齐墩果酸在制备治疗肥胖症药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药领域，具体地说，是涉及一种齐墩果酸在制备治疗肥胖症药物中的应用。
【背景技术】
[0002]最新研宄将胆汁酸信号分子作为治疗代谢紊乱的新靶标加以强调，包括肥胖与2型糖尿病的治疗。现已确定两种主要的胆汁酸信号调节分子:FXR与GPBAR-1/TGR5。FXR是转录因子，能直接调节基因表达。相反，TGR5为胆汁酸膜受体，能启动下游信号通路从而间接影响基因表达。TGR5在不同组织中表达广泛而又不尽相同。疏水性胆汁酸，如LCA和DCA，是TGR5强效内源性激动剂。从功能上讲，TGR5能够调节胆汁酸代谢、糖代谢、褐色脂肪组织能量代谢及炎症。近来，TGR5在调节肥胖及糖尿病中的作用备受关注，但机制尚不清楚。
[0003]肥胖及其合并症一一糖尿病，因缺乏有效治疗而达到惊人的流行程度，寻找新的医学治疗措施迫在眉睫。近来，miRNAs作为人类疾病潜在的治疗新靶标得到了大量的关注，包括治疗肥胖与糖尿病。其中，miR-26a在众多生物效应中发挥多种功能，包括调节代谢。最近，我们发现miR-26a能够阻止肥胖诱导的胰岛素抵抗及肝脏过多合成脂质，表明miR_26a可作为提高胰岛素敏感性及抑制脂质、糖合成的潜在新靶标。然而，miR-26a表达的调节仍不清楚，发展增加miR-26a表达的技术仍有挑战。而齐墩果酸(OA)是从橄榄叶中提取的三萜类化合物，其是否能在体外激活TGR5，从而控制小鼠体重及降低高血糖，是本发明下述研宄的目的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供齐墩果酸在制备治疗肥胖症药物中的应用。
[0005]本发明所述的齐墩果酸(OA)是从橄榄叶中提取的三萜类化合物，能在体外激活TGR5，从而控制小鼠体重及降低高血糖，能在制备治疗肥胖症药物中的应用。
[0006]本发明的特点和优点为:GPBAR1/TGR5是胆汁酸膜G蛋白偶联受体。TGR5因能够调节胆汁酸稳态及能量代谢为大家所知。最新研宄特别强调了 TGR5在减肥及调节糖代谢中的作用，但是，这两种作用机制尚不明了。这里我们将探讨天然化合物齐墩果酸(OA)治疗肥胖及降低血糖过程中TGR5的必要性。通过对比齐墩果酸(OA)治疗后野生型小鼠与TGR5+小鼠肝脏miRNAs谱的表达，我们认为miR_26a为TGR5激活的新型下游靶基因。胆汁酸喂养小鼠诱导miR-26a的表达依赖TGR5而非FXR。TGR5的激活能大大增加巨噬细胞及Kupffer细胞中miR-26a的表达。此外，我们认为TGR5激活诱导miR_26a的表达需要通过JNK信号通路。值得注意的是，我们还把TGR5反应的DNA元件定位在miR_26a前体的近侧端，此处与宿主基因的转录无关。这些结果将首次阐述TGR5调节miR-26a表达的新机制，同时将胆汁酸信号调节代谢作用与miRNAs调节通路联系起来。实验表明:TGR5作为天然化合物齐墩果酸(OA)的主要受体(而非唯一受体)对抗肥胖及降低血糖的作用。I)齐墩果酸(OA)能够减少野生型小鼠体脂的聚积，但这种作用在TGR5+小鼠身上不能得以体现。这些结果明确指出TGR5能够调节OA诱导的减肥效应。2)齐墩果酸(OA)对TGR5+也有些微功效，这归因于OA对FXR或其他蛋白质有着轻微的激活作用。经过OA治疗，可显著提高野生组小鼠、而非TGR5+的糖耐量，表明OA提高糖耐具有TGR5依赖性。
【附图说明】
[0007]图1-A为野生型小鼠各组每周体重变化图，以说明TGR5介导OA对肥胖的抑制效应。
[0008]图1-B为TGR5-/-小鼠各组每周体重变化图，以说明TGR5介导OA对肥胖的抑制效应。
[0009]图1-C为喂养第16周时各组平均体重比较图，与普通饮食组比较，* P < 0.05,,以说明TGR5介导OA对肥胖的抑制效应。
[0010]图2-A为野生型小鼠各组GTT结果图，以说明TGR5介导OA提高糖耐受效。
[0011]图2-B为TGR5-/-小鼠各组GT结果图，以说明TGR5介导OA提高糖耐受。
[0012]图3-A为野生型与TGR5K0小鼠肝脏miR_26a表达水平图，以说明TGR5对小鼠肝脏表达miR-26a的激活效应。
[0013]图3-B为野生型与TGR5K0小鼠肝脏miR-16表达水平图，以说明TGR5对小鼠肝脏表达miR-26a的激活效应。
[0014]图3-C为野生型小鼠各组肝脏表达miR_26a相对水平图，以说明TGR5对小鼠肝脏表达miR-26a的激活效应。
[0015]图3-D为野生型与TGR5-/-小鼠肝脏表达miR_26a相对水图，以说明TGR5对小鼠肝脏表达miR-26a的激活效应。
[0016]图4-A为Kupffer细胞中4种miRNA表达的倍数变化图，与CON组比较，* P < 0.05，以说明TGR5激活对巨噬细胞表达miR-26a的诱导效应。
[0017]图4-B为1uMOA作用于骨髓巨噬细胞后miR-26表达结果图；与CON组比较，* P
<0.05，以说明TGR5激活对巨噬细胞表达miR-26a的诱导效应。
[0018]图4-C为不同剂量OA作用于RAW264.7细胞后miR_26a表达结果图，与DMSO组比较，* P < 0.05，以说明TGR5激活对巨噬细胞表达miR-26a的诱导效应。
[0019]图4-D为OA作用不同时间RAW264.7细胞miR_26a表达结果图，以说明TGR5激活对巨噬细胞表达miR-26a的诱导效应。
[0020]图5-A为OA作用不同时间及是否加H89对RAW264.7表达miR_26a的影响图，以说明JNK信号通路参与TGR5介导的miR-26a表达诱导效应。
[0021]图5-B为RAW264.7细胞中不同抑制剂对OA诱导miR_26a表达的影响图；与BMS、PD组比较，* P < 0.05，以说明JNK信号通路参与TGR5介导的miR_26a表达诱导效应。
[0022]图5-C为Kupffer细胞中不同抑制剂对OA诱导miR_26a表达的影响图；与BMS、PD组比较，* P < 0.05，以说明JNK信号通路参与TGR5介导的miR_26a表达诱导效应。
[0023]图5-D为骨髓巨噬细胞中不同抑制剂对OA诱导miR_26a表达的影响图，与DMS0、对照组比较，* P < 0.05，以说明JNK信号通路参与TGR5介导的miR_26a表达诱导效应。
[0024]图5-E为Kupffer细胞中JNK对OA诱导miR_26a表达的影响图，与JNK-/-比较，*P < 0.05，以说明JNK信号通路参与TGR5介导的miR_26a表达诱导效应。
[0025]图6-A为RAW 264.7细胞中OA作用不同时间对前体miR_26a表达的影响图，以说明OA反应元件位于miR-26a启动子近侧端。
[0026]图6-B为RAW 264.7细胞中OA作用对宿主基因miR_26a表达的影响图，以说明OA反应元件位于miR-26a启动子近侧端。
[0027]图6-C为miR-26a不同调控区域PGL-3荧光素酶载体转染OA作用后，RAW264.7细胞中相对荧光素酶活性的鉴定图，以说明OA反应元件位于miR-26a启动子近侧端。
[0028]图6-D为以PGL3荧光素酶为载体克隆miR-26a_2上游调控区图，以说明OA反应元件位于miR-26a启动子近侧端。
[0029]图6-E为不同载体转染OA作用后RAW264.7细胞中相对荧光素酶活性的鉴定图，以说明OA反应元件位于miR-26a启动子近侧端。
【具体实施方式】
[0030]本发明将讨论TGR5作为天然化合物OA的主要受体(而非唯一受体)对抗肥胖及降低血糖的作用。TGR5可通过JNK依赖信号通路增加巨噬细胞中m