波法制备的mPEG-Gal-CS纳米颗粒粒径分别为约300mm、690mm与800mm ；在pH为5.0的情况下，浓度分别为0.5g/L、lg/L与2g/L的TPP溶液对应的超声波法制备的mPEG-Gal-CS纳米颗粒粒径分别为约570mm、280mm与600mm。
[0038]就上述情况而言，制备mPEG-Gal-CS纳米颗粒的最佳条件为pH5.0以及TPP浓度为lg/L ;制备方法为磁力搅拌法。
[0039]mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl的复合
[0040](l)mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl的复合方法
[0041]采用两种不同的复合方法将mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP_Nl以10:50的比例混合。
[0042]第一种制备方法为:将mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP_Nl分别在50°C下保温15min，然后涡旋混匀，制备成载质粒纳米复合物。
[0043]第二种制备方法:将mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP_Nl以10:50的比例混合在一起，在50°C下保温15min，然后涡旋混匀，制备成载质粒纳米复合物。
[0044]在图3中，附图标记I表示Maker的泳道；附图标记2表示裸质粒pEGFP_Nl的泳道；附图标记3表示先预热再混合所得的mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl复合物的泳道；附图标记4表示先混合再预热所得的mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl复合物的泳道。
[0045]如图3中所示，无论是先预热再混合所得的mPEG-Gal-CS纳米颗粒还是先混合再预热所得的mPEG-Gal-CS纳米颗粒均未跑出泳道。由此说明，上述两种方法均能使mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl较好的复合在一起。
[0046](2)不同pH对mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP_Nl的复合能力的影响
[0047]质粒pEGFP-Nl经E.coli DH5 α扩增培养后，利用天根公司的质粒抽提试剂盒，按照操作步骤说明进行抽提。
[0048]在图4中，附图标记I表示Maker的泳道；附图标记2表示裸质粒pEGFP_Nl的泳道；附图标记3至14分别表示mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl的复合物的泳道。
[0049]需要说明的是，在附图标记3、4以及5表示的泳道处pH为3.0 ;在附图标记6、7以及8表示的泳道处pH为5.5 ;在附图标记9、10以及11表示的泳道处pH为7.0 ;并且在附图标记12、13以及14表示的泳道处pH为11.0。
[0050]如图4中所示，不同pH下，mPEG-Gal-CS带有不同数目的正电荷，这会显著影响mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl的复合能力。随着pH的升高，mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒PEGFP-Nl的复合能力显著下降。图4中所示的凝胶阻滞电泳结果显示，在pH为3与5.5的情况下，电泳时，质粒pEGFP-Nl被完全阻滞在泳道处，由此说明mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl具有较强的复合能力。而随着随着pH的升高，在pH7.0与pHll.0时，质粒pEGFP-Nl在电泳时跑出电泳孔，由此说明mPEG-Gal-CS纳米颗粒带正电荷数减少或者不带有正电荷，mPEG-Gal-CS与质粒pEGFP-Nl的复合能力显著降低。
[0051](3)不同的mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP_Nl体积比对复合能力的影响
[0052]为了便于描述将mPEG-Gal-CS纳米颗粒简单称作NP。
[0053]在图5中，附图标记I表示Maker的泳道；附图标记2表示NP:裸质粒pEGFP_Nl=10:10的泳道；附图标记3表示NP:裸质粒pEGFP-Nl = 10:30的泳道；附图标记4表示NP:裸质粒pEGFP-Nl = 10:50的泳道；附图标记5表示裸质粒pEGFP-Nl的泳道。
[0054]参见图5，NP与质粒pEGFP-Nl复合后，NP可完全包裹质粒pEGFP-Nl。在电泳时，NP与质粒pEGFP-Nl的复合物均被阻滞在泳道，没有跑出。而裸质粒在电泳过程中呈现出完整的条带。
[0055]mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP_Nl复合物的DnaseI抗性实验
[0056]脱氧核糖核酸酶I (Deoxyribonuclease I，DnaseI)是将单链或双链DNA同等程度地随机分解，生成具有5’ -P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。
[0057]在图6中，附图标记I表示Maker2000的泳道；附图标记2表示混有DnaseI的1ul裸质粒pEGFP-Nl的泳道；附图标记3表示混有DnaseI的NP:裸质粒pEGFP-Nl = 10:10的泳道；附图标记4表示混有DnaseI的30ul裸质粒pEGFP-Nl的泳道；附图标记5表示混有DnaseI的NP:裸质粒pEGFP-Nl = 10:30的泳道；附图标记6表示混有DnaseI的50ul裸质粒pEGFP-Nl的泳道；附图标记7表示混有DnaseI的NP:裸质粒pEGFP-Nl = 10:50的泳道。
[0058]参见图6，mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP_Nl复合后，裸质粒pEGFP-Nl不受DNaseI水解作用的影响。不同体积比制备的载质粒纳米复合物均能够较好的保护裸质粒，使其不受DNaseI水解作用的影响。而裸质粒pEGFP_Nl在加入DNaseI后全部被水解成小片段，琼脂糖凝胶电泳检测不到DNA条带。
[0059]不同mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP_Nl体积比的血清稳定性试验
[0060]mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl分别以10:30、10:50的体积比混合在一起，然后将上述不同体积比的mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl复合物分别加入浓度为5%与50%的血清中37摄氏度分别保持6hr、24hr、48hr以及72hr。
[0061]在图7A 与图 7B 中，Hl:6hr ；H2:24hr ；H3:48hr ；H4:72hr ；M:maker(2000)；
[0062]1:加有5%血清的体积比为10:30的mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP_Nl的复合物的泳道；2:加有50%血清的体积比为10:30的mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl的复合物的泳道；3:加有5%血清的体积比为10:50的mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl的复合物的泳道；4:加有50%血清的体积比为10:50的mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl的复合物的泳道；5:加有5%血清的30ul裸质粒pEGFP-Nl的泳道；6:加有50%血清的30ul裸质粒pEGFP-Nl的泳道；7:加有5%血清的50ul裸质粒pEGFP-Nl的泳道；8:加有50%血清的50ul裸质粒pEGFP-Nl的泳道；
[0063]参见图7A与图7B，mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl复合后，可以保护质粒PEGFP-Nl不受血清中酶的水解作用的影响。不同体积比制备的载质粒纳米复合物均能够较好的保护质粒，不受血清中酶的水解作用的影响。而裸质粒在加入血清后全部被水解成分子量较小的片段。随着保温时间的延长，mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒复合物中的质粒也会部分被降解。
[0064]本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
【主权项】
1.一种以壳聚糖为母体的纳米基因复合物，其特征在于，壳聚糖分子经化学修饰引入聚乙二醇和半乳糖基配体合成HiPEG-Ga 1-CS，所述mPEG_Ga 1-CS的纳米颗粒与质粒pEGFP-Nl复合而制备出所述以壳聚糖为母体的纳米基因复合物。
2.—种制备权利要求1所述的以壳聚糖为母体的纳米基因复合物的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一 AijSmPEG-Gal-CS纳米颗粒:取冰乙酸加入四蒸水中，混勾制成醋酸溶液；取CS粉末溶于所述醋酸溶液中制成CS溶液；用NaOH溶液调节所述CS的pH ;称取TPP粉末加入四蒸水中制成TPP溶液；取两只烧杯盛放所述CS溶液，向所述CS溶液中缓慢滴加所述TPP溶液，直至出现乳光现象为止，然后将出现所述乳光现象的溶液在磁力搅拌器上搅拌； 步骤二:制备出以壳聚糖为母体的纳米基因复合物:先使所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl混匀，然后使混匀的所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl在一定温度下保温一定时间，或者先将所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl分别在一定温度下保温一定时间，然后将在所述温度下保温所述时间后的所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl混勾。
3.—种制备权利要求1所述的以壳聚糖为母体的纳米基因复合物的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一 AijSmPEG-Gal-CS纳米颗粒:取冰乙酸加入四蒸水中，混勾制成的醋酸溶液；称取CS粉末溶于所述醋酸溶液中制成的CS溶液；称取TPP粉末加入四蒸水中制成TPP溶液；取两只干净的烧杯盛放所述CS溶液，向所述CS溶液中缓慢滴加所述TPP溶液，直至出现乳光现象为止，然后将出现所述乳光现象的溶液在超声仪中超声处理； 步骤二:制备出以壳聚糖为母体的纳米基因复合物:先使所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl混匀，然后使混匀的所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl在一定温度下保温一定时间，或者先将所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl分别在一定温度下保温一定时间，然后将在所述温度下保温所述时间后的所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl混勾。
4.如权利要求2或3所述的一种制备以壳聚糖为母体的纳米基因复合物的方法，其特征在于，所述TPP溶液的浓度为0.5?2g/L，所述pH为3?5，所述所述醋酸溶液的体积分数为2%，并且所述CS溶液的浓度为2g/L。
【专利摘要】本发明提供了一种以壳聚糖为母体的纳米基因复合物，经化学修饰引入聚乙二醇和半乳糖基配体合成mPEG-Gal-CS，所述mPEG-Gal-CS的纳米颗粒与质粒复合而制备出所述以壳聚糖为母体的纳米基因复合物。本发明的有益效果在于，在Gal分子中引入PEG和Gal基配体，增加壳聚糖的水溶性、缓释性和肝靶向性，提高基因转染效率，从而获得一种高效、缓释、肝靶向的基因载体系统。
【IPC分类】A61P35-00, A61K47-36, A61K48-00, A61K9-14, A61K31-7105
【公开号】CN104758940
【申请号】CN201510149455
【发明人】杨艳, 靳计婷
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月31日