] 图2D为mTORCl催化底物肤磯酸化反应后所得的激酶反应溶液中底物提取流色谱 图。
[0052] 图沈为mTORCl催化底物肤磯酸化反应后所得的激酶反应溶液中产物提取流色谱 图。
[0053] 图3为mTORCl底物肤的质谱图。
[0054] 图4为mTORCl催化底物肤磯酸化反应的产物质谱图。
[00巧]图5为mTORCl催化底物肤磯酸化反应的产物的二级质谱图。
[0056] 图6为丹酪酸A对mTORCl催化底物肤磯酸化反应活性的抑制曲线。
[0057] 图7为丹酪酸C对mTORCl催化底物肤磯酸化反应活性的抑制曲线。
【具体实施方式】
[0058] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0059] 实施例1
[0060] 底物肤STTPGGTLFSTTPG(所述底物肤的序列如序列表中SEQIDNO: 1所示，参见 Perki址Imer公司的mTOR激酶测试方法），由吉尔生化（上海）有限公司合成该底物肤，并 对其N端进行5-駿基英光素巧-FAM)标记，W便于英光检测W及提高检测的灵敏度，所得 底物肤的肤段结构如式II所示：
[0061]
[006引实施例中使用的mTORCl购自sigma试剂有限公司，产品货号；SRP0364 ;丹酪酸A购自上海源叶试剂公司，产品货号；YY90055 ;丹酪酸C购自上海源叶试剂公司，产品货号： YY90623。
[006引配制酶反应缓冲液25血；50mM4-居己基脈嗦己礙酸化巧es)，抑值由4M化0H调 节至7. 5, 2mMl，4-二硫代苏糖醇，lOmM氯化镇，ImM己二醇双（2-氨基己基離）四己酸，0. 01% (v/v,下同）吐温20和3mM氯化儘。
[0064]使用2yL酶反应缓冲液溶解底物肤（含有5X10 %英光素钢作为内标，提高定量 的准确性）与mTORCl。其中，底物肤的浓度为2yM，mTORCl的浓度为31.InM。
[006引利用配制有激光诱导英光检测器的毛细管电泳仪脚）分离31.InMmTORCl与 2yMmTORCl底物肤的反应体系，并考察不存在多酪类化合物（即不存在丹酪酸A或丹酪 酸C)(加入0. 25 %二甲基亚讽作为对照）与分别在反应体系中加入0. 5yM多酪类化合物 (丹酪酸A或丹酪酸C，0. 25 %二甲基亚讽溶解多酪类化合物）后该反应体系的差异。
[0066] 实验所用仪器为P/ACEMDQ毛细管电泳仪度eckmanCoulter,CA，USA)，配有激光 诱导英光检测器，氮离子激光源，激发波长488nm，发射波长520nm;数据通过装有32Karat Software的计算机采集；弹性石英毛细管柱规格为50ymI.化（370ym0.D.)X30cm(有 效柱长19. 5cm，PolymicroTechnologies,AZ，USA)。如没有特殊注明，所有分析的电泳条 件都为：柱温25C，反端压力进样。
[0067] 结果如图1A~1D所示，其中图1A为2yMmTORCl底物肤的激光诱导英光吸收色 谱图。图1B为2uMmTORCl底物肤体系中加入31.InMmT0RCl，25°C反应20分钟后所得 的激酶反应溶液的激光诱导英光吸收色谱图。图1C为31.InMmTORCl与2yMmTORCl底 物肤的反应体系中加入0. 5yM丹酪酸A, 25°C反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激光 诱导英光吸收色谱图。图1D为31.InMmTORCl与2yMmTORCl底物肤的反应体系中加入 0. 5yM丹酪酸C，25°C反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激光诱导英光吸收色谱图。
[0068] 结果表明在包含31. InM mTORCl与2 y M mTORCl底物肤的反应体系中分别加入多 酪类化合物（丹酪酸A或丹酪酸C)，可W有效抑制mTORCl对底物肤的磯酸化反应。mTORCl 催化5-FAM修饰的底物肤磯酸化反应如下所示：
[0069]
[0070] 为了进一步证明激光诱导英光吸收色谱图中各峰的归属，证明磯酸化产物的生 成，我们利用高效液相色谱（HPLC)-紫外检测器0JV)-英光检测器（FLD)和电喷雾离子阱 质谱巧SI/M巧的技术对mTORCl催化底物肤磯酸化反应进行了测试，进一步确证了磯酸化 产物肤的存在。
[0071] 检测条件为；安捷伦1260液相色谱系统，配有紫外检测器0JV)和英光检测器 (化D);色谱柱为Agilent Z0RBAX Eclipse XDB-C18柱（2. lmmX150mm，3. 5-Micron) ;UV检 测波长为220nm ;化D激发波长为488nm，发射波长为520nm ;进样量5 y L ;流速0. 3血/min ; 柱温3(TC。流动相A和B分别为水和己腊，两者均含0.1%甲酸（v/v，下同）。采用梯度洗 脱，具体为；0-20分钟，20%-40%8;20-25分钟，40%-100%8。册1(：与1〔9斗1661离子阱 质谱（Thermo Scientific, CA)偶联，所有质谱均在正离子模式下获得；喷雾电压为4. 5kV ; 毛细管电压为30V ;毛细管温度为320°C。检测结果如图2A~沈、图3、图4和图5所示，图 2A为mTORCl催化底物肤磯酸化反应后所得的激酶反应溶液的紫外吸收色谱图。图2B为 mTORCl催化底物肤磯酸化反应后所得的激酶反应溶液的英光吸收色谱图。图2C为mTORCl催化底物肤磯酸化反应后所得的激酶反应溶液的Base化ak色谱图。图2D为mTORCl催化 底物肤磯酸化反应后所得的激酶反应溶液中底物提取流色谱图。图沈为mTORCl催化底 物肤磯酸化反应后所得的激酶反应溶液中产物提取流色谱图。图3为mTORCl的底物肤的 质谱图。图4为mTORCl催化底物肤磯酸化反应所得产物的质谱图。图5为mTORCl催化 底物肤磯酸化反应所得产物的二级质谱图。图3中底物肤分子离子峰理论值为1681. 71， 实测值为841. 65 ([M+2田2+)。图4中磯酸化产物分子离子峰理论值为1759. 67,实测值 为881. 30 ([M+2田2+)。上述结果表明mTORCl能够有效催化其底物肤的磯酸化反应。根据 mTORCl催化底物肤磯酸化反应所得产物的二级碎片离子对底物磯酸化位点进行了确证，从 图5碎片离子的信息可知，底物肤发生磯酸化的位点只能是短肤序列中第12位氨基酸一苏 氨酸。其中，b离子和y离子指的是多肤离子在质谱碰撞室内经惰性气体碰撞解离时，在肤 链醜胺键处断裂产生的离子，经过送样的过程形成的N端离子为b离子，C端离子为y离子。
[0072] 对酶的催化活性进行抑制作用研究时，需要在反应体系中分别加入不同浓度的多 酪类化合物（丹酪酸A或丹酪酸C)，进行磯酸化反应，多酪类化合物（丹酪酸A或丹酪酸 C)往反应体系中的加入浓度如表1所示：
[0073] 表1多酪类化合物的添加浓度
[0074]
[00巧]实验方法为；将新毛细管柱在30psi压力条件下用0. 1M化0H溶液处理30分钟， 再分别用超纯水、背景电解质分别冲洗10分钟。每次运行间隔在30psi压力条件下W1M 化0H、超纯水、背景电解质各冲洗3分钟。样品在0.化si条件下进样5s;分离电压为-15kV; 柱温维持在25°C。分离缓冲液为lOOmM化pes，抑值由化OH调节至7. 5,英光素钢为内标 W校正进样量。
[0076]mTORCl的活性通过检测磯酸化产物肤的生成来确定，即通过磯酸化产物肤校正峰 面积的测定（校正峰面积即磯酸化产物肤和内标的峰面积比），可W定量测定mTORCl的活 性。对于抑制活性研究或抑制剂筛选，将纳摩尔至微摩尔浓度上述多酪类化合物（丹酪酸 A或丹酪酸C)分别加入到反应溶液中，上述化合物的抑制活性可W通过与空白对照（即不 加入多酪类化合物