>[0061] 1)切片取出恢复室温后0· 01MPBS洗3次，每次5min;
[0062] 2) 3 % 的H202作用 5min;
[0063] 3)PBS洗 3 次，每次 5min;
[0064] 4) 5 %BSA液中 37°C孵育lh;
[0065] 5)弃去5%BSA液，转入稀释好的一抗（P2Xjjt体为兔来源，稀释比例为1:100)里 4°C过夜；
[0066] 6)次日，恢复室温半小时后经PBS常规冲洗后放入生物素标记的二抗37°C水浴孵 育 45min;
[0067] 7)PBS冲洗后转入SABC液室温30min;
[0068] 8)PBS冲洗后显微镜下DAB显色2min，放入PBS中以终止显色反应，，经梯度酒精 脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。显微镜下拍照。
[0069] (3)用Image图像分析系统观察分析反应密度。比较各组免疫化学反应结果。
[0070] 10、免疫荧光双标。
[0071] (1)提取组织：取各组大鼠01?，预冷的？85清洗，4%??4固定4811后30%蔗糖脱 水，切片，其厚度为7μm，切片-20°C保存。
[0072] (2)免疫荧光：
[0073] 1)切片取出恢复室温后(λ01MPBS洗3次，每次5min，
[0074] 2)3%TritonX-100 作用 15min;
[0075] 3)PBS洗 3 次，每次 5min;
[0076] 4) 10%山羊血清37°C封闭lh;
[0077] 5)弃去山羊血清封闭液，加入稀释好的双标一抗（P2XA兔来源，稀释比例为 1:100)，4°C冰箱过夜；
[0078] 6)次日，恢复室温半小时后，经PBS常规冲洗后放入带有荧光标记的二抗（山羊抗 兔FITC:1:200，山羊抗小鼠TRITC:1:200) 37°C水浴 45min，避光；
[0079] 7)PBS避光冲洗后，荧光封片剂封片；
[0080] 8)荧光显微镜下拍照，分析结果。
[0081] 11、蛋白印迹。
[0082] (1)蛋白提取：将DRG置于加有200μ1组织裂解液（含PMSF)的1ml匀浆器中， 于冰上研磨充分。反复裂解后，将匀浆样品转移到1.5mlEP管中，4°C，12000g离心lOmin， 取上清，按比例加入5Xloadingbuffer和DTT，混匀后煮沸5min，使蛋白变性，-20°C保存， 备用。
[0083] (2)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳：
[0084] 制备SDS-PAGE凝胶，所用试剂如下表：
[0085] 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳构成（ml)
[0088](3)上样及电泳：每孔上样量为25μ1(蛋白含量约为20yg)，样本两边加2μ1 蛋白Marker。浓缩胶恒压90V(约45min)，分离胶120V，待溴酸蓝迀移至胶的下缘时（约 90min)停止电泳。
[0089] (4)转膜：根据蛋白Marker的指示和目的蛋白的分子量准备合适大小的PVDF膜 和2张4层的滤纸，PVDF膜浸入甲醇作用5min后，放入转膜缓冲液中（滤纸置于转膜缓冲 液中）浸泡以备用。电泳完毕后转膜，300mA转膜1个小时。
[0090] (5)免疫反应：
[0091]A)封闭：将膜置于含5 %BSA的TBST封闭液中，水平摇床室温作用2h。
[0092]B) -抗结合：将膜放入用5%BSA配制的一抗（兔来源的P2X3#释比例1:1000， 小鼠抗β-actin单抗稀释比例1:800)中，4°C过夜，或室温平摇3h，TBST洗膜3次。
[0093] C)二抗结合：将膜用IgG-HRP二抗反应液（P2X3:抗为山羊抗兔，按1:2000溶于 封闭液，β-actin为山羊抗小鼠，按1 :5000溶于封闭液）孵育，室温平摇1. 5h后，TBST洗 膜10minX4次。
[0094]D)、免疫复合物的检测：膜加ECL发光剂反应3min后，用保鲜膜包裹，置于X线暗 盒，暗室中剪大小合适X线胶片，曝光l〇s~lOmin，显影、定影，
[0095](7)半定量分析：胶片扫描后，通过Image图像分析软件分析目的条带在的光密度 值，以各组β-actin条带的光密度值标化其相应组P2Xj^蛋白表达量。
[0096] 12、酶联免疫吸附剂测定（Elisa)测定血清TNFa水平。
[0097] (1)血清准备：在第8周末，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，仰卧位固定经颈动 脉取血，离心管收集血液后室温静置30min，3000g离心lOmin，取上清（即血清），分装 后-20 °C保存；
[0098] (2)检测前20分钟从冰箱取出试剂盒和血清，平衡至室温。并取出所需的板条，剩 余的板条密封后放于4°C保存；
[0099] (3)标准曲线的建立：设立8个标准孔，每孔设立3个复孔作为取平均值。每孔中 加入试剂盒中的样品稀释液100y1，之后弟一孔加入标准品100μ1，混勾后取出100y1加 入到第二个孔中，如此反复对半稀释到第7孔，混匀后，从第7孔中吸取100μ1弃去，每孔 体积均为100μ1，第8个孔为空白对照；
[0100] (4)加样：在剩下的干净板条孔中加入待测血清100μ1，并设立3个复孔作为对 昭. ，
[0101] (5)反应板置于37°C反应120min;
[0102] (6)洗板：用试剂盒中的洗涤液充分洗涤反应板4-6次，最后在滤纸上印干液体。
[0103] (7)在每孔中加入100μ1第一抗体工作液；
[0104] (8)反应板充分混匀后置于37°C作用60min;
[0105] (9)洗板：用试剂盒中的洗涤液充分洗涤反应板4-6次，最后在滤纸上印干液体；
[0106] (10)在每孔中加入100μ1酶标抗体工作液；
[0107] (11)反应板充分混匀后置于37°C作用60min;
[0108](12)洗板：同上；
[0109] (13)在每孔中加入100μ1底物液，置于37°C避光作用lOmin;
[0110] (14)在每孔中加入150μ1终止液混匀；
[0111] (15)测 450nm处吸光度。
[0112] 13、氧化应激水平测定。
[0113] 13. 1、过氧化氢酶（CAT)活性测定。
[0114]CAT分解H202的反应可以通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的Η202与钼酸铵作用 可以生成一种淡黄色的络合物，于405nm处测定其生成量，可以计算出CAT的活力，以每毫 升血清每秒钟分解的1μmol的H202的量为一个活力单位。由南京建成公司提供的CAT试 剂盒中包含以下试剂：
[0115] 试剂一：液体100ml1瓶，4°C保存；
[0116] 试剂二：底物液体10ml1瓶，4°C保存；
[0117] 试剂三：显色粉剂1瓶，临用前加双蒸水至100ml溶解，4°C保存；
[0118] 试剂四：液体10ml1瓶，4 °C保存。
[0119]操作步骤如下：
[0120]
[0121] CAT活力计算公式为：
[0122]
[0123] 13. 2、超氧化物歧化酶（SOD)活性测定。
[0124] 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统生成超氧阴离子自由基（02 ·)，后者氧化羟 胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色，测定其吸光度。当被检样品中含有S0D时， 其对超氧阴离子自由基有专一的抑制作用，使其形成的亚硝酸盐减少。通过公式可计算求 出被检样品的S0D活力。由南京建成公司提供的S0D试剂盒中包含以下试剂：
[0125] 试剂一 备液10ml1瓶，用时加双蒸水稀释到100ml，4°C保存；
[0126] 试剂二：液体10ml1瓶，4°C保存；
[0127] 试剂三：液体10ml1瓶，4°C保存；
[0128] 试剂四：液体350μ1X2支，4°C保存；4号稀释液10ml1瓶，用时二者按1:14稀 释；
[0129] 试剂五：粉剂1支，用时加70_80°C双蒸水75ml溶解备用；
[0130] 实际六：粉剂1支，用时加双蒸水75ml溶解备用；
[0131] 显色剂的配制：按试剂五：试剂六：冰乙酸=3:3:2的体积比配显色剂。
[0132] 操作步骤如下：
[0133]
[0134] SOD活力计算公式为：
[0135]
[0136] 14、统计学方法。
[0137] 应用SPSS统计软件对实验数据进行分析，结果以均数土标准差（^ 表示，各 组之间差异性采用方差分析，组间比较采用LSD法，ρ〈0. 05表示有显著性差异，ρ〈0. 01为极 显著差异。
[0138]二、结果。
[0139](一）行为学结果。
[0140] 各组大鼠造模中均未见肢体运动障碍和自残现象。造模前测定各组间机械缩足反 射阈值及热缩足反射潜伏期的基础值差异无显著性（Ρ>〇. 05,F3,2S= 2. 15)。
[0141] 1、机械痛敏（MWT)测定结果。
[0142] 在给予糖尿病饮食4周后，糖尿病模型大鼠的机械缩足反射阈值开始降低，但与 对照组相比其降低无统计学意义（P>〇. 05,F3,2S= 2. 67);给予STZ腹腔注射后2周，糖尿 病模型大鼠的机械缩足反射阈值明显降低，与对照组相比具有显著性差异（P〈〇. 01，F3i2S= 21. 87);糖尿病模型大鼠给予长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸处理后， 机械缩足反射阈值明显增加，与对照相比其差异无统计学意义（P>〇. 〇5，FM4= 1. 67)，而与 糖尿病模型组相比有显著性差异（?〈〇.〇1，匕14= 13.54);而模型+乱序小干扰处理组的与 对照组之间相比有显著性差异（P〈〇. 〇1，匕14= 15. 36)，但与糖尿病模型组相比其差异无统 计学意义（Ρ>〇· 05,Flil4= 2. 96)(见图 1)。
[0143] 2、热痛敏（TWL)测定结果。
[0144] 在给予糖尿病饮食4周后，糖尿病模型大鼠的热缩足反射阈值开始降低