一种用于治疗糖尿病性勃起功能障碍的干细胞联合制剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了脂肪干细胞联合内皮祖细胞在制备治疗糖尿病性勃起功能障碍药物中的应用，以及一种用于治疗糖尿病性勃起功能障碍的干细胞联合制剂，是由人来源的脂肪干细胞（ADSCs）和人内皮祖细胞（EPCs）混合配制而成，充分发挥了ADSCs和EPCs两种干细胞的优势，利用ADSCs的旁分泌作用促进EPCs的增殖和分化，从而修复受损伤的血管内皮，显著改善大鼠糖尿病性勃起功能障碍症状；而且克服了ADSCs无法向血管内皮分化和EPCs移植入体内后存活率不高，移植后其增殖、分化能力下降的缺点。本发明ADSCs联合EPCs治疗糖尿病性勃起功能障碍的技术操作简单，制备简便，具有非常重要的临床意义和广阔的应用前景。
【专利说明】
一种用于治疗糖尿病性勃起功能障碍的干细胞联合制剂
技术领域
[0001]本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种用于治疗糖尿病性勃起功能障碍的干细胞联合制剂。
【背景技术】
[0002]糖尿病性勃起功能障碍(diabetic erectile dysfunct1n，DED)患者逐年增多，现有疗法对其疗效不佳。目前临床一线疗法——5型磷酸二酯酶抑制剂(phosphodiesterase type 5 inhibitor，PDE_5I)治疗DED的有效率仅50%?60%。
[0003]现有研究认为DED的始发及核心发病机制为阴茎海绵体血管内皮功能障碍，在此基础上继发勃起相关的神经、平滑肌等损害及一系列病理生理变化。我们通过研究DED大鼠模型证实其海绵体内皮细胞eN0S、VEGF及其受体表达均下降Jesmin等发现DED大鼠海绵体血管内皮细胞凋亡增加，导致一氧化氮(NO)释放减少，引起血管内皮细胞功能障碍;之后可造成海绵体血管壁增厚导致小动脉和毛细血管管腔的狭窄、血栓形成，导致海绵体组织缺血缺氧，进而导致阴茎勃起功能减退，而阴茎微小血管病变进一步造成神经、平滑肌缺血缺氧，加重勃起功能障碍。
[0004]近年来，干细胞移植疗法的研究给DED的治疗带来了希望。脂肪干细胞(ADSCs)移植治疗DED，能够在一定程度上改善勃起功能，可通过分泌VEGF、HGF、FGF2、CXCL5等生长因子改善局部微环境，促进局部功能细胞(如血管内皮细胞)的增殖，改善了血管内皮功能;但是ADSCs在体内不能直接分化为血管内皮细胞，限制了其疗效。2011年Gou等首次应用EPCs移植治疗DED，试图依靠EPCs的增殖、分化以修复受损的海绵体内皮功能及补充外周血的EPCs;结果发现EPCs确实可以整合到海绵体的血管区域并增殖、分化为内皮细胞，移植后DED大鼠的勃起功能得到部分改善，但疗效欠佳。我们的研究也证实了上述结果，同时发现EPCs移植入体内后存活率不高，移植后其增殖、分化能力下降，限制了其疗效和应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有治疗糖尿病性勃起功能障碍药物的不足以及干细胞在该领域应用的缺陷，提供一种合理、方便、治疗效果更好的联合干细胞制剂，涉及两种干细胞在疾病治疗中的应用，具体是脂肪干细胞(ADSCs)和内皮祖细胞(EPCs)联合在制备治疗糖尿病性勃起功能障碍药物中的应用。
[0006]本发明的目的是提供脂肪干细胞联合内皮祖细胞在制备治疗糖尿病性勃起功能障碍药物中的应用。
[0007]本发明另一目的是提供一种用于治疗糖尿病性勃起功能障碍的干细胞联合制剂。
[0008]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
脂肪干细胞(ADSCs)联合内皮祖细胞(EPCs)在制备治疗糖尿病性勃起功能障碍药物中的应用。
[0009 ]其中，优选地，所述内皮祖细胞为人内皮祖细胞。
[0010]优选地，所述脂肪干细胞和内皮祖细胞的比例为I?2:1?2。
[0011 ]更优选地，所述脂肪干细胞和内皮祖细胞的比例为I: I。
[0012]优选地，所述脂肪干细胞的浓度为1.0?10.0 X 1Vml。
[0013]更优选地，所述脂肪干细胞的浓度为3.0?6.0 X 106/ml。
[0014]最优选地，所述脂肪干细胞的浓度为5.0X 1Vml。
[0015]优选地，所述内皮祖细胞的浓度为1.0?10.0X 10%1。
[0016]更优选地，所述内皮祖细胞的浓度为3.0?6.0X 106/ml。
[0017]最优选地，所述内皮祖细胞的浓度为5.0X 106/ml。
[0018]—种用于治疗糖尿病性勃起功能障碍的干细胞联合制剂，包含有效量的脂肪干细胞(ADSCs )联合内皮祖细胞(EPCs)。
[0019]优选地，在所述的干细胞联合制剂中，脂肪干细胞和内皮祖细胞的比例为I?2:1?2。
[0020]更优选地，在所述的干细胞联合制剂中，脂肪干细胞和内皮祖细胞的比例为I: I。[0021 ]另外，更优选地，所述干细胞联合制剂是由脂肪干细胞、内皮祖细胞和PBS混合制备而成。
[0022]优选地，所述脂肪干细胞的浓度为1.0?10.0 X 106/ml。
[0023]更优选地，所述脂肪干细胞的浓度为3.0?6.0 X 106/ml。
[0024]最优选地，所述脂肪干细胞的浓度为5.0X 106/ml。
[0025]优选地，所述内皮祖细胞的浓度为1.0?10.0X 10%1。
[0026]更优选地，所述内皮祖细胞的浓度为3.0?6.0X 106/ml。
[0027]最优选地，所述内皮祖细胞的浓度为5.0X 106/ml。
[0028]优选地，所述的PBS为1XPBS。
[0029]具体优选地，所述干细胞联合制剂的制备方法如下:
分别将脂肪干细胞和内皮祖细胞离心后用I XPBS洗涤I?3次(优选I次)，并用细胞计数板计数，加入I X PBS中分别制备成细胞浓度为1.0?10.0 X 10%1的I X PBS制剂，将两种制剂按照I?2:1?2(优选1:1)的比例混合，得到脂肪干细胞和内皮祖细胞联合注射液。
[0030]其中，优选地，是加入I X PBS中分别制备成细胞浓度为3.0?6.0 X 106/ml的I XPBS制剂。
[0031]更优选地，是加入I X PBS中分别制备成细胞浓度为5.0 X 10%1的I X PBS制剂。
[0032]另外，上述干细胞联合制剂在制备防治糖尿病性勃起功能障碍的药物中的应用，以及由此制备得到的防治糖尿病性勃起功能障碍的药物，也都在本发明的保护范围之内。
[0033]本发明关于用于治疗糖尿病性勃起功能障碍的干细胞联合制剂中，脂肪干细胞(ADSCs)是源自脂肪组织的间充质干细胞，这种细胞扩增能力强，分泌细胞因子种类多，具有多向分化潜能，免疫原性低，获取方法简单。ADSCs治疗勃起功能障碍一般采用阴茎海绵体内注射的方式，通过旁分泌作用改善内皮功能是治疗的关键。而EPCs是一类能定向增殖分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，主要起源于骨髓，能定向迀移和粘附于受损伤的血管内壁，一方面分化为成熟血管内皮细胞，直接形成新生内皮修复损伤血管；另一方面释放大量促血管生长因子(如VEGF等)，刺激损伤区域周围内皮细胞增殖、迀移，加快受损血管的再内皮化，从而快速修复血管内皮功能。EPCs确实可以整合到海绵体的血管区域并增殖、分化为内皮细胞，移植后DED大鼠的勃起功能得到部分改善，但疗效欠佳，EPCs移植入体内后存活率不高，移植后其增殖、分化能力下降，限制了其疗效和应用前景。本发明充分发挥了ADSCs和EPCs两种干细胞的优势，利用ADSCs的旁分泌作用促进EPCs的增殖和分化，从而修复受损伤的血管内皮，显著改善大鼠糖尿病性勃起功能障碍症状;而且克服了 ADSCs无法向血管内皮分化和EPCs移植入体内后存活率不高，移植后其增殖、分化能力下降的缺点。从而达到取长补短的目的。
[0034]另外，本发明的方案中，对于脂肪干细胞(ADSCs)和内皮祖细胞(EPCs)的来源和制备方法并不做严格的限制，可以是任意已知的制备方法或获取方法。如已经授权的发明专利200910196288.3公开的一种获得内皮祖细胞的方法，将市购的骨髓细胞孵育即可得到的悬浮细胞为内皮祖细胞。发明专利201010568873.4公开的一种脂肪干细胞的分离培养方法，以及发明专利201210018269.3公开的一种脂肪干细胞的获取方法等。
[0035 ]本发明实施例部分提供了一种可实施的选择方案:
(I)脂肪干细胞的分离培养
局麻下通过抽脂术获取人皮下脂肪(如患者腹部皮下脂肪)，I型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞，离心得细胞沉淀，加入基础培养基重悬后，在饱和湿度、5%C02、37 °C标准环境下，利用细胞培养液培养后接种到培养瓶中，培养并适时传代。细胞消化时，使用EDTA-胰酶消化，PBS洗涤细胞，ADSCs重新接种于心的培养瓶，每三天传代一次，直至细胞达到所需要的细胞浓度，即终止传代培养。使用成骨诱导和Von Kossa染色、成脂诱导和油红O染色鉴定其多向分化能力。
[0036](2)内皮祖细胞的分离培养:收集到的外周静脉血(如抽取患者外周静脉血)经I3BS等倍稀释后，将稀释液按2:1比例加至于Ficoll淋巴细胞分离液上进行密度梯度离心，取悬液中间层的单个核细胞，用EGM-2MV培养基重悬后，接种于预包被纤维粘连蛋白的培养皿内，在饱和湿度、5%C02、37°C标准环境下培养。72h后换液，去除非贴壁细胞，以后每3天换液。细胞消化时，使用EDTA-胰酶消化，I3BS洗涤细胞，EPCs重新接种于新的培养瓶，每三天传代一次，直至细胞达到所需要的细胞浓度，即终止传代培养。流式细胞分析检测CD31，CD34，CD73，CD105，CDl 17，CDl33等EPCs细胞表面标志；免疫荧光分析检测CD31，vWF，VEGFRl等EPCs细胞表面标志;利用血管腔样结构形成试验检测其分化为血管内皮细胞和形成血管的能力。使用上述方法鉴定EPCs。
[0037]本发明具有以下有益效果:
本发明研究发现，ADSCs和EPCs两种干细胞联合使用用于治疗糖尿病性勃起功能障碍，可以达到协同增效的作用，将ADSCs和EPCs干细胞混合制剂移植到糖尿病性勃起功能障碍的大鼠体内，能显著改善大鼠的勃起功能情况，改善糖尿病所导致的阴茎海绵体内皮功能障碍。
[0038]ADSCs和EPCs两种干细胞联合使用，能够充分利用两种干细胞的优点，发挥ADSCs和EPCs两种干细胞的优势，利用ADSCs的旁分泌作用促进EPCs的增殖和分化，从而修复受损伤的血管内皮，显著改善大鼠糖尿病性勃起功能障碍症状;而且克服了 ADSCs无法向血管内皮分化和EPCs移植入体内后存活率不高，移植后其增殖、分化能力下降的缺点，从而达到取长补短的目的。
[0039]另外，ADSCs和EPCs两种干细胞具有扩增能力强、制备简单、免疫原性低等优点，而且，ADSCs和EPCs干细胞联合制剂的制备方法简单，利用ADSCs和EPCs干细胞联合制剂治疗糖尿病性勃起功能障碍，以此为思路开发可用于临床治疗的干细胞混合制剂具有非常重要的临床意义和广阔的应用前景。
【附图说明】
[0040]图1为ADSCs和cEPC共培养14天后形态学(A)及增殖能力(B)分析结果。
[0041 ] 图2为ADSCs和EPCs联合移植治疗DED大鼠28天后海绵体内压(ICP)和海绵体内压/平均动脉压(ICP/MAP)测定结果。
[0042]图3为ADSCs和EPCs联合移植治疗DED大鼠28天后阴茎海绵体内皮细胞标志物⑶31和eNOS的免疫荧光结果。
【具体实施方式】
[0043]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0044]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0045]实施例1脂肪干细胞与内皮祖细胞联合制剂的制备 1、脂肪干细胞的分离培养
局麻下通过抽脂术获取人皮下脂肪(如患者腹部皮下脂肪)，I型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞，离心得细胞沉淀，加入基础培养基重悬后，在饱和湿度、5%C02、37 °C标准环境下，利用细胞培养液培养后接种到培养瓶中，培养并适时传代。细胞消化时，使用EDTA-胰酶消化，PBS洗涤细胞，ADSCs重新接种于心的培养瓶，每三天传代一次，直至细胞达到所需要的细胞浓度，即终止传代培养。
[0046]使用成骨诱导和VonKossa染色、成脂诱导和油红O染色鉴定其多向分化能力。
[0047]2、内皮祖细胞的分离培养
收集到的外周静脉血(如抽取患者外周静脉血)经PBS等倍稀释后，将稀释液按2:1比例加至于Ficoll淋巴细胞分离液上进行密度梯度离心，取悬液中间层的单个核细胞，用EGM-2MV培养基重悬后，接种于预包被纤维粘连蛋白的培养皿内，在饱和湿度、5%C02、37°C标准环境下培养。72h后换液，去除非贴壁细胞，以后每3天换液。细胞消化时，使用EDTA-胰酶消化，PBS洗涤细胞，EPCs重新接种于新的培养瓶，每三天传代一次，直至细胞达到所需要的细胞浓度，即终止传代培养。
[0048]流式细胞分析检测CD31，CD34，CD73，CD105，CD117，CD133等EPCs细胞表面标志；免疫荧光分析检测⑶31，vWF，VEGFRl等EPCs细胞表面标志；利用血管腔样结构形成试验检测其分化为血管内皮细胞和形成血管的能力。
[0049]使用上述方法鉴定EPCs。
[0050]3、干细胞联合制剂的配制
将收集到的ADSCs和EPCs离心后用I XI3BS洗涤I次，用细胞计数板计数，加入I X PBS中分别制备成细胞浓度为5.0 X 1iVml的I XPBS制剂，将两种制剂按照1:1比例混合成为脂肪干细胞和内皮祖细胞联合注射液。
[0051]
实施例2脂肪干细胞与内皮祖细胞体外共培养及ADSCs在体外对于EPCs增殖和分化的影响
1、方法
将EPCs置于transwelI与ADSCs或SMC共培养，一定时间后取EPCs进行下列检测:在第I，7，14天通过MTS法分析测定EPCs的增殖能力;使用H202-1njured和CCK-8法，检测抗凋亡能力(存活)；使用In Vitro Ang1genesis Assay Kit试剂盒，检测EPCs分化为血管内皮细胞的能力和血管形成能力；观察ADSCs对于EPCs增殖和分化的影响。使用ELISA、Westernblot、PCR等方法，检测ADSCs分泌细胞因子情况(VEGF，HGF，FGF2，CXCL5)、EPCs增殖凋亡分化等相关基因表达(灯-67、0&8-3、1'1]肥10。
[0052]2、结果如附图1所示。
[0053]ADSCs和EPCs共培养14天后，形态学如图A所示，增殖能力如图B所示，将ADSCs与EPCs共培养14天后，EPCs的增殖能力较单独EPCs或SMC与EPCs共培养更高(*p〈0.05)，且在形态学上也可见EPCs明显增多(图A)。
[0054]
实施例3脂肪干细胞与内皮祖细胞联合制剂的应用试验
1、糖尿病性勃起功能障碍(DED)大鼠模型的构建
(I)大鼠适应性饲养I周后，用链脲佐菌素(STZ)按40mg/kg体重左下腹腔内注射。STZ溶液的配制方法:使用0.1 m ο I / L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液(P H 4.0 )，在冰浴中配制1 m g /mlSTZ，注意避光，即配即用;对照组用柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液行左下腹腔注射。观察注射STZ后大鼠症状，一周后检测血糖，任意时间血糖值>16.7mmoI/L为糖尿病(DM)大鼠模型。
[0055](2)DM大鼠模型的建立10周后，选择一安静的房间，将大鼠放在玻璃箱中，适应环境lOmin，室内保持安静，灯光调暗，仅够观察即可，然后在颈项松弛皮肤处注射阿扑吗啡(AP0)100ug/kg，AP0溶解于0.5mg/kg的VitC与生理盐水中，调整体积为5ml/kg，每只大鼠于注射后立刻观察30min，并记录阴茎有无勃起、阴茎勃起次数。龟头充血及末端阴茎体出现为阴茎勃起I次。未见勃起者为DED大鼠。
[0056]2、脂肪干细胞与内皮祖细胞联合制剂移植实验
(I)阴茎海绵体注射
戊巴比妥30mg/kg腹腔注射，麻醉成功后，剪开包皮，暴露阴茎组织，在阴茎根部加止血带，Iml注射器抽取脂肪干细胞与内皮祖细胞联合制剂0.2ml，打入阴茎海绵体；I分钟后松开止血带，缝合包皮。
[0057](2)大鼠勃起状况的评价
主要通过测量平均动脉压(MAP)、海绵体内压(ICP)检测，具体方法如下:戊巴比妥30mg/kg腹腔注射，麻醉成功后，在奥林巴斯显微镜下进行游离并暴露右侧劲总动脉，环形切开包皮，暴露阴茎脚、同时暴露盆神经节、后将含250IU/ml的肝素盐水PE-50导管置入以监测MAP;海绵体内置入一根23G的不锈钢针(充满250IU/ml的肝素盐水)，另一端连接至PE-50导管上，上述两根导管与压力换能器连接，并通过Power Lab四道生理记录仪记录。双极不锈钢电极盆神经节发出约3?4_处勾住海绵体神经，总时间lmin。刺激器参数:单相矩形脉冲刺激5ms、电压3?5V、频率15Hz，波宽Ims，间隔1min后重复一次。
[0058](3)阴茎海绵体形态学指标
测定ICP后处死大鼠，完整切取阴茎海绵体组织，剪去包皮及软骨，横切一小段立即置液氮中保存，利用HE染色、免疫组织化学染色、western blot和PCR等方法检测海绵体:血管密度指标(CD31)、增殖和凋亡指标(K1-67、Cas-3、TUNEL)、血管内皮功能指标(eN0S、vWF)等表达情况。
[0059]3、试验结果
结果如附图2，ADSCs和EPCs联合移植治疗DED大鼠28天后，海绵体内压(ICP)和海绵体内压/平均动脉压(ICP/MAP)测定显示，单独移植ADSCs或ECPs，或者联合移植ADSCs和ECPs，都能明显改善DED大鼠的ICP&ICP/MAP(p〈0.05)，其中与单独移植ADSCs或ECPs组相比，联合移植组改善作用大幅提升，最明显、最显著，表现出了协同增效的作用(p〈0.05)。
[0060]如附图3，ADSCs和EPCs联合移植治疗DED大鼠28天后，阴茎海绵体内皮细胞标志物⑶31和eNOS的免疫荧光结果显示，ADSCs和EPCs联合移植能显著增加DED大鼠海绵窦内皮细胞标志的表达。
【主权项】
1.脂肪干细胞联合内皮祖细胞在制备治疗糖尿病性勃起功能障碍药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述内皮祖细胞为人内皮祖细胞。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂肪干细胞和内皮祖细胞的比例为I?2:I?2ο4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述脂肪干细胞的浓度为1.0?10.0 X 16/ml，所述内皮祖细胞的浓度为1.0?10.0 X 106/ml。5.—种用于治疗糖尿病性勃起功能障碍的干细胞联合制剂，其特征在于，包含有效量的脂肪干细胞和内皮祖细胞。6.根据权利要求5所述的干细胞联合制剂，其特征在于，所述脂肪干细胞和内皮祖细胞的比例为I?2:1?2。7.根据权利要求5所述的干细胞联合制剂，其特征在于，所述干细胞联合制剂由脂肪干细胞、内皮祖细胞和PBS混合制备而成。8.根据权利要求7所述的干细胞联合制剂，其特征在于，所述脂肪干细胞的浓度为1.0?I 0.0 X 10 Vml，所述内皮祖细胞的浓度为1.0?10.0 X 1 Vml，所述的PBS为I XI3BS。9.根据权利要求8所述的干细胞联合制剂，其特征在于，所述干细胞联合制剂的制备方法如下: 分别将脂肪干细胞和内皮祖细胞离心后用I XPBS洗涤，并计数，加入I X PBS中分别制备成细胞浓度为1.0?10.0 X 106/ml的I X PBS制剂，将两种制剂按照I?2:1?2的比例混合，得到脂肪干细胞和内皮祖细胞联合注射液。10.权利要求5?9任一所述干细胞联合制剂在制备防治糖尿病性勃起功能障碍的药物中的应用。
【文档编号】A61K35/28GK106074603SQ201610535281
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】邓春华, 刘贵华, 孙祥宙, 陈鑫, 杨其运, 韩大愚, 夏凯
【申请人】中山大学附属第医院, 中山大学附属第一医院, 中山大学附属第六医院