸肽组合物在用于治疗癌症及防止癌症复。
全文摘要
本发明公开了尿多酸肽组合物的制备方法,将新鲜尿酸化,过滤除去酸化尿中的大颗粒;超滤除去酸化尿中分子量较大的有机物质,将超滤后的酸化尿加入吸附柱内,吸附其中的有效成分;用软水洗涤末被吸附剂吸附但残留在吸附剂中的无机物及亲水性有机物用醇洗脱吸附在吸附柱上的有效成分;收集有色流出液,浓缩后,干燥得到干品;加水溶解,用碱调整pH至中性,低温静置析出浓缩过程中形成的杂质,经除热源、除病毒等工艺进一步纯化。
文档编号A61K35/22GK1294000SQ99122050
公开日2001年5月9日 申请日期1999年10月26日 优先权日1999年10月26日
发明者张铭烈 申请人:合肥永生制药有限公司