捷，无任何不良反应。
[0042] 实验1:复方制剂对宫颈癌细胞系（Hela)的杀伤作用实验（本实验数据来自复旦 大学上海医学院） 药物采用本发明的中药复方制剂； 细胞系Hela来自美国ATCC，本实验室液氮备存细胞株； 细胞培养依据常规，DMEM，10%胎牛血清(均来自Gibco, Invitrogen)，5%C02培养，细胞 培养后达到9(T95%覆盖度传代，按照lxlO5/孔，接种于96孔板，24小时后加入药物，处理 一定时间后，测定； 细胞数量测定，CCK-8法，每100ul无血清DMEM加入10ul CCK-8试剂，37度避光培养 1小时后，0D450读数(美国）依照说明书绘制标准曲线，计算相对细胞含量； 细胞数量用t检验，结果以(存活百分数土SD) %表示，评估杀伤作用。
[0043] 每隔八小时加药一次，连续加药3次，计算IC50, IC90,细胞存活相对量与药物不 同浓度分组的细胞存活率图表见图9。
[0044]如图 9 所不，计算出的 IC50=0. 0647mg/ml，IC90=0. 163 mg/ml。
[0045] 2. 2该复方制剂的最佳配比及阴性、阳性对照实验。
[0046] 简要结果见图10 (0? 065mg/ml，每8hr加药一次)，杀伤率见下表：
其中：DM为DMS0二甲基亚砜溶剂阴性空白对照； #12为丹参1 :苦参1配比； #13为丹参3:苦参2配比； #14为丹参3 :苦参1配比； #15为丹参4:苦参1配比； GJ为阳性对照鬼臼毒素。
[0047] 结果：#14丹参3:苦参1配比杀伤效果最好，杀伤率分别86. 3%，杀伤率高于阳性 对照鬼臼毒素与阴性对照二甲基亚砜。
[0048] 实验2:该复方制剂对原代寻常疣的体外杀伤作用（本实验数据来自复旦大学上 海医学院） 药物采用本发明的中药复方制剂； 寻常疣来自江苏省镇江市丹阳医院新鲜获取标本； 原代细胞处理成单细胞悬液方法暂略，培养依据常规，DMEM，10%胎牛血清(均来自 Gibco, Invitrogen)，5%C02培养，细胞培养12~24小时后加药处理； 细胞数量测定，CCK-8法，每100ul无血清DMEM加入10ul CCK-8试剂，37度避光培养 5小时后，0D450读数(美国）依照说明书绘制标准曲线，计算相对细胞含量； 细胞数量用t检验，结果以(存活百分数土SD) %表示，评估杀伤作用； 用不同浓度复方制剂处理原代细胞(每隔8hr，共3次)，细胞存活率见图11。
[0049] 如图11可见0.l~lmg/ml提取物可以杀死原代细胞，可以考虑增加用药次数。
[0050] 证明案例1: 复旦大学上海医学院针对该复方制剂对高致病hpv导致的子宫颈癌细胞hela杀伤力 做了实验： 取本发明中药复方制剂，来自美国ATCC的细胞系Hela (本实验室液氮备存细胞株)，依 据常规培养细胞，DMEM，10%胎牛血清(均来自Gibco, Invitrogen)，5%C02培养，细胞培养后 达到90~95%覆盖度传代，按照1x105/孔，接种于96孔板。24小时后加入药物。
[0051] 处理一定时间后，采用CCK -8法测定细胞数量，(来自日本同仁化学)参照说明书。 每100ul无血清DMEM加入10ul CCK-8试剂。37度避光培养1小时后，0D450读数(美国） 依照说明书绘制标准曲线，计算相对细胞含量。
[0052] 最后，细胞数量用t检验，结果以(存活百分数土SD)%表示，评估杀伤作用。
[0053] 试验结果显不：1.肿瘤细胞杀伤剂量依赖关系（分别设置_中低1，〇? 1，〇? 01 mg/ ml三个浓度【终浓度】，100ul培养液/孔，加入lul 100X药物稀释液。100X药物稀释液以 无菌双蒸水新鲜配置，-20度存放一周内使用）加入药物24小时后测定，结果见图12和下 表所示：
从上表可以看出低中高浓度组对Hela细胞杀伤率分别是（38. 1±5. 8) %， (45. 1 ±4. 47) % 和（61. 8± 10. 3) %。
[0054] 注：杀伤率=(1-存活率）xl00%。
[0055] 如图12所示，横轴表示药物不同浓度分组，1空白对照，2. 0.01mg/ml组3. 0. lmg/ml组4 lmg/ml组,纵轴表示细胞存活相对量。
[0056] 肿瘤细胞杀伤时间依赖关系（以0? lmg/ml浓度，分别处理3,6,12, 24,48, 72小时） 如图8所示，1~7分别是加药后0, 3,6,12, 24,48, 72小时，1号折线代表空白对照即左起往 上延伸线，2号折线代表加入药物处理即左起往下延伸线，从图8可以看出，药物处理24小 时后达到较好的抑制效果。
[0057] 证明案例2 治疗好的疣患者图片 如图1所示，束某某，43岁，某广告公司总经理，2005年2月手部患指状寻常疣，用冷冻 方法、鸡眼膏、疣迪搽剂、干扰素等药物多方治疗无效后，2013年4月用该药物每日三次涂 抹，治疗10天，痊愈。
[0058] 如图2所示，王某某，7岁，某某小学一年级学生，2012年2月手部感染乳头瘤病 毒，用冷冻方法、干扰素等药物多方治疗无效后，用该发明每日三次涂抹，治疗12天，痊愈。
[0059] 如图3所示，程某某，女，27岁，职业为服务员，2011年8月脸部感染乳头瘤病毒， 用干扰素等药物多方治疗无效，用该发明每日三次涂抹，治疗14天，痊愈。
[0060] 如图4所示，洪某某，女，47岁，职业为收营员，2007年2颈部感染乳头瘤病毒，用 干扰素等药物多方治疗无效，用该发明每日三次涂抹，治疗16天，痊愈。
[0061] 如图5所示，林某某，女，34岁，职业为出纳，2008年6手部感染乳头瘤病毒，用干 扰素等药物多方治疗无效，用该发明每日三次涂抹，治疗10天，痊愈。
[0062] 如图6所示，费某某，女，30岁，职业为办公室文员，2010年12面部感染乳头瘤病 毒，用干扰素等药物多方治疗无效，用该发明每日三次涂抹，治疗10天，痊愈。
[0063] 如图7所示，谢某某，女，41，职业为物业保洁员，2012年2月肛门感染乳头瘤病毒， 用干扰素等药物多方治疗无效，用该发明每日三次涂抹，治疗15天，痊愈。
【主权项】
1. 一种中药复方制剂，其特征在于：该中药复方制剂包括丹参提取物有效成分丹酚酸 b，含量> 5% ;丹参酮IIA，含量>0. 2% ;所述药复方制剂还包括有苦参提取物有效成分氧化 苦参碱，含量2%以上； 所述药材丹参：苦参药材配比为，9 ~1份：1 ~5份， 该中药复方制剂在制造药物中的应用，该药物用于治疗疣或宫颈癌。2. 根据权利要求1所述一种中药复方制剂，其特征在于：该中药复方制剂是外用制剂。3. 根据权利要求2所述一种中药复方制剂，其特征在于：所述外用制剂是冻干粉或软 膏剂或乳膏剂或糊剂或凝胶剂或栓剂或ET剂。4. 根据权利要求1-3任一项所述一种中药复方制剂，其特征在于：所述药复方制剂中 制备方法包括以下步骤： (1) 粗提液制备：取经丹参、苦参按配方均匀配比成混合物装进蒸馏容器中，用溶剂1 三次加热洗脱，收集有效部位A备用； (2) 清洗：将上述提取的有效部位A经过滤处理，然后依次用溶剂1清洗蒸馏容器，再 蒸馏水清洗； (3) 提纯：将粗提液加入清洗后的蒸馏容器内，加入溶剂1进行蒸馏，按顺序由溶剂2、 溶剂1进行提纯，最后得棕黄色流出液，回收流出液中的溶剂后，留下的水溶液经过冷冻干 燥，得固体粉末，所述固体粉末有效成分丹酚酸b含量> 5% ;丹参酮IIA含量> 0. 2%，氧化 苦参碱，含量> 2%; 所述溶剂1为509T80%乙醇，溶剂2为正己烷或乙醚或石油醚。5. 根据权利要求4所述一种中药复方制剂，其特征在于：在上述步骤（3)中，提纯后， 增加回流或提纯步骤，然后再得棕黄色流出液，回流或提纯时间为2小时，回流或提纯次数 3次，加醇量为10倍药材量。6. 根据权利要求4所述一种中药复方制剂，其特征在于：所述溶剂1为乙醇，溶剂2为 正己烷。7. 根据权利要求1-3任一项所述一种中药复方制剂，其特征在于：所述配方以丹参和 苦参为主。8. 根据权利要求3所述一种中药复方制剂，其特征在于：所述剂型为含醇凝胶或酊剂。9. 根据权利要求1所述一种中药复方制剂，其特征在于：所述配方质量检测成分为丹 酚酸b、丹参酮IIA、氧化苦参碱。10. 根据权利要求1所述一种中药复方制剂，其特征在于：所述配方配比为丹参3 :苦 参1。
【专利摘要】本发明公开了一种中药复方制剂，该中药复方制剂包括丹参和苦参（其中提取物有效成分丹酚酸b，含量为≥5%；丹参酮IIA含量在≥0.2%；氧化苦参碱，含量≥2%；所述丹参药材为9～1：所述苦参药材1～5；该中药制剂的制备方法包括以下步骤：（1）粗提液制备：取经蒸馏水浸泡后的丹参、苦参饮片混合物装进蒸馏容器中，用溶剂1三次加热洗脱，收集有效部位A，该即为粗提液，备用；（2）清洗步骤和（3）提纯步骤。该中药复方制剂在制造药物中的应用，该药物用于治疗疣或宫颈癌，配方精简，有效成份明确，质量体系稳定可控，治疗价格低、不复发、治疗效果好。
【IPC分类】A61K36/537, A61P35/00, A61P17/12, A61P31/20
【公开号】CN104958359
【申请号】CN201410452023
【发明人】邵文远, 姜雪成
【申请人】江苏丹晟生物科技有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2014年9月9日