，但与对 照组相比其降低无统计学意义（P>〇. 05,F3,2S= 1. 54);给以STZ腹腔注射后2周，糖尿病 模型大鼠组的热缩足反射阈值明显降低，与对照组相比具有显著性差异（P〈〇. 01，F3i2S = 13. 32);糖尿病模型大鼠给予长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸处理后， 热缩足反射阈值明显增加，与对照组相比其差异无统计学意义（P>〇. 〇5，FM4= 2. 71)，与糖 尿病模型大鼠组相比有显著性差异（p〈〇.〇l，Fl，14= 12.36);而给以模型+乱序小干扰处理 组的与对照组之间相比有显著性差异（P〈〇. 01，FU14= 10.. 76)，但与糖尿病模型组相比其 差异无统计学意义（P>〇. 05,Flil4= 2. 36)(见图2)。
[0145](二）尾神经感觉传导速度结果。
[0146] 在给以糖尿病饮食4周后，糖尿病模型大鼠的尾神经感觉传导速度与对照组相比 无显著性差异（P>〇.〇5,F3,2S= 1.89);给以STZ腹腔注射后2周，糖尿病模型大鼠的尾神 经传导速度明显降低，与对照组相比具有显著性差异（P〈〇.01，F3,2S= 21.37);糖尿病模型 大鼠给予长非编码核糖核酸N0NRATT021972RNA小干扰RNA处理后，尾神经传导速度与对 照相比其差异没有统计学意义（P>〇.05,匕14= 1.44)，与糖尿病模型组相比有显著性差异 (p〈0. 01，匕14= 32. 56);而给以模型+乱序小干扰处理组的与对照组之间相比有显著性差 异（p〈0. 01，Flil4= 26. 57)，但与糖尿病模型组相比其差异无统计学意义（p>0. 05, F1ι14= 1. 16)(见图3)。
[0147](三）逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)。
[0148] 1、长非编码核糖核酸N0NRATT021972表达。
[0149] 采用凝胶成像系统软件分析长非编码核糖核酸N0NRATT021972的RT-PCR结果表 明：糖尿病模型组背根神经节（DRG)中长非编码核糖核酸N0NRATT021972表达水平较对照 组明显增加（P〈〇. 〇l，Flils= 34. 35)，糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干 扰核糖核酸组与对照组之间差异无统计学意义（P>〇. 05,匕18= 2. 98)，而与糖尿病模型组 之间差异有统计学意义（P〈〇. 01，Flils= 43. 21)。糖尿病模型+乱序小干扰处理组长非编 码核糖核酸N0NRATT021972的表达高于对照组（p〈0. 01，Flils= 15. 71)，而与糖尿病模型组 之间无显著性差异（P>〇. 05,Flils= 3. 28)(见图4)。
[0150] 2、P2X3 受体。
[0151] 采用凝胶成像系统软件分析P2XJ^RT-PCR结果表明：糖尿病模型组DRG中P2X3 受体mRNA表达水平较对照组明显增加（p〈0. 01，Flils= 27. 31)，糖尿病模型+长非编码核 糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸组与对照组之间差异无统计学意义（p>0. 05，Flils = 1. 95)，而与糖尿病模型组之间差异有统计学意义（p〈0. 01，Flils= 25. 73)。糖尿病模型+ 乱序小干扰处理组P2X3受体mRNA的表达高于对照组（p〈0. 01，Flils= 65. 46)，而与糖尿病 模型组之间无显著性差异（P>〇. 05,匕18= 3. 87)(见图5)。
[0152](四）免疫组化。
[0153] ?2乂3受体免疫组化。
[0154] 结果分析表明，P2X3受体的免疫反应性表达在糖尿病模型组DRG中表达较对照组 明显增高（P〈〇.〇l，Flils= 36.45);糖尿病模型大鼠给予长非编码核糖核酸N0NRATT021972 小干扰核糖核酸处理后，P2X3受体的免疫反应性表达较糖尿病模型组明显降低（p〈0. 01， 1S= 28. 97)，而与对照组比无显著差异（p>0. 05,F11S= 3. 86)。糖尿病模型+乱序小干 扰处理组？2&受体的免疫反应性表达与糖尿病模型组无显著差异（p>0.05,Flils= 3. 11) (见图6)。
[0155](五）蛋白印迹。
[0156]P2X3蛋白印迹结果。
[0157] 采用软件分析P2X3蛋白印迹结果表明：糖尿病模型组DRG中？2乂3受体表达水平较 对照组明显增加（P〈〇.〇l，Flils= 25. 76);糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972 小干扰核糖核酸组与对照组卩2心受体表达水平之间差异无统计学意义（p>0.05,Flils = 3. 88)，而与糖尿病模型组之间差异有显著性意义（p〈0. 01，Flils= 28. 54)。糖尿病模型+ 乱序小干扰处理组P2X3受体蛋白的表达高于对照组（p〈0.01，Flils= 33. 79)，而与糖尿病 模型组相比其差异无统计学意义（P>〇. 05,匕18= 3. 12)(见图7)。
[0158](六）酶联免疫吸附剂测定（ELISA)检测大鼠血清TNF-α。
[0159]根据试剂盒标准品的浓度梯度：500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62. 5pg/ml、 31.25pg/ml、15.625pg/ml、7.8125pg/ml的lg值和其测定的0D值作标准曲线作图，由软 件进行分析得出回归方程式Y= 〇. 259Lg(X) - 0. 315,R2= 0. 962 (Y表示样品TNF-α的 0D值，X表示样品浓度），将Υ值带入，得出各组血清TNF-α:糖尿病模型组的TNF-α浓 度明显比对照组增高（p〈〇. 01，FU14= 22.98);而糖尿病模型大鼠给予长非编码核糖核酸 N0NRATT021972小干扰核糖核酸处理后，TNF-a浓度比糖尿病模型组明显降低（p〈〇. 01， 14= 45. 34)，与对照组之间无显著性差异（p>0. 05,F114= 2. 98);糖尿病模型+乱序小干 扰处理组的TNF-a浓度与糖尿病模型组之间无显著差异（p>〇. 05^114= 2. 53)(见图8)。
[0160](七）氧化应激测定结果。
[0161]1、过氧化氢酶活性测定结果。
[0162] 结果分析表明，糖尿病模型组过氧化氢酶的活性较对照组明显降低，有统计学意 义（p〈0. 01，Flil4= 26. 76);糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核 酸组与糖尿病模型组之间差异有显著性意义（P〈〇. 〇1，匕14= 13, 46)，而与对照组之间差异 无统计学意义（P>〇. 05,Flil4= 2. 97)，糖尿病模型+乱序小干扰处理组与糖尿病模型组相 比其差异无统计学意义（P>〇. 05,Flil4= 1. 84)(见图9)。
[0163]2、超氧化物歧化酶活性测定结果。
[0164] 结果分析表明，糖尿病模型组和糖尿病模型+乱序小干扰处理组过超氧化物歧 化酶的活性较对照组明显降低（P〈〇. 01，FU14= 57. 88)，糖尿病模型+长非编码核糖核酸 N0NRATT021972小干扰核糖核酸组与糖尿病模型组之间差异有显著性意义（p〈0. 01，F1i14= 21. 33)，而与对照组之间差异无统计学意义（p>0. 05^114= 3. 01)，糖尿病模型+乱序小干 扰处理组与糖尿病模型组相比其差异无统计学意义（P>〇. 05,匕14= 2. 66)(见图10)。
[0165] 发明人研究发现注射长非编码核糖核酸N0NRATT021972的小干扰核糖核酸后，2 型糖尿病模型组DRG中长非编码核糖核酸N0NRATT021972的表达降低，同时观察到注射干 扰试剂后糖尿病大鼠的机械痛和热敏痛阈值升高，且尾神经感觉传导速度增加，表明长非 编码核糖核酸N0NRATT021972的小干扰核糖核酸可降低2型糖尿病神经病理大鼠的痛行 为、改善感觉神经的损伤现象。长非编码核糖核酸N0NRATT021972的小干扰核糖核酸处理 后同时可下调2型糖尿病大鼠背根神经节P2X3受体的表达，降低糖尿病大鼠血清中细胞炎 性因子一肿瘤坏死因子（TNF-a)的含量，增加糖尿病大鼠血清中过氧化氢酶（CAT)和超氧 化物歧化酶（S0D)的活性。因此，长非编码核糖核酸N0NRATT021972的小干扰核糖核酸可能 通过减少TNF-α的释放、增加超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性、降低2型糖尿病神经 病理大鼠背根神经节P2X3受体的表达、抑制背根神经节P2X3受体介导的伤害性信息传递， 减轻2型糖尿病神经病理痛大鼠的痛行为。
【主权项】
1. 长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸在制备治疗糖尿病并发神经病 理痛疾病药物中的应用。2. 长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸在制备糖尿病并发神经损伤疾 病药物中的应用。3. 长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸在制备治疗糖尿病并发感觉神 经炎性相关疾病药物中的应用。4. 长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸以口服、注射、含片或其它局部 或全身用药剂型药物进行上述疾病防治。
【专利摘要】长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸在制备糖尿病并发神经病理痛药物中的应用，实验证实NONRATT021972小干扰核糖核酸可降低背根神经节神经元P2X3受体的表达，降低糖尿病大鼠血清中细胞炎性因子—肿瘤坏死因子的含量，增加糖尿病大鼠血清中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性，抑制背根神经节的伤害性信息传递，减轻神经损伤及炎性物质的伤害剌激，减轻2型糖尿病神经病理痛大鼠的痛行为，可应用于制备糖尿病并发神经病理痛、糖尿病并发神经损伤相关疾病、糖尿病并发感觉神经炎性疾病的药物。
【IPC分类】A61K48/00, A61P25/02, A61K31/7088, A61P3/10, A61P29/00
【公开号】CN105251016
【申请号】CN201510505303
【发明人】梁尚栋, 彭海英, 李桂林, 刘双梅, 徐宏, 高云, 虞诗诚, 樊波
【申请人】南昌大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年8月17日