专利名称：抗炎滴眼剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗以前列腺素为炎症介质的眼炎症疾病的治疗剂，更具体地说，涉及用于例如预防和治疗白内障手术后的前眼炎的滴眼剂。
背景技术：
非甾体抗炎剂例如那些含有双氯芬酸钠的抗炎剂，其抗炎作用原理是抑制炎症介质前列腺素的生物合成，这些抗炎剂不但通过口服给药用于治疗炎症疾病，而且可以通过局部用药治疗许多炎症。另外，这些抗炎剂还以局部给药的滴眼剂形式被广泛地用于治疗眼炎，特别是白内障手术后的前眼炎以及手术期间和手术后的并发症。
另一方面，这样的非甾体抗炎滴眼剂具有非常优秀的抗炎作用，但临床上指出副作用例如角膜上皮疾病的发生率约1.6％(参见若素制医药品附加文书，1996年)。换句话说，需要开发一种非甾体类抗炎滴眼剂，其不具有高发生率的角膜上皮疾病副作用。
最近的研究进展结果表明非甾体抗炎剂的作用部位是抑制两种酶，即环氧合酶-1(此后称“COX-1”)和环氧合酶-2(此后称“COX-2”)。已经认识到COX-1可以保护细胞，而COX-2是参与炎症的酶。因此，需要开发一种抗炎剂，所述抗炎剂能够选择性抑制COX-2，并引起细胞障碍的可能性低。从上述讨论的观点出发，已经详细研究了全身给药抗炎试剂具有胃溃疡的副作用。结果，已经完全阐明了COX-1和COX-2的作用，并且还证明COX-1的抑制也与胃溃疡的发展有关。
如上所述，虽已阐明了这些抗炎剂的胃溃疡作用机理，但对于角膜上皮疾病是否由同胃溃疡相同的作用机理引起仍然不清楚。因此需要开发一种药物，其能够对COX-1以及COX-2在角膜上皮疾病和眼炎症中的作用明显区分。Masferrer,JL等(Surv.Ophthalmo1.,1997,41(增刊2):S35-S40)报道用COX-2抑制剂可以抑制前眼炎，但该文完全没有公开有关角膜上皮疾病的内容。三宅(临床眼科医报1997,51(11):190-191)认为应用COX-2选择性抑制剂可以缓解角膜上皮疾病，但其丝毫没有公开关于解决该疾病的方式。
发明的公开本发明者在作为滴眼剂的非甾体抗炎药中应用了选择性抑制COX-2的药物，本发明者们研究了其对前眼炎症和眼细胞疾病的作用从而完成了本发明。
更具体地说，本发明涉及含有高COX-2选择性药物作为有效成分的抗炎滴眼剂。通过努力观察了具有COX-1和COX-2选择性的化合物对于体内抗炎作用和体外损害细胞能力的作用，本发明者们发现含有高COX-2选择性药物作为有效成分的抗炎滴眼剂在抗炎作用和缓解细胞损害作用方面是非常优秀的。因此，本发明的目的是提供一种抗炎剂，其能够缓解细胞例如角膜上皮细胞和结膜细胞的损害，还提供一种滴眼剂，其较少引起角膜上皮细胞的损伤。
附图的简要描述
图1显示依托度酸对由前房穿刺引起的高PGE2含量的作用。
图2显示依托度酸对由前房穿刺引起的高蛋白含量的作用。
发明的最佳实施方式本发明滴眼剂中所用的高COX-2选择性非甾体抗炎药的优选实例为依托度酸(1,8-二乙基-1,3,4,9-四氢吡喃并[3,4-b]吲哚-1-乙酸)、N-(2-(环己氧基)-4-硝基苯基)甲磺酰胺(NS-398)和美洛昔康(4-羟基-2-甲基-N-(5-甲基-2-噻唑基)-2H-1,2-苯并噻嗪-3-甲酰胺1,1-二氧化物)。
本发明的滴眼剂需要无菌的药物制剂，含有依托度酸或NS-398的制剂可以含有作为增溶剂的蓖麻油、芝麻油或其它表面活性剂，这些有效成分可以制成软膏剂。
美洛昔康还是一种具有高COX-2选择性的药物，其特征在于同前面的药相比，其具有高水溶性。因此，该药可以在水性滴眼剂中应用，并类似地可以制成软膏剂。
对于用于治疗炎症的这样的药物，在水性药物制剂中，美洛昔康的优选浓度为0.1-1％，在含有例如依托度酸或N-(2-(环己氧基)-4-硝基苯基)甲磺酰胺的油性药物制剂中，药物的优选浓度为0.5-5％。通过炎症模型试验验证了这些药物的效果。
关于损害细胞的可能性，任何具有COX-2选择性的药物均显示损害角膜上皮细胞和结膜细胞的低可能性。具体地说，当长时间接触药物时，非常明显这些药物几乎不引起角膜上皮细胞的损害。
如上所述，本发明首次提供了几乎不损害细胞例如角膜上皮细胞或结膜细胞的滴眼剂，具体地说，本发明首次提供含有选择性COX-2抑制剂的滴眼剂，其显示高的抗炎效果并且很少造成角膜上皮细胞的损伤。
以下列实施例和试验例更详细地描述本发明。实施例1依托度酸 5g对羟基苯甲酸丙酯 0.01g对羟基苯甲酸甲酯 0.05g蓖麻油至100ml把依脱度酸、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸甲酯加入到80ml蓖麻油中，使其溶解于蓖麻油后，再添加蓖麻油至总体积为100ml，该溶液经灭菌过滤后得到本发明的滴眼剂。实施例2N-(2-(环己氧基)-4-硝基苯基)甲磺酰胺5g对羟基苯甲酸丙酯0.01g对羟基苯甲酸甲酯0.05g蓖麻油 至100ml把N-(2-(环己氧基)-4-硝基苯基)甲磺酰胺、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸甲酯加入到80ml蓖麻油中，使其溶解于蓖麻油后，再添加蓖麻油至总体积为100ml，该溶液经过滤消毒后得到本发明的滴眼剂。实施例3美洛昔康0.5g吐温-80 0.5g甲基纤维素 0.5g硼酸0.1gEDTA0.005g苯扎氯铵0.005g0.1N HCl/0.1N NaOH (把pH调至7.2所需要的量)纯化水 至100ml把美洛昔康、吐温-80(聚山梨醇酯-80)、甲基纤维素、硼酸、EDTA和苯扎氯铵加入到80ml纯化水中，使这些组份溶解于水。加入0.1NHCl或0.1N NaOH把所得溶液的pH调至7.2，再把纯化水加入到该溶液中使其总体积为100ml。经灭菌过滤所得溶液，得到本发明的滴眼剂。
本发明滴眼剂的使用方法和用量可以根据例如患者的症状和年龄等而变化，但一般来说，该滴眼剂滴入到眼中的剂量为1-2滴，每日1-6次。试验例滴眼剂对白兔前房炎症的作用在该试验例中，应用体重1.8-2.4kg的日本白兔(日本医科学动物资材研究所)，将其分组，每组含动物6-7只。
通过耳静脉把250U/kg肝素(武田药品工业)给以白兔，然后把约60μl测试物质滴入双眼。把所述物质滴入双眼45分钟后，用Benoxil滴眼剂(参天制药)局部麻醉这些动物，然后用27G注射针管收集整个前房液。该前房液定义为初级眼房水，用过量戊巴比妥钠麻醉来处死这些白兔，再次收集眼房水。该前房液被称为次级眼房水。
测定在所收集的次级眼房水中的蛋白质含量和前列腺素E2(此后称“PGE2”)浓度，将其作为炎症指标。把100μl眼房水用Bond Elute C18柱预处理后，用Biotrack PGE2EIA系统(Amersham公司)测定PGE2的浓度。另外，按照Lowry方法，应用牛血清蛋白(来自NaKarai有限公司)作为参照蛋白，测定蛋白质含量。
把作为测试物质的依托度酸溶解于日本药典品蓖麻油中，使其浓度为0.5和5％。用生理盐水稀释美洛昔康后使用。
从图1和图2中所示的数据可以看出，在眼房水中，依托度酸抑制由前房穿刺引起的蛋白质含量和PGE2含量的升高。
另外，0.1-1.0％浓度范围的美洛昔康抑制蛋白质和PGE2含量的升高，同其它药相比，其抑制作用是显著的。表1经前房穿刺后，美洛昔康对蛋白质含量和PGE2含量升高的作用
表中的各值为11-12只眼的均值。*,**,***:P＜0.05,0.01,0,001:Dunnett检验试验例2药物对由LPS引发的眼色素层炎的影响在此试验例中，应用体重为1.7-2.4kg的日本雄性白兔组，其中各组由12-16只眼组成。
通过耳静脉以1.25μg/kg的剂量把由大肠杆菌E.coli得到的脂多糖(LPS)(0.55:B5型，Sigma公司)给以白兔引发眼色素层炎。给以LPS 4小时后，用过量戊巴比妥钠(东京化成)麻醉处死白兔，收集前房液。
按照实施例1同样的方法，测定所收集的眼房水中存在的PGE2浓度和蛋白质含量。
另外，是在给以LPS1小时前，以约60μL/眼的剂量把各个测试物质滴入这些动物的双眼。
把测试物质NS-398溶解或悬浮在日本药典品蓖麻油中，使其浓度为0.5％和5％，用生理盐水稀释美洛昔康后使用。
从下列表2中所示数据明显可以看出，NS-398明显抑制PGE2含量的升高。另外，从表3中所示数据可以明显看出，浓度范围0.1-1％的美洛昔康抑制PGE2含量和蛋白质含量的升高，因此，发现其有良好的抗炎作用。
表2:NS-398对由LPS引发的眼色素层炎的作用
表中的各值为12-16只眼的均值。#,##,###:P＜0.05,0.01,0,001:Dunnett检验表3美洛昔康对LPS引发的眼色素层炎的作用
表中的各值为12只眼的均值。**,***:P＜0.01,0.001:Dunnett检验试验例3环氧合酶抑制剂对角膜上皮细胞和结膜细胞的影响所用细胞角膜细胞为SV40永生人角膜上皮细胞株(Araki-Sasaki等，IOVS,1995,36:614-621)，结膜细胞为Chang人结膜细胞株(ATCC CCL-20.2)。
测试方法在96孔板上中把这些细胞培养至30-50％铺满，然后把用培养基逐步稀释的各个测试物质加入到前面的培养基中，在37℃下进行培养。培养完成后，用PBS(-)洗涤培养板，根据β-氨基己糖苷酶活性确定残余细胞数。毒性评价方法把仅仅用溶剂(用于溶解测试物质的溶剂)的处理组定义为阴性组，对照组所观测到的活细胞数定为100％，基于各浓度测试物质所观测到的活细胞数绘制成剂量相关曲线，从曲线中确定达到50％存活率所需的各测试物质浓度(EC50)，把该值定义为毒性值。
从下列表4中所列数据可以明显看出，同对COX-1和COX-2具有低选择性的化合物例如吲哚美辛和双氯芬酸钠相比，对COX-2具有相对高选择性的依托度酸显示对细胞例如角膜上皮细胞和结膜细胞的损害可能性要低。这将导致开发一种角膜损害小的非甾体抗炎剂。
另外，下列表5中的数据显示美洛昔康仅仅非常弱地损害角膜上皮细胞和结膜细胞。
表4非甾体抗炎剂对角膜上皮细胞和结膜细胞的作用
各测试物质接触细胞时间24小时。
表5非甾体抗炎剂对角膜上皮细胞和结膜细胞的作用
工业实用性能够选择性抑制COX-2的本发明药物可以用作滴眼剂，其仅仅非常弱地损害角膜，但对于治疗眼炎显示非常突出的效果。特别是美洛昔康，与角膜上皮细胞长时间接触后，同结膜细胞相比，仍显示非常好的作用。
权利要求
1.治疗眼炎的滴眼剂，含有选择性抑制环氧合酶-2的药物作为活性成分。
2.权利要求1的滴眼剂，其中选择性抑制环氧合酶-2的药物为依托度酸。
3.权利要求2的滴眼剂，其中依托度酸的浓度为0.5-5％。
4.权利要求1的滴眼剂，其中选择性抑制环氧合酶-2的药物为N-(2-(环己氧基)-4-硝基苯基)甲磺酰胺。
5.权利要求4的滴眼剂，其中N-(2-(环己氧基)-4-硝基苯基甲磺酰胺的浓度为0.5-5％。
6.权利要求1的滴眼剂，其中选择性抑制环氧合酶-2的药物为美洛昔康。
7.权利要求6的滴眼剂，其中美洛昔康的浓度为0.1-1％。
全文摘要
本发明涉及抗炎的滴眼剂,其含有选择性抑制COX－2的药物,所述药物选自依托度酸、N－(2－环己氧基)－4－硝基苯基)甲磺酰胺和美洛昔康,其角膜上皮细胞和结膜细胞损害微弱,而具有优良的抗炎作用。
文档编号A61K31/00GK1301177SQ99806227
公开日2001年6月27日 申请日期1999年5月14日 优先权日1998年5月15日
发明者三宅谦作, 钓谷昌敞, 屋田浩子, 铃木秀一, 丰田好洋 申请人:若素制药株式会社