益生菌双层微胶囊及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，具体涉及益生菌双层微胶囊及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 目前，各种益生菌的保健作用得到普遍认可。在治疗腹泻等胃肠道疾病中，益生菌 制剂广泛使用，起到了重要的辅助治疗作用。据实际应用显示，该种制剂对储存环境有严格 要求，尤其是需密封冷藏，使用者一旦忽视所述的储存条件，容易使药品失效。研究显示，益 生菌对氧气极为敏感，对上消化道内的低PH(如胃酸等）的抵抗力较差，因此长时间不良方 式贮存，再经过口服后，能以活性状态定植肠道的菌数量不多，其产品也存在着保存性差、 随保存时间延长活菌数急剧下降等缺点，使益生菌的有效应用受到了极大的限制。
[0003] 微胶囊是利用天然或合成的高分子材料（统称囊材），将囊心物包埋成微小致密 的囊。常用的微胶囊壁材主要有海藻酸盐等碳水化合物类物质。微胶囊包埋技术可显著提 高益生菌耐氧和抗胃酸能力，使其以活性状态到达肠道，进而发挥相应的功效。研究显示， 即使是以传统海藻酸钠单层胶囊包埋益生菌，因其微观的eggbox结构储有大量水，却无法 防止水分蒸发，因此，仍存在易过度失水导致长时间贮藏后变形干硬、随保存时间延长活菌 数下降的缺点，等等。
[0004] 本申请的发明人拟提供益生菌双层微胶囊及其制备方法，使产生较好的耐酸性与 肠溶性，且比传统单层囊具有更好的贮存稳定性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目地是提供一种益生菌双层微胶囊。
[0006] 本发明的进一步目地是提供益生菌双层微胶囊的制备方法。
[0007] 本发明针对现有技术存在的缺陷进行了改进，鉴于大多数益生菌对O2及上消化道 内低PH较为敏感，为提高益生菌对外界不良环境的耐受程度，并改善传统单层囊易失水导 致菌体死亡的问题，本发明对传统单层胶囊包埋益生菌增加第二层膜防止失水，制得益生 菌双层微胶囊。
[0008] 本发明采用高压均质乳化法，以双歧杆菌为实验对象，先用海藻酸钠与氯化钙交 联包裹形成耐酸的保护层，再用壳聚糖与氯化钙交联形成防失水的双层微胶囊；结果表明， 制得的双层微胶囊具有较好的耐酸性与肠溶性，比传统单层囊具有更好的贮存稳定性。
[0009] 本发明的益生菌双层微胶囊，益生菌双层微胶囊，包括活性成分和胶囊壁，其特征 在于，所述的胶囊壁包括保护层和防失水层，所述的保护层是采用海藻酸钠与氯化钙交联 包裹形成耐酸的保护层，所述的防失水层是采用壳聚糖与氯化钙交联形成防失水层。
[0010] 本发明采用高压均质乳化法，以海藻酸钠、壳聚糖为囊材与氯化钙交联成双层膜， 以双歧杆菌为实验对象，设计L9(34)正交实验，制得最佳双层型微胶囊。
[0011] 更具体的，本发明提供了制备益生菌双层微胶囊的方法，其特征在于，其包括步 骤：
[0012] 1，通过单因素实验确定各因素的水平范围，
[0013] 2,再通过L9 (34)正交实验，筛选最佳双层型微胶囊；
[0014] 3,得到最佳配方后进行性质综合实验，包括模拟耐胃酸、肠溶、贮藏实验，并进行 对照，证实其性质。
[0015] 本发明中，采用菌粉与壁材原料混合，加去离子水，以200Bar高压均质乳化 lOmin。所得乳液快速滴入CaCl2溶液（固化液）静置固化20min。收集洗涤胶囊后植入壳 聚糖与CaCl2溶液成膜20min，再次收集洗涤即得双层型微胶囊微胶囊；
[0016] 其中，微胶囊包埋产率的测定：包埋产率=微胶囊菌数/加入菌数X100% ;
[0017] 微胶囊菌数测定：将微胶囊溶于2.OMol/L磷酸盐缓冲液（pH=7. 0)的破壁液中，待 完全溶解后计数。
[0018] 本发明中，进行了微胶囊制备的单因素实验：
[0019] 实验通过单因素实验测定不同海藻酸钠浓度（I. 5%、2. 5%、3. 5%)XaCl2:浓度（1%、 2%、3%)、乳糖浓度（4%、5%、6%)、壳聚糖浓度（0.1%、0.2%、0.3%)对微胶囊包埋产率的影响， 以确定正交实验水平范围。
[0020] 本发明中，进行了微胶囊制备的正交实验：
[0021] 在单因素实验结果的基础上，根据上述单因素实验结果对部分因素的水平进行调 整，采用L9(34)正交试验，以微胶囊的包埋产率为评价指标，选择最佳配比。因素水平如表 1所示。
[0022] 表1:因素水平表
[0023]
[0024] 本发明中，进行了双层微胶囊性质的综合实验：
[0025] 在正交实验结束后，筛选出的最佳配比微胶囊进行性质研究，为保证实验数据准 确，实验均在无菌环境下操作进行；
[0026] (1)双层囊的镜下观察：取微胶囊置于载玻片，镜下观察并拍照。
[0027] (2)双层囊的耐酸性能：取微胶囊置于盛有模拟胃液中pHl. 2,37°C条件下180r/ min振荡lh，每20min取样称量溶解质量计算解囊率，并计算菌体存活率；Ih后人工解囊活 菌计数，并以普通菌液作空白对照；
[0028] 解囊率=现有质量/原有质量X100% ;
[0029] 活菌率=解囊后活菌数/包埋前活菌数X100%。
[0030] (3.)双层囊的肠溶性能：取微胶囊置于模拟肠液中pH8. 0,在摇床上37°C、180r/ min进行崩解，每20min取样称量溶解质量计算解囊率，人工解囊后活菌计数，计算活菌率。
[0031] (4)单双层囊贮藏对照实验：取微胶囊置入玻璃瓶中，敞开式置于超净工作台48h 后人工解囊后活菌计数，计算活菌率。并以单层海藻酸钠微胶囊以及普通菌液作空白对照。
[0032] 结果显示，本发明针对传统的单层囊易失水导致胶囊变形、菌体死亡的问题，在单 层囊基础之上增加壳聚糖膜防止失水制成双层囊能提高益生菌的稳定性。采用高压均质 乳化法，在海藻酸钠浓度为3%，氯化钙浓度为4%，乳糖浓度为3%时，壳聚糖浓度为0. 2%的 条件下，包埋产率最高，达到91. 2%，活菌率达89. 7%，所得双层囊具有良好的耐酸性及肠溶 性，在模拟37°C胃酸中处理Ih后活菌率仍达78. 3%，在肠液中20min内释放完毕，保证了益 生菌以活性状态定植肠道。
[0033] 本发明制得的双层囊与单层囊贮存对照实验结果显示，具有良好的贮藏性能，双 层囊在48h及15d的活菌率分别达到84. 6%和79. 6%，而单层囊仅有76. 2%和59. 7%，无包 埋组几乎为0。相对于传统的单层海藻酸钠微胶囊，本发明的双层囊有着显著的防失水能 力，能克服因保存时间延长菌体存活率下降的缺点，突破了这个应用限制。本方法制得的微 胶囊采用的原料是食品行业普遍使用的原料，无生物毒性。本实验方法操作简单，原料成本 低，能明显提高了菌体存活率，性价比较高。
[0034] 说明书附图
[0035] 图1 :海藻酸钠浓度对包埋率的影响。
[0036] 图2 :壳聚糖浓度对包埋率的影响。
[0037] 图3 :CaCl2浓度对包埋率的影响。
[0038] 图4 :乳糖浓度对包埋率的影响。
[0039] 图5 :双层微胶囊外观。
[0040] 图6 :在胃液中的耐酸情况。
[0041] 图7:菌体耐酸对照。
[0042] 图8:48h后的单层囊。
[0043] 图9 :48h后的双层囊。
【具体实施方式】
[0044] 本实施例中，采用的主要试剂：海藻酸钠（化学纯）、无水氯化钙（分析纯）、市售 光明牌脱脂奶粉、乳糖（分析纯）、壳聚糖（化学纯）、胰酶、胃酶。以上试剂均为国产；
[0045] 主要仪器：PanDalOOO+高压均质机、T0MYSX-700高压蒸汽灭菌锅、上净CA920超净 工作台、培英THZ-C恒温振荡器、0LYMPUSBX61、SZX12显微镜；
[0046] 主要溶液：
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