°C、5 % C〇2培养箱内常规传代培养。
[0121] 裸小鼠移植瘤模型建立:人大肠癌HCT-116细胞移植瘤，由人大肠癌HCT-116细胞 株接种于裸小鼠皮下而建立。细胞接种量为5X10 6,接种形成移植瘤后，在裸小鼠体内传3 代后使用。取生长旺盛期的瘤组织剪切成Imm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧蔽窝 皮下，建立人大肠癌肥T-116细胞裸小鼠移植瘤模型。
[0122] 动物分组给药:模型建立后，W空白裸小鼠为对照，将造模后的动物随机分为4组， 每组10只，分别为模型组、中药组、5-化组、中药巧-化组。待瘤体长成大约50mm 3时开始给 药，生理盐水及5斗11尾静脉注射给药，中药（即本发明中药复方制剂)灌胃给药，中药组、化 疗组、中药加化疗组分别给予22.5mg/kg/d中药、1 OOmg/kg/d 5-化，22.5mg/kg/d中药+ lOOmg/kg/d 5-Fu，空白组和模型组每天注射等量的生理盐水，连续给药3周。
[0123] 肿瘤体积重量:给药后，每周2次测量肿瘤直径，同时测定小鼠体重。裸小鼠W颈椎 脱白法处死，测量肿瘤长、宽及重量。肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为:TV=l/2 XaXb2,其中a、b分别表示瘤体的长、宽。肿瘤体积抑制率=(1-实验组平均瘤体积/对照组 平均瘤体积）X 100%，瘤重抑制率=Q-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）X 100%。
[0124] 实验结果显示，肠癌小鼠造模7天后，给药前各组肿瘤体积比较差异无统计学意 义，具有可比性。经尾静脉给予22.5mg/kg/d中药、lOOmg/kg/d 5-化，22.5mg/kg/d中药+ 100mg/kg/d5-化后，各组均有不同的抑制作用，中药组、5-即组、中药巧-即组的肿瘤重量抑 制率分别为45.8%、50.3%、65.8%，肿瘤体积抑制率为50.5%、53.1%、69.2%，与模型组 比较，各给药组肿瘤大小及体积均低于模型组(a'b'平<0.01).中药与同剂量的5-RJ瘤重抑制 率分别为45.8%和50.3%，体积抑制率分别为50.5%和53.1 %，两组相比无统计学意义(平 〉0.05)，结果见表4。
[01巧]表4.各组小鼠瘤体重量、体积及各给药组肿瘤抑制率(mean±SD)
[0127] a、b、平〈Q.Qivs模型组，dp〉Q.Q5vs 5-即组 [01%]实验例始B胞实验1
[0129]取常规培养处于对数生长期的LoVo细胞，用含10%胎牛血清的F12K培养液调整浓 度至5 X 104/ml，按照每孔10化1的体积接种至96孔培养板，常规培养。6h细胞贴壁后，每孔 加入10化1含10%胎牛血清的F12K培养液配制的不同浓度上述中药复方醇提物，使其最终 浓度为12.5、25、50、100、200、300、400iig/ml共7个剂量。所有的浓度均设置了 6个重复孔，同 时设立正常培养的细胞为空白对照组。分别在加药2地、4她、72h=个时间点后，吸弃旧培养 液，分别向每孔加入20化I CCK-8检测液（lSOiil无血清RPMI-1640培养液+2化I CCK-8原 液）；继续培养1~地后，酶联发光仪检测吸光值(OD)，评价本发明中药复方制剂对LoVo细胞 生长的抑制作用。检测条件设定为:双波长490nm/630nm。
[0130] CCK-8检测结果提示，本发明中药复方提取物W剂量和时间依赖性方式抑制LoVo 细胞的增殖，作用2地的半数抑制浓度IC50为204.化g/ml，见图1。
[0131] 实验例4细胞实验2
[0132] 取处于对数生长期的LoVo细胞，根据1.2.1检测结果筛选中药醇提物高、中、低剂 量作用24h后，消化收集制备成4. OX 105个/ml细胞悬液，按15化1/室，加入Transwell细胞 培养小室的上室，其中血清浓度为0.5%;同时，将60化1含10μg/ml門bronectin和10%血 清的F12K培养液，加入化answell细胞培养小室的下室，置于37°C、5%C02解箱培养2地。将 Transwe 11细胞培养小室取出，用95 %乙醇固定滤膜IOmin，结晶紫染色15min，用湿润棉签 轻轻拭去滤膜上室面的细胞，中性树胶封片。于光学显微镜（X200)下计数，每膜分别计数 上、下、左、右、中5个不同视野的细胞滤过数，每组每浓度下平行设3个滤过膜进行结果统计 分析，测定LoVo细胞转移能力。为了说明中药是否通过COX-2/0-catenin通路抑制LoVo细胞 转移能力，取LoVo细胞分为W下6组:① Vector组(空质粒组）；②Vector+中药复方中剂量组 (lOOiig/ml);③过表达C0X-2组；④过表达C0X-2+中药复方中剂量组（lOOiig/ml);⑤SB-216763组巧皿ol/L);⑥SB-216763巧皿ol/L) +中药复方中剂量组（100μg/ml)，作用24h按照 上述方法检测LoVo细胞转移能力。
[0133] 与空白对照组比较，中药低、中、高剂量各组均能够明显抑制LoVo细胞的转移能力 (P<0.01)，并呈剂量依赖性，其中高剂量组的细胞转移抑制率为81%，见图2。
【主权项】
1. 一种治疗结直肠癌的中药复方制剂，其特征在于，该中药复方制剂主要由以下重量 份的原料药制成： 黄芪:50-450份 白术:45-200份 地黄:45-200份 补骨脂:50-250份 蛇莓:50-250份 山慈菇:50-250份 八月札：30-150份。2. 根据权利要求1所述的治疗结直肠癌的中药复方制剂，其特征在于，该中药复方制剂 主要由以下重量份的原料药制成： 黄芪：100-300份 白术:90-150份 地黄:90-150份 补骨脂:90-150份 蛇莓：100-200份 山慈菇：100-200份 八月札:60-120份。3. 根据权利要求2所述的治疗结直肠癌的中药复方制剂，其特征在于，该中药复方制剂 主要由以下重量份的原料药制成： 黄芪:200份 白术：120份 地黄：120份 补骨脂：120份 蛇莓：150份 山慈菇：150份 八月札:90份。4. 根据权利要求1所述的中药复方制剂，其特征在于，还包括如下重量份的原料药中的 任意一种或多种:人参50-250份，肉苁蓉50-250份，仙灵脾50-250份，野葡萄藤100-600份， 藤梨根200-400份。5. 根据权利要求1-4任一项所述的中药复方制剂，其特征在于，所述中药复方制剂为中 药内服制剂。6. 根据权利要求5所述的中药复方制剂，其特征在于，所述的中药内服制剂是冲剂、粉 剂、胶囊剂、片剂、糖浆、混悬剂、水煎剂或口服液。7. -种根据权利要求1-4任一项所述的治疗结直肠癌的中药复方制剂的制备方法，其 特征在于，包括如下步骤： 将所述原料药按比例用量混合煎煮3次，第一次加入药物重量和的8倍水，煮沸后，文火 煎煮一定时间后，滤出药液;第一次加入药物重量和的7倍水，煮沸后，文火煎煮一定时间 后，滤出药液;第三次加入药物重量和的6倍水，煮沸后，文火煎煮一定时间后，滤出药液;将 三次所得药液合并，采用文火将药液蒸发浓缩至稠厚状;再加入等量的无水乙醇，充分混 匀，放置过夜，使其沉淀，次日取其上清液，蒸馏回收乙醇，浓缩后静置24h，使沉淀完全过 滤，将沉淀用旋转蒸发器80°C水浴浓缩至稠膏，50°C真空干燥，得粉状中药复方制剂。
【专利摘要】本发明公开了一种治疗结直肠癌的中药复方制剂，该中药复方制剂主要由以下重量份的原料药制成：黄芪50-450份，白术45-200份，地黄45-200份，补骨脂50-250份，蛇莓50-250份，山慈菇50-250份，八月札30-150份。本发明还公开了一种该中药复方制剂的制备方法，按该制备方法可以制备得到质量和疗效稳定的粉状中药复方制剂。本发明的中药复方制剂，可有效解决临床上结直肠癌的治疗问题，尤其是对中晚期结直肠癌或结直肠癌术后脾肾两虚证患者治疗效果明显。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/898
【公开号】CN105663728
【申请号】CN201610118611
【发明人】李琦
【申请人】上海中医药大学附属曙光医院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月2日