结果，结果以存活率表 示。按下列公式计算肿瘤细胞存活率：肿瘤细胞存活率=(加药细胞0D值一空白对照0D 值V(对照细胞0D值一空白对照0D值）X100%。
[0026] 1. 3Western Blot分析细胞中p-IGFIR，p-EGFR，AKT，MEK及p-AKT，p-MEK的表 达情况 取对数生长期的耐药细胞PC-9/ER接种于6孔培养板内，24h后各组分别加入培养液，PPP(5ymol/L)，厄洛替尼150ymol/L，厄洛替尼加PPP(厄洛替尼为150ymol/L，PPP为 5ymol/L)，加药24小时后提取蛋白提取及BCA法蛋白浓度测定：六孔板中加入含PMSF的 RIPA细胞裂解液，冰上充分裂解，4°C13000rpm离心10min，取上清即为细胞总蛋白。根 据BCA试剂盒操作说明测蛋白浓度。WesternBlot主要步骤包括洗板一制胶一电泳一转膜 -封闭一孵一抗一孵二抗一显像。
[0027] 1. 4统计学处理 所有计量资料以均数土标准差表示，样本均数间的比较用t检验或方差分析，方差分 析先进彳丁方差齐性检验，方差相等时米用方差分析；方差不齐时米用Games-Howell检验。 以GrapPad Prism5. 0统计绘图软件处理、分析数据、绘制图形，以SPSS 17. 0统计软件求出 P值，以P0. 05表示差异有显著性。
[0028] 1.5实验结果 厄洛替尼单独或联合PPP作用于细胞后的细胞增殖情况 PPP(浓度5ymol/L)单独或联合厄洛替尼（浓度150ymol/L)作用于细胞后，48h后 采用CCK-8法分析各组细胞增殖的变化。如图1所示，厄洛替尼联合PPP组PC-9/ER细胞 存活率明显较其他各组低，差别有统计学意义〇?〈 0. 05)。*与其他组比，产〈0. 05 ; # 与其他组比，产〈〇? 05。
[0029] 说明书附图1中Untreated是实验对照组；PPP为添加PPP组分的细胞实验组； Erlotinib为厄洛替尼的细胞实验组；Erlotinib+PPP为厄洛替尼和PPP联合作用的细胞实 验组。
[0030] 厄洛替尼单独或联合PPP作用于PC-9/ER后细胞中Akt、ERK及p-Akt、p-ERK的表 达水平 WesternBlot结果显示，PPP单独作用于PC-9/ER细胞，其p-Akt及p-ERK蛋白表达 水平下降较厄洛替尼单独作用明显，当两者联合作用时抑制作用更为明显，如说明书附图2 所示，PC-9/ER细胞的p-Akt及p-ERK蛋白表达水平较其他三组明显下降。而Akt及ERK在 各组无明显变化。
[0031] 此外，我们设计了PPP与厄洛替尼不同浓度配比作用于细胞后，同时给药，48h后 分析，其结果如下表3所示；其中实验具体操作如2. 1、2. 2和2. 3 -致。
[0032] 表1不同PPP和厄洛替尼浓度配比下作用于细胞后的结果
2裸鼠（体内实验） 2. 1实验试剂 厄洛替尼（其主要成分是盐酸厄洛替尼、化学名为：N-(3-乙炔苯基）-6, 7-双（2-甲 氧乙氧基）-4_喹啉胺盐酸盐，化学式为：C22H23N304 ?HC1 ;购自联科生物有限公司。
[0033]PPP(Picropodophyllotoxin)即为苦鬼臼毒素。苦鬼臼毒素是小檗科植物八角莲 Dysosmaversipellis(Hance. )M.Cheng的根莖，其系统命名法为：（5R, 5aS, 8aR, 9R) _5, 8, 8 a, 9-Tetrahydr〇-9-hydroxy-5-(3, 4, 5-trimethoxyphenyl)furo[3' ,4' :6,7]naphtho[2 ，3-d]-l，3-di〇X〇l-6(5aH)-〇ne，由南通大学附属医院临床研宄中心馈赠。
[0034]PPP及厄洛替尼溶解于DMS0,制成浓度为10ymol/L的溶液，分装后保存于-20°C 冰箱中备用；实验时用培养液稀释至目标浓度，使其DMS0体积分数〈0. 005%。
[0035] PC-9/ER细胞由南通大学附属医院肿瘤放疗科实验中心提供。
[0036] 4~6周龄BALB/c裸鼠由南通大学实验动物中心提供，质量18~20g/只，雌雄各半， 于SPF条件下饲养。
[0037] 2. 2PC-9/ER细胞裸鼠移植瘤的建立及实验分组 PC-9/ER细胞贴壁生长于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，在37°C、5%C02、饱 和湿度培养箱中常规培养，2~3天换液传代一次。收集细胞制成浓缩细胞悬液，将0. 2mL浓 缩细胞悬液（2X106/L)注射裸鼠肩背部皮下，形成直径3 _左右皮下隆起，随后逐渐吸收， 观察一周，至瘤体长径约8-10 _大小时，将裸鼠随机分为4组，每组5只，即对照组、厄洛 替尼组、PPP组、PPP及厄洛替尼联合组。对照组：不进行任何治疗；厄洛替尼组：给予厄洛 替尼5mg/kg，灌胃给药，一天一次；PPP组：给予PPP3mg/kg，灌胃给药，一天一次；联合组： PPP及厄洛替尼剂量及用药方法同以上两组。治疗过程中观察裸鼠的生存状态。
[0038] 2. 3移植瘤生长测定 每日观测肿瘤生长情况及肿瘤大小，肿瘤体积V(mm3)= 0.5XaXb2(a=长径，b=高 度），根据肿瘤体积绘制生长曲线图。注射细胞悬液后5周，拉颈处死裸鼠，剥离肿瘤，并称 瘤重，计算抑瘤率（tumorinhibitionrate,TIR)。TIR(%) =(对照组瘤重-实验组瘤重）/ 对照组瘤重X100%。
[0039] 2. 4统计学处理 所有计量资料以均数土标准差表示，以GrapPadPrism5. 0统计绘图软件处理、分析数 据、绘制图形，以SPSS17. 0统计软件求出P值，以/^ 0. 05表示差异有显著性。
[0040] 2. 5裸鼠的状况及成瘤时间 PC-9/ER细胞接种裸鼠7天后，所有裸鼠接种部位均触及肿瘤结节，裸鼠肺癌移植瘤成 瘤率100%。实验组和对照组裸鼠全部成活，生长状况良好，进食、排尿及排便均正常，无食欲 不振、体重减轻等情况。
[0041] 2.6各组裸鼠瘤体生长情况及肿瘤体积比较 注射细胞5周后，处死裸鼠，分离出移植瘤，由说明书附图3可见移植瘤为圆形或椭圆 形，表面凹凸不平，不规则，色粉红，质中。PPP及厄洛替尼联合组较对照组、厄洛替尼组、PPP 组相比，移植瘤体积明显小，由上述内容可以得知，联合组移植瘤体积增长速度明显低于其 他各组，差异有统计学意义（代〇. 05)，如说明书附图4。
[0042] 2.7各组瘤体重量及抑瘤率 将分离出的移植瘤称重，各组瘤重见表2,PPP及厄洛替尼联合组较其他三组比，肿瘤 重量明显降低，差别有统计学意义（K0. 05)。厄洛替尼组、PPP组、PPP及厄洛替尼联合组 抑瘤率分别为10. 4%，42. 3%和67. 8%。
[0043] 表2各组裸鼠移植瘤重量及抑瘤率
*与其他两组比，/7〈 〇. 05。
[0044] PC-9/ER细胞接种裸鼠7天后，所有裸鼠接种部位均触及肿瘤结节，裸鼠肺癌移植 瘤成瘤率100%。将裸鼠随机分为4组，即对照组、厄洛替尼组、PPP组、PPP及厄洛替尼联合 组，联合组较其他组相比，移植瘤体积明显小，且移植瘤体积增长速度明显低于其他各组， 差异有统计学意义（K〇. 05)。将分离出的移植瘤称重，PPP及厄洛替尼联合组较其他三组 比，瘤重明显低，差别有统计学意义（K0. 05)。厄洛替尼组、PPP组、PPP及厄洛替尼联合组 抑瘤率分别为10. 4%，42. 3%和67. 8%。
[0045] 同时，我们做了几组不同PPP与厄洛替尼不同比例的裸鼠实验，其中实验条件如 上，不同组的裸鼠5只，具体试验结果如表2。对照组仍然为空白实验，皮下注射培养液。例 1 中PPP2mg/kg、厄洛替尼 2mg/kg;例 2 中PPP2mg/kg、厄洛替尼 8mg/kg;例 3 中PPP2mg/ kg、厄洛替尼10mg/kg;例4中PPP2mg/kg、厄洛替尼15mg/kg;例5中PPP2mg/kg、厄洛替 尼 20mg/kg;例 6 中PPP2mg/kg、厄洛替尼 50mg/kg。
[0046] 表3不同PPP与厄洛替尼比例组成的活性药物的裸鼠移植瘤重量及抑瘤率
EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor，简称为EGFR、ErbB_l或HER1)是表皮 生长因子受体01ER)家族成员之一。该家族包括ffiRl(erbBl，EGFR)、HER2(erbB2,NEU)、 HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR广泛 分布于哺乳动物h皮细朐、成纤维细朐、胶质细朐、角质细朐等细朐表而，EGFR信号通路对 细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR获得性耐药的原因有很多，除了 常见第二位点I790M突变及Met扩增，还有绕开EGFR通路的其他TK受体的活化等等。其 中IGF1R通路对下游基因的活化可能是目前临床厄洛替尼耐药的一个重要原因。IGF1R及 EGFR两者高表达的肺癌患者预后明显差于低表达患者，IGF1R单克隆抗体MC-A12联用厄 洛替尼可增加耐药细胞对厄洛替尼的敏感性。本发明选用IGF1R的小分子酪氨酸激酶抑制 剂PPP进行研宄。结果显示PPP及厄洛替尼联合组移植瘤增长速度明显低于其他各组，瘤 体体积及重量明显小（K0. 05)。厄洛替尼组、PPP组、PPP及厄洛替尼联合组抑瘤率分别为 10. 4%，42. 3%和67. 8%，由上述内容可以清晰地表明PPP与厄洛替尼联用能有效抑制耐药裸 鼠移植瘤的生长。抑制IGF1R信号通路，进而阻止或延迟厄洛替尼的耐药性。
[0047] 本发明所提供的抗肺癌的药物组合物，在体外对人肺肿瘤具有很明显的抑制作 用。
【主权项】
1. 一种用于肺癌的药物组合物，其特征在于：药物组合物的活性成分为PPP和厄洛替 尼。2. 根据权利要求1所述的一种用于肺癌的药物组合物，其特征在于：药物组合物的活 性成分的重量份比为PPP :厄洛替尼=1 : 36~1 : 1.0。3. 根据权利要求1所述的一种用于肺癌的药物组合物，其特征在于：药物组合物的活 性成分的重量份比为PPP :厄洛替尼=1 : 25~1 : 4。4. 根据权利要求1所述的一种用于肺癌的药物组合物，其特征在于：药物组合物的活 性成分的重量份比为PPP :厄洛替尼=1 : 16~1 : 10。
【专利摘要】本发明提供一种不具有耐药性、协同作用明显的用于肺癌的活性物质，其具体属于药物技术领域。本发明的药物活性成分包括苦鬼臼毒和厄洛替尼，其中苦鬼臼毒和厄洛替尼的重量份比为1︰36~1︰1.0。本发明通过细胞水平及裸鼠移植瘤实验得知：苦鬼臼毒和厄洛替尼联用能有效抑制耐药细胞及耐药裸鼠移植瘤的生长，抑制IGF1R信号通路，进而阻止或延迟厄洛替尼的耐药性。本发明还提供了苦鬼臼毒和厄洛替尼联合使用在人肺癌疾病中的应用。苦鬼臼毒和厄洛替尼联合使用后，耐药性低，且无任何生理毒性，进而具有明显的经济价值和社会效益。
【IPC分类】A61K31/365, A61K31/517, A61P35/00
【公开号】CN104940203
【申请号】CN201510360703
【发明人】钱静, 刘贤称, 顾红梅, 姚宁华
【申请人】南通大学附属医院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月26日