甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，特别提供一种甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 姜黄素（curcumin，Cur)提取于植物姜黄（Curcuma longa L.)的干燥根莖，是一种 多酚类化合物，是姜黄色素中的主要活性成分。作为着色剂和色素染料广泛应用于食品领 域。近年来，多项研究表明，姜黄素具有多样的生物活性和药理作用，可作为抗炎药，抗氧 剂，抗肿瘤药，保肝药等，其毒性低，具有良好的临床应用潜力。但是，姜黄素在水中溶解度 小且稳定性差，导致在体内生物利用度差，药物很快在胃肠道内代谢失活，而增大剂量和给 药频率又会增大药物的副作用，限制了姜黄素的临床应用。为了改善姜黄素的溶解度及稳 定性，提高其生物利用度，目前已有姜黄素微乳、聚合物纳米粒、脂质体方面的相关研究。其 中脂质体的研究较为广泛，脂质体在体内具有良好的缓释、靶向性和生物相容性等特点，但 脂质体在体内外不稳定、药物在存放过程中易泄漏；聚合物纳米粒在制备过程会存在残留 单体、有机溶剂、聚合物引发剂等毒性物质，而且所用的生物降解性高分子材料在细胞吞噬 降解后也常产生细胞毒性；微乳存在物理稳定性差，药物在油相的溶解度低等问题限制了 其广泛发展和应用。研究开发姜黄素的新剂型，增加其水溶性，避免被胃肠道代谢失活，提 高血药浓度，延长体内循环时间，提高生物利用度，更好的发挥姜黄素的药理活性，对其临 床应用具有重要意义及广阔的发展前景。
[0003] 纳米脂质载体（nanostructured lipid carrier, NLC)是由固体脂质纳米粒 (solid lipid nanoparticles，SLN)发展而来的一种新型微粒给药系统。以固态的天然或 合成的类脂如卵磷脂、三酰甘油等为载体，向固态脂质中加入化学差异很大的液态油，使 纳米粒结构以结晶缺陷型或无定型存在，将药物包裹或吸附于类脂核中经制成的粒径在 50-1000nm之间的固态胶粒给药体系。NLC由固态脂质和液态脂质混合作为脂质材料制备 而来，由于液态油的加入，扰乱了晶格结构，形成无定型的结构载体，避免药物排挤出来，增 加了载药量和包封率 [23]。也有报道认为，NLC固态脂质包绕小的液态油形成纳米室。当药 物在液态脂质中溶解度远高于固态脂质溶解度时，药物被溶解于液态油中，大大提高载药 量，而且所包绕的固态脂质还起到了缓释的作用 [24]。而且液态油的加入并未影响脂质的晶 体结构，仍以固态形式存在于分散液中。NLC既具备脂质体、乳剂等良好的生理相容性和便 于大规模工业化生产的优点，又具备了聚合物纳米粒稳定性高、药物不易泄漏的特点，同时 优化了 SLN (固体脂质纳米粒，Solid lipid nanoparticles)包封率低，放置药物析出等缺 点，已被越来越多的研究学者关注，成为具有广阔发展前途的药物新型载体。
[0004] 目前，常用的NLC制备方法有溶剂挥发法、高压乳匀法、微乳法、薄膜超声法等。不 同的制备方法对纳米脂质载体的粒径、包封率和稳定性都会产生一定程度的影响。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种具有高包封率及载药量的甘草次酸介导的姜黄素长 循环纳米脂质载体及其制备方法。
[0006] 本发明具体提供了一种甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体，其特征在 于：所述甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体是由姜黄素、单硬脂酸甘油酯、辛 酸/癸酸甘油三酯、甘草次酸-磷脂衍生物、注射用大豆卵磷脂以及Polyoxyethylene 40 Strearate制备得到的，其中，甘草次酸-磷脂衍生物的合成方法为：
[0007] 取GA、DCC、NHS三者溶于除水二氯甲烷中，常温下反应活化3~4h ;另取 DSPE-PEG2qqq-NH2溶于二氯甲烷溶液，逐滴加入上述活化物中，室温氮气保护下反应48~ 50h;过滤除去反应的副产物，加入冰乙醚萃取，除去上清液中未反应的GA，沉淀物质即为 目标产物，DMF复溶后装入透析袋中透析72h，冷冻干燥得到甘草次酸-磷脂衍生物。
[0008] 本发明还提供了所述甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体的制备方法，其 特征在于，制备过程如下：
[0009] 将脂质(单硬脂酸甘油酯和辛酸/癸酸甘油三酯)、甘草次酸-磷脂衍生物和 姜黄素水浴加热至75°C，加入无水乙醇使其溶解，旋转蒸发除去无水乙醇作为油相；在 Polyoxyethylene 40 Strearate中加入注射用水，超声搅拌均匀后水浴加热至75±2-C，作 为水相；磁力搅拌下将水相滴加入同温度油相中，恒温搅拌5min，制得初乳，趁热用超声波 细胞粉碎机超声分散5min，过0. 22 μ m微孔滤膜，室温冰水浴冷却固化，得甘草次酸介导的 姜黄素长循环纳米脂质载体分散液。
[0010] 本发明采用注射用大豆卵磷脂和硬脂酸聚氢氧40酯作复合乳化剂，由于姜黄素 脂溶性一般，直接加入油相中溶解度较差。而将注射用大豆卵磷脂加入油相中，大大增加了 在油相中的溶解度。但是磷脂长时间受热容易氧化变质，从而失去乳化能力并且其降解产 物易导致溶血等不良反应，所以应尽量缩短加热时间。而硬脂酸聚氢氧40酯为水溶性乳化 剂，将其加入到水相中搅拌、超声使之分散。
[0011] 制备纳米脂质载体的过程中，要控制操作温度必须在脂质的熔点以上，油相和水 相均须加热到75°C后混合。室温下将油相滴加或倒入水相时，由于脂质粘度较大，此时温度 低于脂质熔点，油相会很快凝固，操作较困难。而选择磁力搅拌下将热的水相滴加入油相， 再快速分散成初乳，分散效果更均匀，操作简单。
[0012] 本发明所述甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体的制备方法，其特征在 于：在用超声波细胞粉碎机超声分散的5min里，超声ls，间歇Is。
[0013] 本发明所述甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体的制备方法，其特征在 于：将水相滴加入同温度油相中时，滴加速度为IOmL iin'滴加速度过快时，脂质相与水 相分层，难以得到均匀分散液。
[0014] 将水相滴入油相时，须进行高速搅拌。搅拌速度越高所得初乳粒径越小，体系越稳 定；但搅拌速度过高会使油相溅到瓶壁上,造成材料和药物的损失。搅拌速度过慢会造成两 相混合不匀，油相浮在水相上层，不能形成稳定的初乳，影响下一步纳米脂质载体的制备。 经反复实验，选择以3000r · rnirT1作为制备初乳的搅拌速度。
[0015] 在75°C、3000r · rnirT1搅拌5min条件下制备初乳后，趁热将初乳进行探头超声处 理，以粒径、包封率为指标，考察超声功率及时间对NLC的影响。实验发现，超声功率越大， 提供的破坏能力越强，纳米脂质载体的粒径越小。但功率过大会导致纳米粒的粒度分布不 均匀，体系表面自由能过大而不稳定。而超声功率过小，提供的破坏能力不足以破坏微乳， 得到足够小的粒子。因此，选择超声功率为400W。
[0016] 超声后的纳米脂质分散液需要立即降温并且维持足够长的冷却时间才能使纳米 粒得到足够固化，稳定。降温速度太慢或冷却时间过短会导致粒子聚集，粒径增大，体系的 稳定性降低，导致实验失败。本发明分别选择室温冰水浴冷却和水浴冷却两种方式进行比 较。结果表明，室温水浴下冷却固化速度缓慢，粒径较大且灯光下澄清度较差。因此优选 0~2 °C冰水浴迅速冷却固化。
[0017] 本发明所述甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体的制备方法，其特征在 于，所用原料的质量比为姜黄素：单硬脂酸甘油酯：辛酸/癸酸甘油三酯：甘草次酸-磷脂 衍生物：注射用大豆卵憐脂：Polyoxyethylene 40 Strearate=I :28 ~30 :12 ~13 :6 ~7 : 9~10 :31~32。最优选为姜黄素：单硬脂酸甘油酯：辛酸/癸酸甘油三酯：甘草次酸-磷 脂衍生物：注射用大豆卵磷脂：Polyoxyethylene 40 Strearate=I :29 :12. 5 :6. 2 :9. 1 :32。
[0018] 本发明所述甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体的制备方法，其特征在 于：所述甘草次酸-磷脂衍生物的合成方法中，GA、DCC、NHS三者的摩尔比为1. 5:1. 2:1. 2。
[0019] 本发明所述甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体的制备方法，其特征在 于：所述甘草次酸-磷脂衍生物的合成方法中，DSPE-PEG_-NH 2、GA、DCC、NHS的摩尔比为 1 :1· 5:1. 2:1. 2。
[0020] 本发明所述甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体的制备方法，其特征在 于：甘草次酸-磷脂衍生物的加入量为总脂质用量的5~15%(W/W)，其中最优选为10%(W/ W)，经过大量实验证明，当甘草次酸-磷脂衍生物的加入量为总脂质用量的10%时，所得纳 米脂质载体具有最强的肿瘤细胞杀伤作用。
[0021] 本发明所述甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体的制备方法，其特征在 于，所述甘草次酸介导的姜黄素长循环纳米脂质载体的最优制备工艺如下：
[0022] 原料； 姜黄素 IOmg 单硬脂酸廿油酯 290 mg 卡酸/癸酸It油5酯 125 mg 注射用大豆卵磷脂 tH mg Polyoxyethylene 40 Strearate 320 mg 注射坩水加至 WmL
[0023] 取GA、DCC、NHS三者溶于IOmL的除水二氯甲烷中，常温下反应活化3h ;另取Immol DSPE-PEG2qqq-NH2溶于5mL的二氯甲烷溶液，逐滴加入上述活化物中，室温氮气保护下反应 48h;过滤除去反应的副产物，加入冰乙醚萃取，除去上清液中未反应的GA，沉淀物质即为 目标产物，DMF复溶后装入透析袋中透析72h，冷冻干燥得到甘草次酸-磷脂衍生物；
[0024] 称取处方量的单硬脂酸甘油酯、辛酸/癸酸甘油三酯、甘草次酸-磷脂衍生物、注 射用大豆卵磷脂和姜黄素水浴加热至75°C，加入5ml无水乙醇使其溶解，旋转蒸发除去无 水乙醇得到混合均匀的熔融相作为油相，其中甘草次酸-磷脂衍生物的加入量为总脂质用 量的10%(w/w);称取处方量的Polyoxyethylene 40 Strearate,加入注射用水，超声搅拌均 匀后水浴加热至75°C，作为水相；在3000r ^mirT1磁力搅拌下将水相滴加入同温度油相中， 滴加速度控制在IOmL · mirT1 ;恒温搅拌5min，制得初乳，趁热将初乳用超声波细胞粉碎机 再分散，超声功率