)炎性体调节过程。近年来,N0D2已经被证实在金黄色葡萄球菌皮肤和全身感染期间与炎症反应和宿主防御有关。作为一种常见的NLRs衔接分子，受体相互作用蛋白2 (receptor interacting protein2,RIP2)已知与胞内菌(如单核细胞增多性李斯特氏菌Listeria monocytogenes、肺炎嗜衣原体Chlamydophila pneumonia、嗜肺军团菌 Leg1nella pneumophila、结核分支杆菌 Mycobacterium tuberculosis)的宿主防御有关，但其在肺部感染中对于胞外菌(如金黄色葡萄球菌)的宿主防御中所起的作用在很大程度上仍是个未知数。由于肺部启动固有免疫反应的方式与皮肤和全身感染有所不同，我们旨在探寻NLR识别通路对于肺部金黄色葡萄球菌的宿主防御的贡献。在本发明中，发明人发现RIP2介导反应在针对金黄色葡萄球菌所引起的肺部感染的固有免疫反应和细菌廓清中扮演重要角色。我们进一步证实RIP-2在固有免疫中的作用很大程度上依赖于IL-1 β介导的中性粒细胞生成。
[0044]RIP2+的构建方法参见 Chin Al, Dempsey Pff, Bruhn K, Miller JF, Xu Y, ChengG.1nvolvement of receptor-1nteracting protein2in innate and adaptive immuneresponses.Nature2002; 416:190-194。TLR2 和 TLR9 双敲除小鼠由 TLR2 敲除小鼠和 TLR9敲除小鼠繁育，TLR2敲除小鼠由Cheng Lab.UCLA提供，TLR9敲除小鼠由Cheng Lab.UCLA提供。IL-1R+和WT菌落均在UCLA的同一个无特定病原体设施中保存。
[0045]各实施例中所使用的小鼠均为C57BL/6J基因背景，且年龄性别均相同。
[0046]本发明实施例中所使用的金黄色葡萄球菌菌株SHlOOO由UCLA皮肤科提供。
[0047]将金黄色葡萄球菌在胰化蛋白大丑培养基(TSB)中，于37°C下在温控摇床培养过夜(200rpm)。将所得培养液按照1:50的比例稀释，继续培养4小时后获得处于对数生长期的细菌，细菌浓度的测量方法为:600nm (A600 ；DU640B spectrophotometer ；BeckmanCoulter)。将培养液稀释后平板接种至TSB琼脂过夜后确认菌落形成单位。
[0048]金黄色葡萄球菌的小鼠感染方法为:通过腹腔内注射氯胺酮(ketamine)和甲苯噻嗪(xylazine)的混合物将小鼠麻醉,将气管暴露后通过26-gauge针给予3X 17CFU的30ul PBS，再对皮肤切口进行缝合。
[0049]在指定时间点，使用戊巴比妥对小鼠实行安乐死。通过肝素化注射器从右心室中收集血样，按照1:2的比例使用PBS连续稀释后，平板接种于TSB琼脂上测量血液CFU。在移除肺部以前，通过在右心室灌输含有5mM EDTA的Iml PBS对肺血管进行灌注。整个肺部在Iml含有蛋白酶抑制剂混合物(罗氏应用科学)的PBS中匀质，所得匀浆使用PBS按照1:5的比例进行连续稀释后，平板接种于TSB琼脂上测量肺部CFU。
[0050]肺组织匀浆中的MPO活性通过Sigma检测试剂盒测定，具体操作方法参见试剂盒说明。
[0051]支气管肺泡灌洗(BAL)的操作方法为:徐徐滴入5ml PBS (每Iml PBS中含有5mMEDTA)，最后收回4ml灌洗液。收集最先的Iml支气管肺泡灌洗液的上清液，于_20°C储存，以备细胞因子检测使用。将各组灌洗细胞合并，低渗溶液溶菌后进行计数。制备细胞离心涂片器(Shandon Inc., Thermo Electro Corp),使用Diff-Quik确定细胞的数量和差异。灌洗细胞含有95%以上未感染小鼠的肺泡巨噬细胞。
[0052]在肺组织学分析中，将肺样本于10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋。在UCLA的TissueProcurement and Histology Core Laboratory and Histopathology Laboratory中，进行苏木精-伊红染色(H&E stain)。
[0053]从小鼠胫骨和大腿骨中分离骨髓，并分化为骨髓巨噬细胞(方法参照 Doyle S, Vaidya S，O，Connell R, Dadgostar H, Dempsey P, Wu T, Rao G, SunR,Haberland M,Modlin R, et al.1RF3mediates a TLR3/TLR4_specificantiviral gene program.1mmunity2002;17:251-263 ； 和 Iyer SS,GhaffariAA,Cheng G.LipopoIysaccharide-mediated IL-1Otranscript1nal regulat1nrequires sequential induct1n of type I IFNs and IL-27 in macrophages.JImmunol2010; 185:6599-6607)。七天后，将可用的骨髓巨噬细胞通过金黄色葡萄球菌刺激(感染复数，MO1:10)。在指定时间收集细胞上清液进行细胞因子的检测。
[0054]小鼠IL-1 β，IL-6, KC, MIP2 和 TNF-α 的 ELISA 检测试剂盒购自 R&DB1sciences，因子水平的检测方法参考厂商说明书。
[0055]重组小鼠白细胞介素-1 β的给予:在体内试验中，将一剂量的活性重组小鼠白细胞介素-1 β (500ng/30ul)重悬于含有1%BSA的PBS中，通过盐水与金黄色葡萄球菌的气管培养液(3X 107CFU/30ul)—起给予RIP缺陷小鼠。模拟组给予0.1%BSA的生理盐水。在感染24小时以后进行肺部细菌负荷和肺组织匀浆MPO活性的测定。
[0056]统计方法:存活曲线使用对数秩检验进行比较。对于其他数据的统计显著性，通过 2tailed unpaired t test, 2-tailed Mann-ffhitney U test 确定 CFU 数据，视情况使用1-way ANOVA corrected多重比较法。P取值小于等于0.05,则被认为在统计学上是显著的。所有计算均使用GraphPad Software Inc.的Windows的Prism软件程序。CFU数据中的横条为各例的平均值，各图中的误差条表示结构方程模型(SEM)和重复数据。
[0057]实施例1
[0058]RIP2缺陷使动物对金黄色葡萄球菌易感:
[0059]我们首先使用WT C57BL/6J动物建立金黄色葡萄球菌肺炎小鼠模型，然后通过气管内给予不同剂量的金黄色葡萄球菌，在WT动物中以I X 18CFU为致死剂量(LD80的标准为在48-72h内造成80-100%动物安乐死)，I X 17CFU为LD2。。
[0060]为了证实细胞溶质类模式识别受体NLRs对于肺部金黄色葡萄球菌宿主防御的关键作用，本发明发明人对金黄色葡萄球菌肺部感染的RIP-2蛋白缺陷转基因小鼠(RIP2+)进行研究(RIP2是一种由NODl和N0D2信号传导的普通衔接分子)。尽管金黄色葡萄球菌是一种胞外菌，但是在RIP2+小鼠感染24h以后，其肺部CFU显著上升且全身扩散。比较后可知，TLRs (通过TLR2识别革兰氏阳性菌细胞壁表面结构，通过TLR9识别细菌DNA的CpG基序)在对于金黄色葡萄球菌肺部感染的宿主防御中，并没有起到相对较大的作用。与WT控制组相比，TLR2和TLR9双缺陷动物在细菌廓清能力上仅表现出微弱的损伤，在统计学上并不具有实际意义(如图1A和IB所示)。我们进一步将注意力放在了 RIP2缺陷动物的后续研究上，并发现相对于类似的WT控制组，RIP2+动物