壁虎蛆虫蛋白质在制备抗卵巢癌药品中的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种壁虎蛆虫蛋白质的新用途，尤其是壁虎蛆虫蛋白质在制备抗卵巢 癌药品中的应用。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，他是重要威胁妇女健康常见的恶性肿瘤之 一，在妇科恶性肿瘤中发病率占第三位，在我国发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌。
[0003] 卵巢癌主要分类为以下三种：（1)上皮肿瘤：包括黏液腺瘤、浆液腺瘤、子宫内膜 样腺瘤、透明细胞瘤、勃勒瘤及混合上皮瘤；（2)性索间质肿瘤：包括颗粒间质细胞瘤、胚胎 瘤、多胚瘤、绒癌、畸胎瘤等；（4)类脂细胞瘤、非卵巢特意性软组织肿瘤、性母细胞瘤、转移 性肿瘤、瘤样病变等。
[0004] 公认的病因及发病机制与环境因素、内分泌因素、遗传因素、饮食习惯、病毒感染、 化学、放射线、精神因素等均与卵巢癌发病有关。
[0005] 治疗方法采用手术外科治疗、放疗、化疗，中医则将卵巢癌的症状分为脾肾阳虚 型、肝肾阴虚型、气血亏虚型、血瘀内结型及肝气内结型，对症下药，分类型治疗。
[0006] CN103146703A公开了抑制上皮性卵巢肿瘤生长的SiRNA及其重组载体与应用。该 发明筛选到一种抑制上皮性卵巢癌基因表达的干扰序列及构建了含有该干扰序列的重组 载体。
[0007] CN102670944A公开了一种治疗卵巢癌的中药复方制剂及其制备方法。该中药复方 制剂由黄芪、党参、生地、半枝莲、白术、枸杞、木香、天冬、白芍等11种中草药的提取物制成 固体或液体剂型，经过动物实验表明，具有较明显疗效。
[0008] CN102876770A公开了一种肿瘤转移标志物基因及其应用，该发明提供了一种肿瘤 转移标志物基因及其用于抗癌的新药物开发的应用，还提供了肿瘤转移标志基因在制备诊 断癌症的诊断剂的应用。
[0009] CN102908321A公开了一种白蛋白结合型紫杉醇纳米粒冻干制剂及其制备方法。该 发明的制剂由紫杉醇、人血清白蛋白、表面活性剂、油相、冻干骨架剂、稳定剂、PH调节剂制 备成冻干制剂。
[0010] CN102783461A公开了人工培殖壁虎蛆虫的工艺，本发明以壁虎等原料培殖培养 基，通过一种温和条件使壁虎机体大分子转换为小分子成分，培育过程消除了壁虎的毒素 及过敏源，扩大了壁虎药用范围。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种壁虎蛆虫蛋白质在制备抗卵巢癌药品中的应用，本发明 工艺过程中采用适宜的方法提取分离壁虎蛆虫蛋白质，并根据壁虎蛆虫蛋白质的特性辅以 相应的材料至制备成不同剂型的药剂。
[0012] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： (1)将1000 g壁虎蛆虫在常温膨化装置（200520108339. X)中常温条件下膨化粉碎。
[0013] 本步骤中，所述膨化压力为0· l~5MPa，时间为10~60min。
[0014] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中，加入 膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出壁虎蛆虫蛋白质粗品。
[0015] 本步骤中，所述膨胀溶剂由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 · H2O组成或由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组 成。
[0016] 本步骤中，所述提取温度为10~20°C，时间为10~30min。
[0017] (3)收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。
[0018] 本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0. 5~50Mm。
[0019] (4)用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液。
[0020] 本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。
[0021] (5)超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。
[0022] 本步骤中，所述溶剂为乙腈。
[0023] (6)将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱 (200920274485. 8)分离纯化。
[0024] 本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)组成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）组成。
[0025] (7)纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
[0026] 本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为_30~50°C、时间为18~26h。
[0027] (8)赋予不同的药用辅助材料，分别制备成注射剂、口服剂、栓剂等，可用于制备抗 卵巢癌药品。
[0028] 本发明的优点和有益效果如下：通过本发明分离纯化的壁虎蛆虫蛋白质 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为 11. 8~12. 6KPa ;用等电聚焦法测定其等电点为pH9. 6~10. 7 ;常规化学法分析结果表明其不 含糖类和磷酸基团；紫外分光光度法分析在260nm和280nm测定纯化的壁虎蛆虫蛋白质含 量为98. 2%;分子结构属非典型、非单一的昆虫蛋白质，链内与链间不含二硫键，其三级结 构构象单元以无规卷曲为主，α螺旋与β折叠的含量比例基本相当。本发明制备的壁虎 蛆虫蛋白质制剂质量稳定，结构清楚，药理明晰，疗效明显，含量可检可测，剂型多样，成本 较低，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对 本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本发明的保护范围中。
[0030] 实施例1: (1)将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 · H2O,加压至2~10MPa，形成膨 胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压 至常压，生成壁虎蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH 3 · H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm ; (7) 纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50°〇、时间18~2611干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0031] 实施例2: (1) 将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液态二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 · H2O,加压至5MPa，形成膨胀溶剂体系，保持 温度15°C，时间20min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成壁虎蛆虫蛋 白质粗品与甲醇-NH 3 · H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径30Mm的微孔过滤器过滤去处固体杂 质； (4) 溶液用孔径IOOnm的超滤机超滤处理，压力0. 5MPa，温度为常温，收集含有相应分 子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化预处理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用1〇~80%的乙腈梯度脱洗，流速 5mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率I. 0KW，频率500KHz，流速200mL/ min，紫外检测器波长260nm ; (7) 纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~40°C、时间20h干燥制备 成冻干蛋白粉。
[0032] 实施例3: (1)将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵，加压至2~10MPa，形成膨胀 溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至 常压，生成壁虎蛆虫蛋白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)溶剂体系中， 用超声驻波液相制备色谱（200920274485. 8 )分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率 500~1000KHz，流速 50~500mL/min，紫外检测器波长 260~280nm ; (7) 纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50°〇、时间18~2611干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0033] 实施例4: (1) 将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至2MPa，时间40min，