用于治疗癌症的腺病毒－化疗剂联合应用的制作方法

专利名称：用于治疗癌症的腺病毒－化疗剂联合应用的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及癌症，以及用腺病毒结合化疗剂来治疗或预防癌症的方法和组合物。
若干年来，人们一直尝试用复制病毒对癌症进行病毒治疗，但是，非常遗憾的是进展极小。最著名的研究是二十世纪60和70年代间进行的研究。其中之一是Southam和Moore的工作。见Southam,C.M.和Moore,A.E.Cancer 1952,vol.5,pp.1025-1034。在此研究中，作者用West Nile病毒，Egypt 101株来治疗一些不同类型的癌症。遗憾的是，在淋巴瘤患者中最有希望的研究表明表现出肿瘤退化的患者少于10％。此外，在90％的患者中此病毒引起病毒性贫血(viraemia)，并且很多人还表现出脑炎，这是就此病毒的亲神经特性的并不奇怪的作用。
第二个研究由Smith和Collins在1956年进行。见Smith,R.等，Cancer(1956),vol.9,pp.1211-1218。他们在30位患者中检测多种类型的腺病毒，这些患者患有恶化的子宫颈表皮样肿瘤。通过肿瘤内直接接种或通过动脉灌注使用不同量的病毒。使用不同病毒的系列类型，且在接种病毒前检测患者的抗腺病毒中和抗体的预存在性。在40个接病毒中，观察到在注射的骨盆肿瘤中央部分的坏死区域得到约26个。还注意到对正常骨盆组织没有损害。在多达30天内发生肿瘤坏死，没有肿瘤全部破坏的情况。注意到预存在抗腺病毒抗体的患者比对此病毒没有免疫性的患者表现差。
第三个肿瘤癌症的研究由Asada进行。见Asada,Cancer(1974),vol.34,pp 1907-1928。在此研究中，用流行性腮腺炎病毒治疗恶性肿瘤患者。给患不同肿瘤疾病的90位患者使用此病毒。90位患者中37位没有观察副作用或副作用极小，肿瘤消失或退化至原大小的一半以下。此外，在42位其它患者中观察到很小的反应。这些病毒似乎在两个阶段发生作用在第一个阶段，在注射后几天发生，病毒复制引起显著的肿瘤破坏，而在第二个阶段，在肿瘤再生长为静止期时没有后来的时期。遗憾的是，正如在其它实验中观察到的，在所有的病例中癌症最终会再生长。
考虑到在这些实验中病毒治疗表现出的有限作用，基本上停止了此研究是不奇怪的，但是最近有两个明显的例外。第一个是Martuza等的工作，其涉及用单纯疱疹病毒治疗癌症(见PCT/US96/08621)。其中策略是用复制-活性单纯疱疹病毒，该病毒表达了肿瘤或细胞特异性转录调节序列，其有效地连接基本的单纯疱疹病毒基因。此外，已尝试通过适当的突变使病毒没有神经毒性。遗憾的是，这些突变仍保留了显著的残留神经毒性，且它们最终在癌症治疗中的效果如何尚不确定。
第二个研究描述于美国专利5677178，发明人McCormick。此研究利用癌细胞中肿瘤抑制因子蛋白损失的优点。也许最显著的此种肿瘤抑制因子蛋白是p53。p53的功能是通过在对DNA损坏反应中的细胞循环来抑制哺乳动物细胞的进化。野生型腺病毒的elb p55蛋白与表达p53的腺病毒侵染细胞的p53结合并造成对p53功能的基本灭活。功能腺病毒elb p55蛋白是含功能p53细胞中腺病毒有效复制所必需的。基本上缺乏结合p53能力的腺病毒突变株在具有正常水平的功能p53的、非复制、非肿瘤细胞中是复制缺失的。但是，这些腺病毒突变株在p53功能缺陷细胞中表现出复制表型(例如，与基本缺失的p53等位基因纯合的细胞，含基本上无功能的突变p53蛋白的细胞)，并因此引起这些细胞的死亡。在仍在进行的临床实验中，上述腺病毒突变株已显示出了生物活性并在脑和颈部癌症中引起部分肿瘤坏死。
60和70年代的病毒治疗临床实验虽然没有明显成功，但是为此领域的近期工作打下了基础。如果病毒治疗与癌症治疗如化疗的标准用药程式结合，在这些研究中观察到的病毒抗癌效果可能提高。
本发明的第一个目的描述了治疗癌症的方法，该方法包括给需要此治疗的患者结合化疗使用复制腺病毒载体。
本发明的第二个目的是治疗癌症的方法，该方法包括给需要此治疗的患者结合化疗使用复制腺病毒载体，其中该结合引起抗癌协同作用。
本发明的第三个目的是治疗扁平细胞癌症的方法，包括给此癌症直接注射腺病毒并使用化疗以产生抗癌的协同作用。
本发明的第四个目的是治疗扁平细胞癌症的方法，该方法包括给此癌症直接注射腺病毒，并使用两种化疗剂顺铂和5-氟尿嘧啶以产生抗癌协同作用。
本发明的第五个目的描述了治疗头部和颈部的扁平细胞癌症的方法，该方法包括给此癌症直接注射腺病毒，并使用两种化疗剂顺铂和5-氟尿嘧啶，以产生抗癌的协同作用。
本发明的第六个目的描述了表现出抗癌协同作用的腺病毒和化疗剂组成的组合物。
本发明的第七个目的描述了表现出抗癌协同作用的腺病毒和两种化疗剂顺铂和5-氟尿嘧啶组成的组合物。
在阅读以下说明书对本发明的不同方面的描述的基础上，本发明的这些和其它目的对本领域普通技术人员来说是显而易见的。本发明的上述和其它方面在以下给出的附图
、发明详述和实施例中详述。
在此说明书中提及的所有出版物和专利申请引入本文以供参考，就如同对每个单独的出版物或专利申请特别并单独指出其被引入以供参考一样。
定义除非特别说明，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员常规理解的相一致。一般来说，本文中使用的名称和以下描述的实验方法是熟知和本领域常规使用的。标准技术用于重组核酸方法、多核苷酸合成和微生物培养及转化(例如，电穿孔、脂侵染)。一般按照制造商的说明进行酶反应和纯化步骤。技术和方法一般按照本领域和多种参考文献中的常规方法进行(见Sambrook等，Mo1ecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.，将其引入作为参考)，其在此文件中提供了参考文献的出处。本文中的命名和在分析化学、有机合成化学和下述药物制剂中的实验室方法是本领域熟知和常规使用的。在化学合成、化学分析、药物制剂和转运以及患者的治疗中使用标准技术。
在整个公开中，除非特别说明，所用以下术语应理解为具有以下含义术语“腺病毒”指从人、其它哺乳动物和鸟类中分离的40多种腺病毒亚型。见Strauss,"Adenovirus infections in humans",The Adenoviruses,Ginsberg编，Plenum Press,New York,NY,pp.451-596(1984)。此术语优选两个人血清型，Ada和Ad5。
“肿瘤细胞”或“瘤形成”指表现出相对的自主生长的细胞，于是它们表现出异常生长表型，其特征是细胞增殖的显著失控。肿瘤细胞包括可以活性复制或处于暂时非复制休止态(G1或G0)的细胞；类似地，肿瘤细胞可以包括具有分化很好的表型、分化差的表型或两种细胞类型混合物的细胞。因此，在给出的时间点并非所有的肿瘤细胞必然是正复制的细胞。将其定义为由良性瘤细胞和恶性(或症状明显)肿瘤细胞组成肿瘤细胞。此处，症状明显的肿瘤细胞常称为癌症或癌细胞，如果由内胚层或外胚层组织来源的细胞产生则一般称为癌，或者如果得自中胚层的细胞类型产生则称为肉瘤。
“生理条件”或“生理溶液”指离子强度、pH和温度基本类似于完整哺乳动物细胞或组织空间或活哺乳动物器官中的条件。一般生理条件包括含约150mM氯化钠，pH6.5-7.6且温度约22-37℃的水溶液。总之，生理条件是适于生物大分子的分子间的缔合的结合条件。例如，150mM氯化钠，pH7.4在37℃的生理条件一般是适宜的。
本文中化学术语按照本领域常规使用，由McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker,S.编，1985)例示，将其引入作为参考。
当其功能彼此相关时，DNA区域是可操作连接的。例如，如果其控制序列的转录，启动子与编码序列是可操作连接的；如果其定位以允许翻译，核糖体与编码序列是可操作连接的。总之，可操作连接指在前导序列中接触，及在读框中接触。
复制腺病毒载体指能在癌症细胞中复制的腺病毒或其突变体。其可以包括野生型腺病毒，或如下详述的腺病毒、能在某些类型癌细胞中选择复制的腺病毒突变体，优选缺乏一种或多种癌症抑制因子蛋白的那些。
对腺病毒和化疗的协同作用活性的解释不用囿于特定的理论，建议腺病毒和化疗的优选的结合，是腺病毒E1b-突变株与顺铂和5-氟尿嘧啶(5-Fu)的结合。
腺病毒值得一提的是当本发明根据5型腺病毒描述时，对于其它类似腺病毒血清型也是可以实施的。腺病毒基因组的总结构保存在血清型中，并类似地处于特定功能。此外，腺病毒5基因组登记为Genbank手册#M73260，且此病毒由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection),Rockbille,Maryland,U.S.A.提供，登记号VR-5。构建腺病毒突变株的方法是本领域的一般知识。见Mittal,S.K.,Virus Res.,1993,vol 28,67-90页。用于构建腺病毒突变株的某些物质和方法描述于Hanke,T.等，(1990)Virology,vol.177,437-444页，及Bett,A.J.等，(1993)J.Virol.vol.67,5911-5921页，以及PCT/CA96/00375。位于341 Bering Avenue,Toronto,Ontario Canada的MicrobixBiosystems,Inc.出售用于构建腺病毒突变株的很多物质，并提供如何制备的产品信息清单。
可以用来与化疗结合以产生本文中所指的抗癌协同作用的优选腺病毒突变株，是缺乏表达灭活p53的病毒蛋白能力的。这些蛋白至少由腺病毒基因组的E1B和E40RF6区域编码。细胞磷蛋白p53的功能是通过细胞循环抑制哺乳动物细胞的进化。在具有p53的侵染细胞中，野生型腺病毒E1b p55蛋白结合p53，并产生对p53功能的基本灭活，类似于通过在灭活形式中螯合p53。功能性E1b p55蛋白是含功能性p53细胞中有效的腺病毒复制所必需的。因此，基本上缺乏结合p53能力的腺病毒突变株在具有正常水平的功能性p53的、非复制、非肿瘤细胞中是复制缺陷的。
人癌细胞常常对突变(例如，取代、缺失、移码突变株)p53等位基因是纯合或杂合的，并缺乏正常控制细胞循环需要的p53功能(Hollstein等，(1991),Science 253:49；Levine等，(1991)前面引证的，引入本文作为参考)。因此，很多肿瘤细胞是p53(-)的，这是因为它们缺乏足够水平的p53蛋白和/或因为它们表达的p53突变形式不具备基本的p53功能，且当可能存在野生型p53时甚至可能基本上缺乏p53功能(例如，通过抑制功能性多聚体的形成)。一些肿瘤细胞可能含有编码基础野生型p53蛋白的等位基因，但是可能含有第二位点突变，其基本上废除了p53功能，如使p53蛋白位于细胞质而不是细胞核的突变；这些第二位点突变体也基本上缺乏p53功能。
据信缺乏复合p53能力但基本上保持其它基本表达复制功能的复制缺陷腺病毒种类会在细胞中表现出复制表型，其缺乏p53功能(例如，对基本上缺失p53等位基因是纯合的细胞，包含基本上没有功能的突变p53蛋白的细胞)，但是在非复制、非肿瘤细胞中会基本上不表现出复制表型。这些复制缺失腺病毒种类在本文中简称为E1b-p53(-)复制缺失腺病毒。
细胞群落(如混合细胞培养物或癌症病人)，其包括缺乏p53功能的肿瘤细胞的亚群落和表达了基本正常的p53功能的非肿瘤细胞的亚群落，可以在侵染条件下(即适于细胞群落的腺病毒侵染的条件，典型生理条件)接触含侵染量的E1b-p53(-)复制缺失腺病毒的组合物。此接触导致了此细胞群落被E1b-p53(-)复制缺失腺病毒侵染。此侵染在含缺乏p53功能的肿瘤细胞亚群落的细胞有效片断中产生复制表型的优先表达，但在具有基本正常p53功能的非肿瘤细胞的亚群落中不产生复制表型的实质表达。在侵染的p53(-)细胞中，复制表型的表达导致细胞的死亡，如通过细胞病变作用(CPE)、细胞溶解、编程性细胞死亡等，导致细胞群落中肿瘤p53(-)细胞的选择性除去。
一般来说，适于选择性杀死p53(-)肿瘤细胞的E1b-p53(-)复制缺失腺病毒构建物包括突变(例如，缺失、取代、移码)，其灭活E1bp55多肽有效结合p53蛋白的能力。此灭活突变一般发生在结合p53的p55区域。此突变E1b区域可选择性地编码和表达功能性p19蛋白，该蛋白由剩余的E1b区域编码，而其在缺乏E1a多肽下腺病毒早期基因的反式激活中是功能性的。
用于本发明方法和组合物中的适宜的E1b-p53(-)复制缺陷腺病毒构建物，包括但不限于下列实例(1)型2腺病毒d1 1520，其含有在核苷酸2022位的C至T突变，该突变产生位于AUG密码子下游3个氨基酸的停止密码子，该AUG密码子用于启动p55蛋白的翻译，并含有在2496和3323核苷酸之间的缺失，该缺失被小连接插入替代，而小连接插入在3336核苷酸产生第二个停止密码子；p19蛋白的表达基本上没有被影响(Barker and Berk(1987)Virology156:107，引入本文作为参考)，及(2)复合腺病毒构建物，其含有2型腺病毒d1 1520，其含有至少2022位突变和/或2496-3323缺失突变，或其部分，以及在p19的其它突变以产生p19 cyt突变株；缺乏p55并含有p19 cyt突变的升高细胞病变作用的复合病毒构建物。Ad2 d1 1520得自洛杉矶的Dr.A.Berk,University ofCalifornia,Los Angeles,CA，并在文献中描述，包括文献Barkerand Berk(1987)Virology 156:107。
优选向这些腺病毒构建物中掺入其它突变，以在肿瘤细胞中抑制侵染病毒颗粒的形成，否则它们会支持E1b-p53(-)突变体的复制。这些其它灭活突变优选在治疗过程中，在此过程中能传播并侵染相邻细胞的完全病毒复制形成侵染病毒颗粒是不需要的。这些完全灭活的突变体称为非复制性E1b-p53(-)突变体。这些非复制性突变体包括即使在P53(-)RB(-)细胞中也防止侵染病毒颗粒形成的突变；这些突变一般是在基础病毒颗粒蛋白或蛋白酶中的结构突变。
但是，在很多用药程式中，需要此突变病毒能复制并形成含突变病毒基因组的侵染病毒颗粒，该颗粒可以传播并侵染其它细胞，因而放大突变病毒起始剂量的抗肿瘤作用。
由本领域技术人员通过在E1b基因区域产生突变，该区域编码p55多肽，表达突变p55多肽，在水性结合条件下让突变p55多肽结合p53或结合p53的片断，并鉴定突变E1b多肽，其非特异性地结合p53，将其作为适用于本发明的候选E1b(-)突变株，可以产生缺乏激活p53能力的其它E1b(-)突变体。
值得注意的是，不论所需的腺病毒是野生型还是其突变体，用描述于PCT/US96/01957的方法，或通过将组织特异性启动子构建进此病毒中(见PCT/US95/14461)，促进一些前药激活基因的表达(见PCT/GB95/00322)，改变其外部结合蛋白，从而将病毒靶向癌细胞可以提高相关细胞选择性癌症的杀伤。
制剂可以配制腺病毒包括腺病毒突变株以给患者治疗性或诊断性使用。对于治疗或预防应用，给病人或兽类非人类患者使用含药学有效量的腺病毒的灭菌组合物，以治疗，例如，治疗病症。一般来说，此组合物在含水悬浮液中含有约103至1015或更多的腺病毒颗粒。在此灭菌组合物中常使用药用载体或赋形剂。可以使用多种水溶液，例如，水、缓冲水溶液、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是灭菌的并且除所需腺病毒载体外一般没有其它颗粒物质。这些组合物可以含有如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。可以包括提高腺病毒感染细胞的赋形剂。
本发明的腺病毒，或其中含有的DNA，还可以通过脂质体或免疫脂质体转运至肿瘤细胞中此转运可以根据存在于肿瘤细胞群落中的细胞表面性质(例如，结合免疫脂质体中免疫球蛋白的细胞表面蛋白的存在)，是选择性靶向肿瘤细胞的。一般来说，含病毒颗粒的含水悬浮液包封于脂质体或免疫脂质体中。例如，腺病毒病毒颗粒的悬浮液可以包封于微胶粒中以通过常规方法形成免疫脂质体(美国专利5043164，美国专利4957735，美国专利4925661:Connorand Huang(1985)J.Cell Biol.101:582；Lasic DD(1992)Nature 355:279；Novel Drug Delivery(Prescott LF and NimmoWS编Wiley,New York,1989)；Reddy等，(1992)J.Immunol.148:1585页)。含与存在于个体癌细胞上的癌细胞抗原(如CALLA,CEA)特异性结合的抗体的免疫脂质体可以用于将病毒颗粒或病毒颗粒DNA靶向这些细胞。
含本发明腺病毒或其混合物的组合物可以用于预防和/或治疗肿瘤疾病。在治疗应用中，可以以足以治疗或至少部分减轻症状及其并发症的量，给已被特定治疗疾病侵染的患者使用这些组合物，适于完成此目的的量定义为“治疗有效量”或“有效量”。对此用途有效的量将依赖于病症的严重性、患者的健康状况及给药途径。
在预防应用中，含本发明腺病毒或其混合物的组合物，给不存在肿瘤病症的患者使用以提高该患者对癌症复发的抵抗性或延长缓解时间。此量定义为“预防有效量”。在此用途中，确切的量还是依赖于患者的健康状况及免疫力的总体水平。
治疗方法靶癌症本发明的关键方面是发现腺病毒与某些化疗剂联合产生抗癌协同作用。因此，可以通过给患者结合化疗使用腺病毒，其野生型或突变株，优选E1b突变株，来进行肿瘤疾病的治疗。与腺病毒结合产生协同作用的化疗剂的类型依赖于所治疗癌症的类型，并是本领域技术人员容易确定的。例如，对于头部和颈部癌症，在实施例中详细讨论的，优选的化疗方案是用两种化疗剂，顺铂和5-氟尿嘧啶。
用本发明的腺病毒/化疗剂联合可以治疗多种癌症。例如，但不限于支气管癌、鼻咽癌、喉癌、小细胞和非小细胞肺癌、肺腺癌、肝胆管癌、胰腺癌、膀胱癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌或淋巴细胞白血病的患者，可以通过使用有效抗肿瘤量的腺病毒治疗。优选用本发明腺病毒/化疗剂联合治疗的癌症为扁平细胞癌实体瘤，更优选为头部和颈部癌症。
在欧洲、北美和远东的发达国家中，头部和颈部的扁平细胞癌每年困扰约125000患者。在美国，每年的发生率为45000例，其中15000例与死亡有关。已报告在45-70％的病例中，头部和颈部癌症包含p53突变；酒精和烟草的使用与这些突变有关。对这些局部疾病的主要治疗是手术和辅助放疗。
手术后约三分之一的患者中癌症复发。在多数病例中，它们复发在原主要治疗的区域并由于疼痛导致严重的发病率，并导致口咽和喉梗阻，并在吞咽和讲话中带来困难。一旦癌症复发和/或转移，该患者被认为是无法治愈的。治标的手术是困难的，且毁容，而进一步的放疗在几个月内并不总是有效。在头部和局部的复发扁平细胞癌治疗中已使用了几种化疗剂。联合方案已显示引起30-40％患者的反应，但是此治疗可能是毒性的并对存活的影响还不清楚。一旦患者的癌症对化疗和/或放疗是顽固的，平均存活时间是3个月，而癌症对第二种或第三种化疗剂的反应率≤15％。因此，本发明满足了这些临终患者对更有效的治疗的需要。
侵染腺病毒颗粒的悬浮液可以通过多种途径给肿瘤组织使用，包括静脉内、动脉内、肿瘤内、腹膜内、肌肉内、皮下和局部使用。每毫升含约103至1012或更多的病毒颗粒的腺病毒悬浮液可以以雾状吸入(例如，对于肺转运以治疗支气管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌或喉癌)或直接给癌症擦拭(例如，支气管癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌)或者可以通过输液给药(例如，进入腹膜以治疗卵巢癌，进入肝门静脉和/或干动脉以治疗肝胆管癌或来自其它非肝脏原发癌的肝转移癌)或其它适宜的途径，包括直接注射进癌症实体(例如，乳腺癌)、灌肠(例如，直肠癌)或插管(例如，膀胱癌)。
为了得到腺病毒和化疗的协同作用，优选腺病毒在几天内连续给药，更优选在3至7天的时间内每天给药。在扁平细胞癌的情况下，例如对头部和颈部癌症，最优选的给药方案是5天内连续给药。但是，主要的是要注意确切的天数应根据所治疗的癌症类型变化，且本领域技术人员从本文公开的内容中会容易地确定达到最大协同作用的最好给药方案。
用本发明的腺病毒进行的腺病毒治疗，可以与其它抗肿瘤方法联合，例如，基因治疗。如上所述，用于本发明的腺病毒构建物可表现出特异性癌细胞杀伤，优选通过前药激动基因的表达传动组织特异性启动子。
对于本发明腺病毒载体，包括野生型和突变病毒，在宿主动物体内引起抑制其作用的免疫反应的情况，它们可以与适当的免疫抑制药物一起给药以达到最大的作用。
化疗剂的给药化疗剂可以通过本领域技术人员熟知的方法给药，包括系统的、癌症直接注射或通过在癌症位点通过将所需化疗剂与适当的缓释物质结合局部给药，或者在动脉内往肿瘤灌注。
优选的化疗剂是顺铂，而优选的剂量可以由操作者根据所治疗癌症的特性，以及其它在使用顺铂时常规考虑的因素选择。优选，在3至6小时内，以50-120mg/平方米的剂量静脉内使用顺铂。更优选在4小时内以80mg/平方米的剂量使用顺铂。此外，优选在治疗的第1天与腺病毒一起使用。
优选与顺铂联合给药的第二种化疗剂是5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶优选的剂量是在5天内连续每天使用800-1200mg/平方米(连续输液)。
腺病毒/化疗的协同作用本发明的一个方面是观察到的腺病毒/化疗联合的抗癌作用比任一试剂单独的作用大，即此作用大于加和作用。因此，腺病毒/化疗联合具有协同抗癌作用。表1表明在5个人的临床实验中用化疗治疗的患者的复发头部和颈部癌症的反应率。这些实验的平均反应为37％，其由完全反应(CR)和部分反应(PR)组成。对此实验的讨论见Paredes,J.等，《在头部和颈部复发和/或转移扁平细胞癌中高剂量顺铂和氟尿嘧啶输液加或不加二硫代氨基甲酸二乙酯钠的前瞻性随机实验》，Journal of ClinicalOncology,6:955-962,1988；Jacobs,C.等，《比较顺铂和氟尿嘧啶作为单独试剂和其联合形式在头部和颈部的恶化扁平细胞癌中的Ⅲ期随机研究》，Journal of Clinical Oncology,10:257-263,1992；Forastiere,A等，《在头部和颈部恶性扁平细胞癌中随机比较顺铂加氟尿嘧啶和卡铂加氟尿嘧啶与甲氨蝶呤西南部肿瘤学研究组研究》，Journal of Clinical Oncology,10:1245-1251,1992；Schrijvers,D.等，《在头部和颈部癌症复发和转移患者中用干扰素α-2b调节顺铂/氟尿嘧啶化疗的Ⅲ期实验》，Journal of Clinical Oncology,16:1054-1059,1998；LHNOG A，《在头部和颈部晚期扁平细胞癌中顺铂、甲氨蝶呤、顺铂+甲氨蝶呤和顺铂+5-FU的Ⅲ期随机实验》，British Journal ofCancer,61:311-315,1990；Clavel,M.等，《在头部和颈部复发或转移扁平细胞癌中随机比较顺铂、甲氨喋呤、博莱霉素和长春新碱(CABO)与顺铂和5-氟尿嘧啶(CF)与顺铂(C)。EORTC头部和颈部癌症合作组的Ⅲ期研究》，Annals of Oncology,5:521-526,1994。表1复发头部和颈部癌症的Ⅲ期研究研究 年代 参与的患者 PR+CR CRLHNOG 199039 31％ 0FORASTERE 199287 32％ 6％JACOBS 199263 40％ 8％CLAVEL 199410834％ 0SCHRUVERS 199812247％ 11％共计 41937％与化疗比较，单独使用腺病毒时复发头部和颈部癌症的反应率是26％。此反应率还是表示完全和部分反应。这些结果见表2。表2ONYX-015头部和颈部癌症研究对于复发、顽固性头部和颈部癌症的所有的单一试剂ONYX-015数据患者数目 CRPR 反应率(％)23 2 4 26与化疗或腺病毒单独使用的反应率相比，对于复发头部和颈部癌症来说，对化疗和腺病毒的反应率为约90％，如在实施例中所详述的。
下面的实施例是对本发明特定实施方案及其不同用途的举例说明。其给出只是为了举例目的，而不是作为本发明的限制。实施例治疗头部和颈部的扁平细胞癌头部和颈部扁平细胞癌的患者接受腺病毒E1b突变株，dl1520(在本文中也称为ONYX-015)和化疗治疗，如下所述。Dl 1520由Berk在Virology 156:107页(1987)中描述并可以得自Dr.Arnold Berk,University of California,Los Angeles,California。
判断标准根据某些判断标准在临床实验中登记患者。癌症必须是组织学确定的头部和颈部扁平细胞癌，包括口腔、咽和喉。它必须是复发疾病，其中复发癌症已先用化疗剂治疗。复发疾病指原来用手术和/或放疗治疗后发生的癌症(即，包括原发性顽固性癌症)。
对其原发性头部和颈部癌症(一种或多种)先接受了化疗的患者以及此化疗方案完成后4周内没有恶化的患者，也适合包括在内。
此外，整个癌症必须适于直接注射病毒，且此癌症必须适合临床检测和/或放射照相。此癌症还必须是手术(由主治手术医生确定)或放疗无法治愈的。
对于放射照相检查的并且不能清楚评价的癌症患者，进行基础CT扫描评价。如果癌症经CT扫描清楚评价与主要研究者的判断相同，则给此患者登记。如果通过CT扫描无法检查，在此位点进行MRI扫描并随后进行评价。如果此癌症无法通过CT扫描、MRI扫描或物理检查鉴定，则不给此患者登记。
其它判断标准为Karnofsky行为特征≥70％，而存活期≥3个月。
ONYX-015的给药将ONYX-015在TRIS缓冲液(10mM TRIS pH7.4,1mM氯化镁，150mM氯化钠，10％甘油)中配制为灭菌病毒溶液。此ONYX-015溶液不含防腐剂。在使用前该病毒可以冷冻保存。所用的ONYX-015的总剂量为1010pfu每天，共5天。在第一天，在早晨常规开始ONYX-015治疗和化疗。在第一天，化疗开始前使用ONYX-015。将病毒溶液解冻并用生理溶液开始稀释至适当的滴度。在稀释和操作期间，在2℃至8℃维持解冻的病毒，而在给药前立即升温至室温。稀释至适当滴度后，此病毒溶液再进一步稀释至最终体积等于要进行注射的估计的癌症体积的30％。癌症体积由最大癌症直径、垂直的和估计高度的乘积除以2进行估计。此评估用超声波、MRI、CT扫描和/或临床检查进行。对于已发生中心溃疡的癌症，通过减去溃疡面积调整估计的癌症体积(该溃疡面积由溃疡面积的最大直径、其垂直和估计深度的乘积除以2进行估计)。恰在给癌症注射前进行稀释。
将靶癌症(一种或的多种)通过使用癌症模板图划分为5个大小相等、体积相同的部分。在注射NOYX-015前，由研究者根据患者预先存在的疼痛或注射产生的疼痛，先给患者局部或系统使用止痛药。每个治疗周期的每天，在注射前一般尝试给癌症内的中心坏死组织/流体进行吸引术。在5个疗程的每个疗程中，给5个癌症部分中的一个直接注射(用25号或更小的针头)，且其方式为让全部癌症部分中分配等体积的病毒。当注射病毒时，逐步抽出注射器以便沿着整个针头轨迹分布相同的注射体积。重要的是，所用注射技术使病毒分布在癌症的边缘和深部。注射后，如果需要给注射后区域轻轻施压2-3分钟，以防止病毒溶液从注射点泄漏。
化疗剂，顺铂和5-FU的给药·80mg/平方米的顺铂Ⅳ给药4小时(±1小时)。如上所述，在第1天，在用ONYX-015治疗的第一天后进行顺铂治疗。
·如果住院，则每天在不超过2升的盐水溶液中进行1000mg/平方米的5-FU的给药，或如果不在医院通过便携泵在不超过0.5升的盐水溶液中进行给药。在第1-5天给药是Ⅳ连续输液(即5000mg/平方米总剂量/循环)。
重复治疗如果经至少2个循环的ONYX-015治疗后在靶癌症位点没有恶化疾病的证据，患者以相同的剂量接受ONYX-015和顺铂、5-FU重复治疗，共5个循环，每隔3周给药(由前一个治疗循环的的第1天开始计算)。
癌症反应标准用下列标准，分别评价在注射后靶癌症的反应。在反应和无恶化期间，确定存活时间。用经典/标准截面癌症检测评价反应，如下[最大癌症直径x垂直直径]。从总面积中减去溃疡的癌症面积。用数码成象分析进行计算机辅助截面检测。如果觉得在所给出的患者中对癌症大小的物理检查比放射照相扫描更准确，则用物理检查确定癌症反应。
将癌症对病毒/化疗治疗的反应如下分级完全反应(CR)在评价位点癌症完全消失部分反应(PR)癌症(一种或多种)消退超过50％但小于100％较小反应(MR)癌症消退少于50％。
对于PR的情况，截面积的计算机辅助计算不包括癌症的坏死面积。最后，在其被正确分类前，对治疗的所有反应必须持续4周。
结果表3给出了用ONYX-015、顺铂和5-氟尿嘧啶治疗的10位患者的结果。表3对ONYX-015治疗头部和颈部，Ⅱ期结合化疗的反应的总结
从表3数据中明显看出10位患者中有9位对治疗有反应。基于顺铂和5-氟尿嘧啶的原始反应率37％(表1)和对腺病毒的单独反应率26％(表2)，此90％的反应率表明了对靶头部和局部癌症的协同作用。
现在对本发明进行了充分描述，对本领域技术人员来说，在不背离后面的权利要求书的实质和范围前提下，很多变化和修饰是显而易见的。
权利要求
1．组合物，其中含有腺病毒和至少一种化疗剂。
2．权利要求1所述的组合物，其中所述腺病毒是Onyx 015。
3．权利要求2的组合物，其中所述化疗剂包括顺铂。
4．权利要求1的组合物，其中所述化疗剂包括顺铂和5-氟尿嘧啶。
5．为需要的患者治疗癌症的方法，其包括如下步骤(a)让所述癌症与以足以基本消灭癌症量的腺病毒和至少一种化疗剂接触且接触时间足以消灭癌症，且如果需要，重复步骤(a)以防止所述癌症复发。
6．权利要求5的方法，其中所述癌症是扁平细胞癌。
7．权利要求6的方法，其中所述扁平细胞癌在头部和颈部。
8．权利要求7的方法，其中所述癌症接触腺病毒包括通过给所述患者的所述癌症以约108-1012的空斑形成单位直接注射使用所述腺病毒。
9．权利要求5的方法，其中所述癌症接触腺病毒包括给所述患者静脉使用所述腺病毒。
10．权利要求5所述的方法，其中所述接触癌症包括使用腺病毒后给所述患者使用所述化疗剂。
11．权利要求5的方法，其中所述化疗剂包括顺铂和5-氟尿嘧啶。
全文摘要
描述了治疗和预防癌症的组合物和方法,包括腺病毒和化疗的联合,此联合协同消失或防止癌症的生长,其中癌症优选是复发或转移的扁平细胞癌。
文档编号A61K35/76GK1301169SQ99806170
公开日2001年6月27日 申请日期1999年4月19日 优先权日1998年5月15日
发明者D·克恩 申请人:昂尼克斯药物公司