一种流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的制备方法，属于生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒简称流感，是由甲、乙、丙三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染 病。流感疫苗接种是预防流感的重要手段。流感血凝素是流感病毒表面的主要蛋白之一， 以三聚体形式存在，是流感病毒表面参与宿主细胞吸附和入侵的重要成分，其诱发的中和 性抗体可以阻断病毒在宿主细胞表面的吸附和入侵，因此是流感疫苗的主要成分。流感血 凝素变异、重配快，各种新型流感频发，如近年来爆发的H5N1高致病性禽流感、H1N1甲型流 感、H7N9高致病性禽流感等均引起了严重的问题。新疫情爆发后，疫苗的快速研发和生产 是疫情控制的关键。
[0003] 现有的流感疫苗主要是全病毒灭活疫苗、裂解疫苗或在此基础上纯化获得的亚单 位疫苗，这些疫苗都是通过流感病毒减毒株或重配株的鸡胚培养获得病毒，经病毒纯化、灭 活或近一步裂解、纯化制备的。鸡胚流感疫苗生产技术存在的主要问题是，病毒生产受限于 合格鸡胚的供应，病毒毒株的重配、减毒和鸡胚适应需要大量时间，且存在不确定性。制备 的疫苗除作为主要有效成分的流感血凝素外，还含有病毒的其它蛋白，及鸡胚来源蛋白。疫 苗的蛋白纯度低，易引起过敏等副反应。且有些亚型的病毒经灭活剂甲醛等的灭活后，抗原 性可能发生改变，导致疫苗部分无效。近年来哺乳动物细胞替代鸡胚培养流感病毒的技术 取得发展，但该技术只解决了鸡胚供应受限和GMP生产的问题，上述其它问题依然存在。而 且还受限于细胞规模化生产的能力。通过基因工程技术，重组表达和制备高度纯化的流感 血凝素可望为这些问题的解决提供新途径。
[0004] 流感病毒血凝素 HA蛋白的命名来源于病毒颗粒通过HA蛋白与特异性含唾液酸的 受体结合，凝集血红细胞。其合成是首先经转录、翻译后在细胞内质网合成含有562~566 个氨基酸的HA蛋白前体（ΗΑ0)，即血凝素前体；流感病毒RNA编码的血凝素（HA)成熟蛋白 约含550个氨基酸残基，包括重链（HA1)和轻链（HA2)两部分，两者中间的碱性氨基酸位 点在成熟病毒颗粒向细胞外芽生释放时，受细胞特异蛋白酶水解切开，成为通过二硫键相 连的HA1和HA2。而未经蛋白酶切割前的流感血凝素又被称为流感血凝素前体（ΗΑ0)。这 种特异性切割是流感病毒与宿主细胞膜融合必须的，但与流感血凝素与受体的结合无关， 特异蛋白酶切割前后的流感血凝素都具有相同的抗原性和受体结合活性，ΗΑ0分子水解为 HA1和HA2,是病毒感染性的先决条件。为方便叙述，除特殊说明外，本发明所述流感血凝素 或HA均包括流感血凝素前体（ΗΑ0)和特异蛋白酶切割后形成的二硫键相连的HA1和HA2。
[0005] 流感血凝素 HA单体的分子量约为60KD，流感病毒表面的HA以三聚体 (HA-trimer)形式组成刺突，这种三聚体结构是其与唾液酸受体结合必需的。一些动物如 鸡、豚鼠等的红细胞表面具有能与流感病毒HA三聚体结合的唾液酸化糖基。病毒表面的 多个HA刺突与不同红细胞表面的多个唾液酸化糖基结合，红细胞表面的多个唾液酸化糖 基又与多个病毒表面的HA刺突结合，可形成病毒与红细胞的互相交联，形成血凝现象。由 于流感病毒感染宿主细胞时的黏附过程也是通过流感病毒HA三聚体与宿主细胞表面的唾 液酸化糖基结合实现的。因此血凝活性是检验HA受体结合活性的重要方法，血凝抑制实 验是研究抗体是否具有阻断流感病毒HA三聚体与受体结合的中和活性的重要方法。不同 表达系统和制备方法获得的重组HA在结构、糖基化、诱导中和抗体的能力等方面存在明显 不同。Athmaram，TN 等（Virology Journal2011, 8:524 ;Virus Genes201245 :440-451 ;J Ind Microbiol Biotechnol2013, 40:245-255)用酵母成功分泌表达并纯化获得了 2009新 型H1N1流感的ΗΑ0,但制备的ΗΑ0用FPLC纯化时主要以单体和少量三聚体形式存在，以 10 μ g/只和50 μ g/只的剂量两次免疫小鼠后血凝抑制活性仅为1:32。未见酵母制备流感 血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明公开了一种流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的制备方法。
[0007] -种制备流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒的方法，包括如下步骤：使N端 上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 HA基因在酵母中表达； 将所述酵母进行细胞破碎，加入去污剂，获得含流感病毒血凝素糖蛋白的溶液；将所述溶液 进行纯化，制备得到具有血凝活性的流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒；
[0008] 所述N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 HA 基因在信号肽序列之前还含有Kozak序列，Kozak序列为5' -aaacg-3' ；
[0009] 所述加入去污剂和细胞破碎之间具体还含有离心得沉淀的步骤；
[0010] 所述加入去污剂和获得含流感病毒血凝素糖蛋白的溶液之间具体还含有离心得 上清的步骤；
[0011] 所述流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒的分子量大于670KD ;
[0012] 所述具有血凝活性的流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒在电镜下呈现玫瑰 花环结构，证明其至少是由3个以上的三聚体形成，3个流感病毒血凝素蛋白前体ΗΑ0组成 的ΗΑ0三聚体分子量约为180KD，因而证明流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒至少由9 个以上流感病毒血凝素蛋白前体ΗΑ0参与形成聚合物纳米颗粒，其中流感病毒血凝素蛋白 前体ΗΑ0形成ΗΑ0三聚体。
[0013] 上述方法中，所述N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒 的血凝素 HA基因在酵母中表达的方法为将N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区 序列的流感病毒的血凝素 HA基因的重组表达载体转化酵母，培养得到转化的酵母，再诱导 使基因表达；
[0014] 所述酵母为毕赤酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母；
[0015] 所述诱导使基因表达的步骤具体为将所述转化的酵母进行培养，并诱导基因的表 达；
[0016] 所述培养具体为摇瓶培养或发酵罐培养，根据控制所述HA基因表达的启动子的 不同，可以采用先培养所述转化的酵母至一定密度，再诱导HA基因表达的方法，也可以采 用在培养所述转化的酵母的同时诱导HA基因表达的方法，其中前一种方法更有利于提高 酵母工程菌的稳定性；
[0017] 所述信号肽为所述HA基因自身的信号肽或其它可在相应酵母中起作用的其它信 号肽；
[0018] 所述其它可在相应酵母中起作用的其它信号肽为酿酒酵母α交配因子信号肽、 α淀粉酶信号肽或白蛋白的信号肽；
[0019] 所述白蛋白的信号肽具体为血清白蛋白的信号肽。
[0020] 上述任一所述的方法中，所述流感病毒的血凝素 ΗΑ为Η1、Η3、Η5或Η7血清型流感 病毒的ΗΑ。
[0021] 上述任一所述的方法中，所述Η1、Η3、Η5或Η7血清型流感病毒的ΗΑ分别为Η1Ν1、 Η3Ν2、Η5Ν1或Η7Ν9流感病毒的ΗΑ。
[0022] 上述任一所述的方法中，所述重组表达载体是将所述Ν端上游含有信号肽序列、 并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 ΗΑ基因插入含有Α0Χ启动子的载体得到，具 体是将所述含有信号肽序列和C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 ΗΑ基因插入pPICZ α 的Notl和NspV酶切位点间，并Bglll线性化得到；
[0023] 所述酵母为毕赤酵母；
[0024] 所述流感病毒具体为H7N9禽流感病毒，所述N端上游含有信号肽序列、并包含 C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 HA基因具体如SEQ ID No. 4所示；
[0025] 所述 H7N9 禽流感病毒为 A/Hongzhou/1/2013 (H7N9);
[0026] 或，
[0027] 所述流感病毒具体为甲型H1N1流感病毒，所述N端上游含有信号肽序列、并包含 C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 HA基因具体如SEQ ID No. 14所示；
[0028] 所述甲型 H1N1 流感病毒具体为 A/FortMonmouth/1/47 (H1N1);
[0029] 或，
[0030] 所述流感病毒具体为甲型H3N2流感病毒，所述N端上游含有信号肽序列、并包含 C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 HA基因具体如SEQ ID No. 21所示；
[0031] 所述甲型 H3N2 流感病毒具体为 A/reassortant/NYMC X_223A(Texas/50/2012x PuertoRico/8/1934)(H3N2)。
[0032] 上述任一所述的方法中，所述重组表达载体是将所述N端上游含有信号肽序列、 并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 ΗΑ基因插入含有Μ0Χ启动子的载体得到，具 体是将所述Ν端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 ΗΑ基 因插入pPICZ α的Notl和BstB I酶切位点间，得到中间载体1 ;再将中间载体1的Α0Χ启 动子替换为汉逊酵母的醇氧化酶启动子Μ0Χ，再用Bglll线性化得到；
[0033] 所述酵母为汉逊酵母，具体为多型汉逊酵母；
[0034] 所述Μ0Χ启动子是以多型汉逊酵母的基因组DNA为模板，以SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10所示的DNA分子为引物进行PCR扩增得到Μ0Χ启动子；
[0035] 所述将中间载体1的Α0Χ启动子替换为汉逊酵母的醇氧化酶启动子Μ0Χ的方法 具体为将所述PCR扩增得到的Μ0Χ启动子进行Bglll酶切，并进行磷酸化，获得5'端为 Bglll酶切粘性末端，3'端磷酸化的Μ0Χ启动子；将中间载体1用NspV单酶切后用Klenow fragment大片段酶和dNTP补平，得到片段，回收片段后，再用BglII酶切，切除Α0Χ启动子， 得到切除Α0Χ启动子的中间载体1 ;将5'端为Bglll酶切粘性末端，3'端磷酸化的Μ0Χ启 动子与切除AOX启动子的中间载体1连接；
[0036] 所述流感病毒具体为H5N1禽流感病毒，所述N端上游含有信号肽序列、并包含 C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 HA基因具体如SEQ ID No. 8所示；
[0037] 所述 H5N1 禽流感病毒具体为 A/duck/Guangxi/27/2003 (H5N1)。
[0038] 上述任一所述的方法中，所述重组表达载体是将所述N端上游含有信号肽序列、 并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 HA基因插入含有LAC4启动子的载体得到，具 体是将所述N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 HA基 因插入pKLACl的Hindlll和Notl酶切位点间，再用SacII线性化得到；
[0039] 所述酵母为乳酸克鲁维酵母；
[0040] 所述流感病毒具体为H7N9禽流感病毒，所述N端上游含有信号肽序列、并包含 C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素 HA基因具体如SEQ ID No. 17所示。
[0041] 所述 H7N9 禽流感病毒具体为 A/Hongzhou/1/2013 (H7N9)。
[0042] 上述任一所述的方法中，所述细胞破碎的方法为物理方法、生物方法或化学方 法；
[0043] 所述物理方法具体为玻璃珠振荡法、高压匀浆法或球磨法；
[0044] 所述生物方法具体为酶裂解法；
[0045] 所述化学方法具体为碱裂解法；
[0046] 所述去污剂为非离子型去污剂或弱离子型去污剂；
[0047] 所述非离子型去污剂具体为曲拉通、吐温或乙基苯基聚乙二醇；
[0048] 所述弱离子型去污剂具体为脱氧胆酸盐或3_[(3_胆酰胺基丙基）二甲基铵 基]-1-丙磺酸盐；
[0049] 所述曲拉通具体为TritonX-100 ;
[0050] 所述吐温具体为Tween20 ;
[0051] 所述乙基苯基聚乙二醇具体为NP-40 ;
[0052] 所述流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒表达后位于所述酵母的细胞膜上；
[0053] 所述去污剂的作用是从所述酵母细胞膜上溶解所述流感病毒血凝素糖蛋白聚合 物纳米颗粒并较好地保持其结构。
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