Cephaloziellin F在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物Cephaloziellin F的新用途，具体涉及Cephaloziellin F在 制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
【背景技术】
[0002] Rui-Juan Li等人首次分离纯化出化合物Cephaloziellin F，并将成果发表在 著名天然产物杂志 Journal of Natural Product 上（Secondary Metabolites from the Chinese Liverwort Cephaloziellakiaeri，J. Nat. Prod.，2013,76,1700-1708)〇
[0003] 目前尚未有该化合物关于治疗慢性粒细胞白血病的活性报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种Cephaloziellin F的医药用途。
[0005] 上述目的是通过如下技术方案实现的：
[0006] Cephaloziellin F在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用，所述 Cephaloziellin F化学结构式如下，
〇·
[0008] 进一步地，所述慢性粒细胞白血病为慢性粒细胞白血病K562。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。
[0010] 实施例1 :Cephaloziellin F的分离制备及结构确证
[0011] Cephaloziellin F的制备方法同文献报道的制备方法（Secondary Metabolites from the Chinese Liverwort Cephaloziella kiaeri，J.Nat. Prod·，2013,76， 1700-1708)ο
[0012] 结构确证：无色油状物（甲醇）。根据HR-ESI-MS可知分子式为C21H 26O6，不饱和度 为 9。核磁共振氢谱数据 δ H (ppm，DMS0-d6,600MHz) :H-1 (1. 49,m)，H-I (1. 91，m)，H-2 (2. 32， m)，H-2 (2. 11，m)，H-3 (6. 83, br，s)，H-6 (I. 79, m)，H-6 (2. 13, m)，H-7 (2. 83, m)，H-7 (2. 22， m)，H-9 (2. 95, t，J = 9. 6)，H-IO (I. 53, m)，H-Il (2. 35, m，2H)，H-12 (5. 40, br，d，J = 6. 6)， H-14(6. 29, br，s)，H-15(7. 35, br，s)，H-16(7. 37, br，s)，H-17(2. 04, s)，H-19(l. 11，s)， 18-0Me (3. 70, s);核磁共振碳谱数据 δ c(ppm，DMS0-d6,150Hz) :20. 8 (CH2,1-C)，25. 7 (CH2， 2-C)，139. I (CH，3-C)，136. 2 (C，4-C)，39. 0 (C，5-C)，29. 4 (CH2, 6-C)，41. I (CH2, 7-C)， 208. 8 (C，8-C)，37. 9 (CH，9-C)，48. I (CH，10-C)，36. 9 (CH2,11-C)，72. 0 (CH，12-C)，124. 3 (C， 13-C)，108. 0 (CH，14-C)，143. 8 (CH，15-C)，139. 0 (CH，16-C)，29. 5 (CH3,17-C)，167. 2 (C， 18-C)，27. I (CH3,19-C)，176. I (C，20-C)，5L I (CH3,18-0Me)。结构确证数据与文献报道一 致，因此可以确定本发明制备的化合物即为文献报道的Cephaloziellin F。
[0013] 实施例2 :Cephaloziellin F的药理作用试验
[0014] -、材料和仪器
[0015] K562细胞由中科院上海生物细胞所提供。C印haloziellin F为自制，HPLC归一 化纯度大于98%。RPMI-1640干粉培养基购于Gibco公司。小牛血清购于杭州四季青生物 工程材料研究所。青霉素、链霉素购于华北制药厂。Glutamine、MTT、DMSO购于AMRESC0。 Annexinv-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。MOPS，Rnasin、 琼脂糖、嗅乙锭、溴酚兰华美生物工程公司华美生物工程公司。
[0016] C0J?箱（美国Thermo公司），超净工作台（苏州净化设备厂），磁力搅拌器（上 海南汇电讯器材厂），倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），水平式离心机（上海安亭科学仪器 厂），电子分析天平（德国Sartorius公司），自动酶标仪（德国Humareader公司），U_3010 型紫外分光光度计（日本HITACHI公司），流式细胞仪（美国BECKMAN公司），Eppendorf Centrifuge 5417R 离心机（德国 Eppendorf 公司）。
[0017] 二、试验方法
[0018] 1、K562细胞的培养
[0019] 将新购买的细胞株的培养瓶表面用75%酒精擦拭3遍。将细胞悬液吸入离心管， 1000 rpm离心10min。弃去上清，滴加含10% NBS的RPMI-1640完全培养基，轻轻吹打制备 成细胞悬液。接种于培养瓶中，置于37°C，5% CO2培养箱中培养，每天换液传代。
[0020] 2、实验分组
[0021] 正常对照组：10 % NBS 的 RPMI-1640 ;实验组：D1 :10 % NBS 的 RPMI-1640+ 终浓度 l〇〇mg/L C印haloziellin F ;D2 :10 % NBS 的即 RPMI-1640+ 终浓度 200mg/L C印haloziellin F ;D3 :10% NBS 的即 RPMI-1640+终浓度400mg/L C印haloziellin F ;D4: 10% NBS 的即 RPMI-1640+ 终浓度 800mg/L C印haloziellin F〇
[0022] 3、MTT法检测C印haloziellin F对K562细胞增殖的影响
[0023] (1)取生长状态良好的细胞，用含10% NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细 胞悬液，以5X IO3细胞/孔接种于无菌96孔培养板中。（2)依实验分组，每组加入不同浓 度的药物50 μ L，设无细胞孔为空白对照组，每组设8个复孔，将96孔培养板放入CO2培养 箱中培养；（3) 24、48和72h后取出96孔培养板，每孔加入20 μ L MTT (5mg/mL)，放入0)2培 养箱中孵育4h，即有紫蓝色结晶物生成，在一定细胞数范围内，结晶物的生成量与细胞数成 正比。（4)每孔加入酸化的SDS 100 μ L放入0)2培养箱中过夜。（5)用酶标仪测定0D，比 色时以空白孔调零。
[0024] 4、AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡
[0025] (1)取生长状态好的细胞，用含10% NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细胞 悬液，并调整细胞浓度为5 X 105/mL，接种于无菌6孔培养板，每孔2mL细胞。（2)依实验分 组加入不同浓度药物，2mL/孔，将6孔培养板放入0) 2培养箱中培养。（3) 48h和72h后收 集各孔细胞于离心管中，1000 rpm离心5min，弃上清。（4)用4°C预冷的PBS洗涤细胞两次， (1500rpm，离心5min)，弃上清，用200 μ L Binding Buffer悬浮细胞，并移入流式管中。（5) 每管加入5yLAnnexinv_FITC混合后，加入5yL PI，混勾。（6)室温，避光反应lOmin，用流 式细胞仪检测。
[0026] 5、统计学处理
[0027] 实验组和对照组均重复3次操作，结果用（x±s表示，P〈0.05示有显著性差异。组 间比较采用单因素方差分析。所有数据用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。
[0028] 三、结果及结论
[0029] 1、MTT法检测C印haloziellin F对K562细胞的增殖抑制作用
[0030] C印haloziellin F作用K562细胞24h、48h、72h后，用酶标仪检测OD49q显示：作用 24h后Dl和D2实验组对细胞K562细胞抑制作用不明显（P>0. 05, P>0. 05)，D3和D4可明 显抑制562结果（P〈0. 05, P〈0. 01)，作用48h和72h后，不同浓度的C印haloziellin F均 可抑制K562细胞增殖，且随剂量和时间的增加抑制细胞增殖的作用增强。结果见表1 (* : 和对照比P〈〇. 05 :和对照比P〈0. 01)。
[0031] 2、Annexinv-FITC/PI双染流式细胞仪分析结果
[0032] 磷脂酞丝氨酸（Phosphotidyl Serine，PS)外翻是细胞凋亡的早期事件。AnnexinV 是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。先后标记了 FITC和 PI (Propidium Iodide)的双染细胞，可通过流式细胞仪将活细胞、早期凋亡细胞（双参数 散点图右下象限）、晚期凋亡细胞及坏死细胞区分开。结果表明不同浓度的Cephaloziellin F作用K562细胞48h和72h均可明显诱导K562细胞早期凋亡，这种效应随C印haloziellin F的浓度增加和作用时间延长而明显增强。结果见表2 (* :和对照比P〈0. 05 :和对照比 P<0. 01) 〇
[0033] 结论，Cephaloziellin F可直接抑制K562细胞的增殖，抑制能力随浓度的增加和 作用时间的延长而增强。同时，Cephaloziellin F可诱导K562细胞凋亡，且这种促凋亡的 效应随着浓度和时间的增加而增加。研究结果显示，Cephaloziellin F可能为慢性粒细胞 白血病的治疗提供一种潜在的手段。
[0034] 表1不同浓度的C印haloziellin F作用K562细胞后的MTT值（X土s，N = 8)
[0035]
[0036] 表2不同浓度C印haloziellin F作用K562细胞后早期凋亡率（x土s，N= 3)
【主权项】
1. Cephaloziellin F在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用，所述 Cephaloziellin F化学结构式如下，2. 根据权利要求1所述的Cephaloziellin F在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的 应用，其特征在于：所述慢性粒细胞白血病为慢性粒细胞白血病K562。
【专利摘要】本发明公开了Cephaloziellin？F在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用，属于药物领域。研究发现Cephaloziellin？F可直接抑制K562细胞的增殖，抑制能力随浓度的增加和作用时间的延长而增强。同时，Cephaloziellin？F可诱导K562细胞凋亡，且这种促凋亡的效应随着浓度和时间的增加而增加。因此可以进一步研究开发成治疗慢性粒细胞白血病的药物。
【IPC分类】A61K31/365, A61P35/02
【公开号】CN105326828
【申请号】CN201510648662
【发明人】吴正锋
【申请人】吴正锋
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年10月9日