一种透明质酸修饰的超顺磁性氧化铁/金复合纳米探针的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于磁共振和CT成像造影剂的制备领域，特别涉及一种透明质酸修饰的 超顺磁性氧化铁/金复合纳米探针的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，四氧化三铁/金复合纳米颗粒在生物医学领域中受到越来越多的关注， 特别是用作MR和CT双模态成像的造影剂，能有效地克服单模态成像的局限性和缺点，提高 疾病诊断的准确度。本课题组已通过层层自组装的方法和简易的水热法制备出四氧化三铁 /金复合纳米颗粒，并探索了其MR/CT诊断应用的可行性（专利号：ZL201310170267. 0 ;Cai et al.J. Mater. Chem. ,2012, 22, 15110-15120.专利号：ZL201310072165. 5 ;Li et al. ACS Appl. Mater. Interfaces2013, 5, 10357-10366)。然而，自组装方法的反应过程复杂，产物 制备周期长，产物中含金量低，1"2弛豫率低。水热法需要高温高压才能制备出四氧化三铁/ 金复合纳米颗粒，1" 2弛豫率低。为了减少造影剂的剂量并达到灵敏检测的目的，制备具有 更高弛豫率和高含金量的四氧化三铁/金复合纳米探针就显得尤为有意义。为了解决这一 难题，我们尝试采用类似"一步"简易水热合成法的方案，在改性"共沉淀"制备纳米颗粒的 过程中加聚乙稀亚胺（Polyethyleneimine，PEI)包裹的Au纳米颗粒，从而实现简易的改 性"共沉淀"方法"一步"制备PEI修饰的Fe 3O4Au复合纳米颗粒。数据表明，制备的Fe3O4/ Au-PEI不仅具有良好的水溶性和胶体稳定性，而且同时表现出优良的1~2加权成像效果和X 射线衰减能力，r2的弛豫率高达264. 16mM -1S-1左右，产物中Fe 304与Au的摩尔比为I: I. 01。 同时兼具如此高的弛豫率和高含金量的复合纳米探针在目前的研宄文章中为数不多。为了 使制备的该种Fe3O 4Au-PEI复合纳米颗粒能有效地应用到生物体内特定肿瘤部位的成像 检测，我们进一步在其表面修饰透明质酸（Hyaluronic acid，HA)，有效地提高了 Fe304/Au 复合纳米颗粒的水溶性、稳定性、生物相容性，并赋予了癌细胞靶向性。以CD44受体高表达 的HeLa细胞（一种人宫颈瘤癌细胞）为模型细胞和肿瘤模型对制备的多功能纳米探针的 性质进行--评价。本研宄制备的Fe3O4Au-HA纳米探针具备的良好特性，特别是高的1* 2弛 豫率和高含金量，有望实现不同疾病的准确和灵敏诊断，为Fe3O4Au纳米颗粒有可能作为 临床造影剂使用提供了可靠的依据。
[0003] 检索国内外文献，尚没有发现关于用改性"共沉淀"法制备HA修饰的超顺磁氧化 铁/金纳米复合探针用于体外癌细胞和体内肿瘤模型靶向MR/CT双模态成像研宄的相关报 道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种透明质酸修饰的超顺磁性氧化铁/金 复合纳米探针的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低；制备的 Fe3O4Au-HA纳米探针能够长时间稳定地分散于水溶液中，不会出现团聚现象；所用的修饰 剂PEI和HA均为廉价和环境友好材料，具有产业化实施的前景。
[0005] 本发明的一种透明质酸修饰的超顺磁性氧化铁/金复合纳米探针的制备方法，包 括：
[0006] (1)将氯金酸HAuCl4 · 4H20溶液加入到聚乙烯亚胺PEI水溶液中，搅拌，得到混合 溶液，然后向混合溶液中加入冰浴处理的NaBH 4溶液，继续冰浴搅拌l-2h，透析，冷冻干燥， 得到Au-PEI纳米颗粒；
[0007] (2)将上述Au-PEI纳米颗粒溶解在水中，加入到铁盐的水溶液中，加热搅拌溶解， 然后逐滴加入NaOH水溶液，搅拌，室温条件下反应l-2h，分离洗涤纯化，得到PEI修饰的 Fe3O4Au复合纳米颗粒Fe3O4Au-PEI ;其中铁盐、PEI、水、NaOH的比例为0. 2?0. 3g:0. 08? 0. lg:20 ?25mL:0. 8 ?I. Og ;
[0008] (3)将透明质酸HA溶液水中，然后加入EDC/NHS溶液，搅拌活化2-4h，得到活化 后的HA，然后加入到FeA/Au-PEI溶液中，搅拌反应2-4天，分离，洗绦，分散，得到Fe 3O4/ Au-HA纳米颗粒，即为透明质酸修饰的超顺磁性氧化铁/金复合纳米探针。
[0009] 所述步骤（1)中PEI为超支化结构，PEI的分子量为25000。
[0010] 所述步骤（1)中NaBH4溶液的溶剂为体积比为1:2的乙醇/超纯水。
[0011] 所述步骤（1)中透析为用截留分子量14000的透析袋透析2-4天。
[0012] 所述步骤⑴中PEI、AiuNaBH4的摩尔比为1:100:300。
[0013] 所述步骤（2)中铁盐为二价铁离子盐或/和三价铁离子盐；其中二价铁离子、三价 铁离子的摩尔比是1:1. 25。
[0014] 所述二价铁离子盐为FeCl2 · 4H20,三价铁离子盐为FeCl3 · 6H20。
[0015] 所述步骤（2)中加热搅拌溶解温度为30-50°C，溶解时间为3-5min ;加入NaOH水 溶液，65-80°C 搅拌 10_30min。
[0016] 所述步骤⑶中HA的分子量为5800, HA与Fe3O4Au-PEI中PEI摩尔比是20:1 ; HA、EDC、NHS 摩尔比是 1:10:10。
[0017] 所述步骤（3)中EDC/NHS溶液、Fe3O4Au-PEI溶液的溶剂均为二甲基亚砜DMS0。
[0018] 本发明通过似8氏还原法制备聚乙烯亚胺PEI包覆的Au纳米颗粒；通过改性"共沉 淀"的方法，"一步"合成Fe 3O4Au-PEI复合纳米颗粒；然后，在其表面修饰HA，制备出Fe3O 4/ Au-HA复合纳米探针。
[0019] 本发明合成了一种基于HA修饰的Fe3O4Au纳米探针。为了克服裸露Fe 3O4Au普 遍存在的聚集沉淀现象，并提高其在生物医学影像领域的可应用性，在反应过程中加入聚 乙烯亚胺（PEI)用于介导Fe 3O4Au的合成，从而实现"一步"制备出胶体稳定性良好的PEI 修饰的Fe3O4Au纳米颗粒。为了进一步提高其生物相容性，使制备的该种Fe3O 4Au-PEI能 有效地应用到生物体内，并实现特定肿瘤部位的成像检测，在其表面修饰透明质酸（HA)。此 夕卜，实验数据表明，制备的Fe 3O4Au-HA纳米探针有很显著的T2W权成像效果，r 2的弛豫率 高达264. 16πιΜ?且Fe3O4与Au的摩尔比为I: I. 01。最后以CD44受体高表达的HeLa细 胞（一种人宫颈瘤癌细胞）为模型细胞和移植瘤模型对制备的多功能纳米探针的性质进行 一一评价。本发明制备的Fe 3O4Au-HA纳米探针在生物医学方面表现出良好特性，特别是很 高的1"2弛豫率和较高的含金量，有望实现不同疾病的准确和灵敏诊断，为Fe 304/Au纳米探 针用作临床造影剂提供可靠的依据。
[0020] 本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的胶体稳定性和 生物相容性。与⑶44受体低表达（透明质酸阻断）的对照组癌细胞相比，HA修饰的Fe 3O4/ Au纳米探针使得CD44受体高表达的肿瘤细胞或肿瘤部位MR信号更低，CT信号更高，表明 其具有对高CD44受体表达的癌细胞或肿瘤部位有更好的靶向性。从而说明该方法制备的 Fe 3O4Au-HA纳米探针在MR/CT双模态影像诊断领域有着潜在的应用。
[0021] 本发明使用X射线衍射（XRD)、热重分析（TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱 法（ICP-OES)、Zeta电势及动态光散射（DLS)和透射电子显微镜（TEM)等方法表征制备的 复合纳米探针，并通过磁共振成像和CT成像测定纳米探针的T 2弛豫性能和X射线衰减性 能，然后通过溶血实验和MTT实验评价纳米探针的溶血性和细胞毒性，再利用细胞普鲁士 蓝染色、细胞吞噬实验以及体外癌细胞和体内肿瘤MR/CT成像实验检测HA修饰的Fe 3O4Au 纳米探针的靶向诊断效果。具体测试结果如下：
[0022] (I) X射线衍射（XRD)测试结果
[0023] 通过对比和分析X射线衍射图谱可知，改性"共沉淀"方法合成的Fe3O4Au-PEI纳 米颗粒（图1)分别与Fe 3O4和Au纳米颗粒的标准图谱对应，表明PEI修饰的Fe 304/Au纳米 颗粒复合了 Fe3O4和Au纳米颗粒。
[0024] (2)热重分析（TGA)测试结果
[0025] 为了检测PEI和HA在Fe3O4Au复合纳米颗粒中的上载量，分别对Fe 3O4Au-PEI (a) 和Fe304/Au-HA(b)纳米颗粒进行了 TGA测试。由图2可以看出，Fe3O4Au-PEI在温度升至 700°C时，重量约为原来的94. 75 %，经过计算，PEI上载量约为5.25 % ;修饰HA后，Fe3O4/ Au-HA在温度升至700°C时，重量为原来的91. 94%，经过计算，HA上载量约为2. 81%，由此 表明PEI和HA均已成功修饰到Fe3O4Au复合纳米颗粒的表面。
[0026] (3)电势和水动力粒径测试结果
[0027] 电势结果显示HA修饰前后Fe3O4Au复合纳米颗粒的表面电势是+36. ImV 和-19. 6mV ;其分散于水中后的水动力粒径分别是339. 3nm和342. 2nm(表1)。说明HA的 修饰过程使得纳米颗粒的水动力粒径和电势均发生了变化，进一步证明了 HA成功到修饰 Fe3O4Au复合纳米颗粒表面。
[0028] (4)透射电子显微镜（TEM)测试结果
[0029] 通过TEM观察本发明制备的Fe3O4Au-HA纳米探针的形态和尺寸（如图3)。TEM 测试结果显示复合纳米颗粒中Fe3O4纳米颗粒的形貌均是球形或准球形，粒径约为9. 69nm， 外围被一层大分子壳层包围；金纳米颗粒不均匀地分布在四氧化三铁的外围，说明合成的 复合纳米探针是以四氧化三铁为核、金纳米颗粒为壳的核壳结构。
[0030] (5)弛豫率测量结果
[0031 ] r2弛豫率反映 Fe 304/Au-HA纳米探针作为MR造影剂的效率，为单位摩尔浓度铁的 横向弛豫时间（T2)，可通过不同浓度下的1~2的倒数拟合计算得到。图4为本发明制备的 Fe3O