结果图。长非编码核糖核酸 N0NRATT021972的小干扰RNA处理后可增加2型糖尿病大鼠下调的血清过氧化氢酶（CAT) 活性水平。实验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸 N0NRATT021972的小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其 中#p〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0020] 图10为2型糖尿病大鼠血清超氧化物歧化酶活性测定结果图。长非编码核糖核 酸N0NRATT021972的小干扰RNA处理后可升增加2型糖尿病大鼠下调的血清超氧化物歧化 酶（S0D)活性水平。实验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核 糖核酸N0NRATT021972的小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对 照组。其中#P〈〇. 01表示和正常组比较，##P〈〇. 01表示与糖尿病模型组比较。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
[0022] 实施例1。
[0023] 用本技术领域公知的方法，制成适用于糖尿病神经病理痛治疗的口服或注射的长 非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA制剂。
[0024] 实施例2。
[0025] 用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及糖尿病并发神经损伤相关疾病治疗的 口服或注射的长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA制剂。
[0026] 实施例3。
[0027] 用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及糖尿病并发感觉神经炎性相关疾病治 疗的口服或注射的长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA制剂。
[0028] 总之，长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸以口服、注射、含片或其 它局部或全身用药剂型药物进行上述疾病防治。
[0029] 为了更好地理解本发明的实质，下面以长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰 核糖核酸对？2&受体介导的相关疾病治疗作用研究的实验和结果来证明长非编码核糖核 酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸的用途。
[0030] 一、材料和方法。
[0031] 1.动物和分组。
[0032] 健康Sprague-DaWley(SD)大鼠，南昌大学医学院实验动物科学部提供。健康SD 雄性大鼠60只，体重200g左右，适应性饲养1周后，随机分成2组，对照组（Ctrl)8只，喂 以基础饲料；其余大鼠（52只）为糖尿病造模组，喂以高糖高脂饲料（高糖高脂饲料配方： 基础饲料66. 5%，蔗糖20%，猪油10%，胆固醇2. 5%，胆酸钠1 %，做成球状放在恒温鼓风 干燥箱中80°C干烤2天）。第5周末，所有大鼠测体重、空腹血糖和餐后血糖后，造模组大 鼠空腹腹腔注射STZ30mg/kg(STZ溶液的配制：临用前将STZ溶解于4°C冰箱预冷的pH为 4. 2的0.lmol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液中，配制成2. 5g/L的STZ溶液），对照组大鼠腹腔 注射相同体积的〇.lmol/L，pH为4. 2柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。第6周末测血糖，空腹血 糖<7. 8mmol/L且餐后血糖< 11.lmmol/L的造模组大鼠再次给予空腹腹腔注射STZ30mg/ kg。第7周末测血糖，空腹血糖大于7. 8mmol/L，或餐后血糖> 11.lmmol/L为成模标准。
[0033] 长非编码核糖核酸N0NRATT021972小RNA干扰（siRNA)序列由 Invitrogen(Carlsbad,CA)公司提供，靶序列为 5' -GAATGTTGGTCATATCAAA-3'；阴性对 照scrambledsiRNA(CNsi)购至Invitrogen(Carlsbad,CA)公司。在体转染试剂由 Entranster?公司提供。根据Entranster?在体转染说明书，实验第7周末对糖尿病造模 成功的大鼠进行长非编码核糖核酸N0NRATT021972-siRNA在体小干扰实验。
[0034] 在第7周末将糖尿病造模成模的大鼠随机分成3组，S卩：糖尿病模型+生理盐水 组（DM+NS)，糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸（siRNA)处 理组（DM+长非编码核糖核酸N0NRATT021972si)，糖尿病模型+scrambledsiRNA(乱序小 干扰核糖核酸）阴性对照（negativecontrolsiRNA，NCsi)组（DM+NCsi)。DM+长非编码 核糖核酸N0NRATT021972si和DM+NCsi的大鼠分别给予舌下静脉注射长非编码核糖核酸 N0NRATT021972siRNA和NCsiRNA。前期的Ctrl和DM组舌下静脉注射生理盐水，分别成为 生理盐水对照组（Ctrl+NS)和糖尿病模型+生理盐水组（DM+NS)。1周后测血糖后取材（背 根神经节）。
[0035] 2.药物与试剂。
[0036]链脲佐菌素（Sigma公司），动物体内转染试剂（Entranster?-invivo)、兔源性噪 呤 2X3(P2X3)抗体（Abeam公司）。
[0037] 3.主要仪器。
[0038] 罗康全活力型血糖仪（德国罗氏公司）；消毒纱布、手巾、棉签等，碘酒及75%酒 精，手术器械包：剪刀、眼科小弯镊、血管钳、丝线、有齿镊等。
[0039] 4.体重测定。
[0040] 分别于第1，5,7,8周末测量各组大鼠体重，每次测量的时间及其他条件保持一 致。
[0041] 5.血糖的测定。
[0042] 分别于第1，5,7,8周末测量各组大鼠空腹血糖和餐后血糖，每次测量的时间及其 他条件保持一致。测血糖时，先将大鼠固定，用酒精棉球擦拭大鼠尾巴，然后用消毒剪刀剪 去尾尖2-3cm，将尾巴上的血直接滴在已准备好的安装在血糖仪上的血糖试纸上。采血结束 后，用碘伏消毒大鼠尾巴伤口。
[0043] 6.大鼠行为学测定。
[0044] 分别于第1，5,7,8周末测量各组大鼠机械缩足反射阈值（MWT)和热缩足反射潜伏 期（TWL)，每次测量的时间及其他条件保持一致。
[0045] (1)机械缩足反射阈值的检测：采用的装置为VonFrey细丝。将大鼠置于长宽高 为20cmX10cmX30cm的透明有机玻璃盒中，并放在铁丝网上，此装置高于实验台，以便能 够清楚地观察大鼠足底，适应半个小时后进行检测。VonFrey的折力分别为0.008、0. 02、 0· 04、0· 07、0· 16、0· 4、0· 6、1· 0、1· 4、2· 0、4· 0、6· 0、8· 0、10· 0、15· 0、26· 0。用细丝刺激大鼠 右足底，每只大鼠每个力度试验10次，相邻两次测试的间隔时间至少为30秒，刺激引起的 反应（如舔足、甩腿等）完全消失后才可以进行下次试验。测量时从最小力度开始，直到某 个力度刺激大鼠引起反应的次数大于5次时，记下此力度，即为机械缩足反射阈值。大于 26. 0g时记为 26. 0g。
[0046] (2)热痛敏缩足反射阈值的检测：本测试采用的仪器是BME-410C型全自动热痛刺 激仪。将与上述相同的玻璃盒放在3mm厚的玻璃板上，大鼠置于玻璃盒中，待适应30分钟 后进行测试。采用热辐射照射大鼠右足底，记录从照射到出现抬腿的时间，即TWL。为防止 组织损伤，切断时间为30s。
[0047]7、大鼠尾神经感觉传导速度的测定。
[0048] 分别于第1，5,7,8周末测量各组大鼠尾神经感觉传导速度。测定前用10%水合氯 醛300mg/kg腹腔注射麻醉，俯卧固定，顺向法测定尾神经感觉传导速度。刺激环状电极位 于尾巴远端，刺激电极阴极（黑色）置于尾神经近端、阳极电极（红色）置于远端，两者相距 lcm;记录环形电极位于刺激点近端10cm处。接地电极置于刺激电极与记录电极之间，刺激 强度固定为1.2mA。感觉神经传导速度（m/s)=记录电极与刺激电极间距离（10cm)X10/ 潜伏期（ms)，波幅测定取峰-峰值。统计分析比较各组结果。
[0049] 8、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)。
[0050] (1)提取总RNA并逆转录成cDNA:所有器械均经DEPC处理。在第8周末取材，分 别取各组大鼠背根神经节，用DEPC处理过的PBS冲洗，置于RNAStore液中-20°C保存， 提取RNA时将神经节取出移至加有lmlTrizol匀浆器中，研磨后转移到1. 5ml的无核酶 离心管中，加入0. 2ml氯仿，剧烈震荡15s，静置3min,，低温离心12000gX15min,收集上 层无色液相，加入与液相等体积的异丙醇，混匀，常温静置25min，沉淀RNA，之后4°C离心 12000gXlOmin，弃上清，在管底可见少许白色沉淀为RNA，加入lml无核酶水配置的75%乙 醇，充分洗涤RNA。4°C离心5000gX3min后，吸弃上清液，倒置2分钟，略干燥（切勿过分干 燥，否则RNA不溶于水），加20μ1无RNase水溶解沉淀。采用50μ1逆转录反应体系：无核 酶水11.75卩1，5父1311打6『10卩1，(1犯133卩1，0118〇丁2卩1，111^2卩1，1?仙81111.25卩1， RNA样本20μ1，共50μ1，离心，恒温37°C水浴1小时。
[0051] (2)设计引物：参考文献设计长非编码核糖核酸N0NRATT021972和？2乂3受体引物 序列。本发明选用β-actin作为标准内参，引物序列分别为：
[0053] (3)聚合酶链式反应反应体系（共30μ1):
[0054]
[0055] (4)聚合酶链式反应反应条件：
[0056]
[0057] (5)琼脂糖凝胶电泳：制备1. 5 %琼脂糖凝胶，用移液枪取PCR产物按10μL/孔进 行上样，电泳缓冲液为1XTAE，电压100V，电流300mA，电泳时间40min，采用凝胶成像系统 拍照，分析数据。用β-actin作为内参对长非编码核糖核酸N0NRATT021972和？2&受体 的密度进行标化。
[0058] 9、免疫组织化学方法。
[0059] (1)提取组织：取各组大鼠01?，预冷的？85清洗，4%??4固定4811后30%蔗糖脱 水，切片，其厚度为7μm，切片-20°C保存。
[0060] (2)免疫组化：