专利名称：N－乙酰半乳糖胺－4－硫酸酯酶前体,使用所述酶治疗的方法以及生产和纯化所述酶的方法
技术领域：
本发明涉及临床医学、生物化学和分子生物学领域。本发明描述了治疗VI型粘多糖贮积症的治疗物和方法以及制造这种治疗物的生产和纯化过程。
背景技术：
MPS VI(VI型粘多糖贮积症，或Maroteaux-Lamy综合征)是一种溶酶体贮存疾病，其中受影响的患者缺乏N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)。该酶代谢粘多糖(GAG)硫酸皮肤素的硫酸盐部分(见Scriver等主编的《遗传疾病代谢基础》(TheMetabolic Basis of Inherited Disease，New YorkMcGraw-Hill，1989)第1565-1587页Neufeld等所著“粘多糖贮积症”(The mucopolysaccharidoses)部分)。在该酶缺失的情况下，硫酸皮肤素的逐步降解受到阻碍，并且该底物在多种组织的溶酶体中发生细胞内积累。这样的积累导致由多种器官和组织参与的逐渐的功能紊乱，其中患婴在出生时表现正常，但通常在青春期之前死亡。通常在出生6-24个月时对MPS VI作出诊断，此时小孩逐渐表现出生长减速、肝和脾扩大、骨骼畸形、面部特征粗糙、上呼吸道堵塞以及关节畸形。MPS VI患儿中可能发生角膜的逐渐混浊、交通性脑积水或心脏疾病。死亡通常源自呼吸道感染或心脏疾病。与MPS I不同，MPS VI通常不与渐进的精神状态损害相联系，虽然身体上的限制可能影响学习和发育。虽然大部分MPS VI患者具有该疾病的重症形式，通常在十几岁之前死亡，已经描述了可以存活几十年的轻度患者。
多种出版物对MPS VI的发病率进行了估计。Lowry等(Lowry等，Human Genet85389-390(1990))1990年公开的对不列颠哥伦比亚所有1952年到1986年之间出生情况的调查估计发病率为1∶1,300,000。澳大利亚1980-1996年之间出生情况的调查发现了18名患者，发病率为1∶248,000。北爱尔兰的调查(Nelson等，Hum.Genet.101355-358(1997))估计了发病率为1∶840,000。最后，荷兰对1970-1996年的调查计算出每100,000中0.24的新生发病率(Poorthuis等，Hum.Genet.105151-156(1999))。在这些调查的基础上，估计在美国有50到300名患者被诊断为所述病症的各种形式。
虽然有些患者已经从骨髓移植(BMT)中受益(Krivit等，N.Engl.J.Med.311(25)1606-11(1984)；Krivit等，Int.Pediat.747-52(1992))，还没有针对MPS VI的令人满意的治疗方法。由于缺乏适当的供体并且与较高的发病率和死亡率相连，BMT不是可以通用的方法。欧洲骨髓移植小组报道了在63例溶酶体功能紊乱的移植中存在10％(HLA一致的)到20-25％(HLA错配的)的与移植相关的死亡率(Hoogerbrugge等，Lancet 3451398-1402(1995))。除了BMT，大部分患者接受针对具体问题的对症治疗作为其唯一的护理方式。本发明的一个目标是用重组的人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)提供一种酶替代疗法。还没有用rhASB治疗病人的尝试。同样地，没有提供过可接受的临床剂量或药物配方。在猫科动物MPS VI模型上进行过几次酶替代试验。
发明概述本发明包括含高纯度前体形式的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的组合物的生产、纯化与使用。所述前体形式的DNA和编码的氨基酸序列分别表示在SEQ ID NO1和2中。预测的信号序列是SEQ ID NO2的1-38个氨基酸，并且重组生产导致了从SEQ ID NO2的第39或40个氨基酸残基开始的产物。
本发明的第一各方面描述了治疗完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的缺乏而引起的疾病的新方法。一种方法包括用有效量的药物组合物对需要这种治疗的个体给药。在优选的实施方案中，所述药物组合物包含单独或与制药上适当的载体组合的高纯度的前体形式N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶，或其生物活性片段、突变体或类似物。所述个体遭受完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的缺乏而引起的疾病的折磨。在其他实施方案中，这一方法的特征在于将编码完整或部分N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性突变体或类似物体内转移到一个或多个宿主细胞中。优选的实施方案包括按照所要治疗的生物体(优选哺乳动物或人)的要求对剂量进行优化以有效地改善疾病症状。在优选的实施方案中，所述疾病是VI型粘多糖贮积症(MPS VI)或Maroteaux-Lamy综合征。
通过用治疗上有效量的人ASB(优选的是重组的人ASB)进行给药，本发明的所述第一个方面明确提供了治疗遭受完全或部分由ASB活性缺乏所引起的疾病折磨的患者的方法。因此，本发明包括了在制备治疗ASB活性缺失的药物中人ASB的使用以及含用于治疗ASB活性缺失的人ASB的药物组合物。ABS活性缺失可以进行观察，例如如果与ABS活性的正常水平相比活性水平为50％或更低、25％或更低、或10％或更低，并可以表明粘多糖贮积症，例如VI型粘多糖贮积症(MPS VI)或Maroteaux-Lamy综合征。治疗上有效量是足以为患者提供有益作用的数量并且优选提供以下任何一种症状的改善主观上或客观上的关节灵活性、疼痛、或僵硬；运动耐量或耐久性，如通过行走或攀登能力测量的；肺功能，例如通过FVC、FEV1或FET；视敏度；或日常生活的活动性，例如通过从坐姿站立、穿上或脱下衣服或捡起小物体的的能力测量的。人ASB优选以如这里所述的高度纯化的重组制剂的形式给药。优选的制剂含通过反相HPLC测量的纯度大于95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的rhASB。优选的制剂也含高纯度的ASB的前体形式，所以在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上检测不到ASB的加工过的形式。最优选地，前体形式ASB的纯度如通过大小排阻色谱(SEC)-HPLC测量的大于95％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。人ASB还优选与如这里所述的表面活性剂或非离子去垢剂配伍，任选排除与0.001％的聚山梨酯20或80配伍。
已经发现用剂量低于1毫克/千克每周(例如每周0.2毫克/千克)的rhASB给药具有有益的效果。本发明包括了每周至少0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg或1.5mg/kg的剂量，并且可以上升到每周2mg/kg、4mg/kg、5mg/kg或更高的剂量。优选的剂量是每周1mg/kg/。这样的剂量优选每周输递一次输递，但可任选分为如每周两次或每日一次更频繁的时间区间上的相等量。设想了多种包括口服、透皮、透粘膜系统、肺内(包括喷雾)、肌内、皮下或静脉内的注射或非注射的输递相当剂量的给药途径。还具体设想了通过直接向关节或CSF集合药团注射或灌注的给药方式，诸如鞘内药物输送、颅内药物输送、心室内药物输送、经腰椎穿刺或经小脑延髓池给药。本领域内已知多种实现这样的鞘内给药的方法，这包括泵入、贮器、分流或植入。优选地，剂量通过延续1、2或4小时的静脉内灌注输递，最优选延续4小时，但也可以通过静脉内集合药团输递。
也设想了提高人体内ASB活性的其他方法，这包括使患者瞬时或永久提高外源或内源ASB表达的基因治疗方法。外源hASB基因或增强内源hASB基因表达的启动子的转移可以通过多种本领域已知的方法进行，这包括病毒载体、同源重组或直接的DNA注射。
本发明的第二个方面描述了包含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)、或其生物活性片段、突变体或类似物的用于治疗完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)缺陷所引起的疾病的新的药物组合物。在优选的实施方案中，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶是N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体。这样的组合物可以适用于多种给药方式，例如注射、局部用药、鼻内给药、吸入或口服给药。这一方面的范围内包括描述编码完整或部分N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的核酸序列的实施方案，这样的核酸序列可以对受N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)缺陷影响的细胞进行体内给药。
本发明的第三个方面描述了生产能够用于酶法治疗量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突变体或类似物的方法。在一般的实施方案中，该方法包括由编码完整或部分N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性突变体或类似物的cDNA转染适于其表达的细胞的步骤。在优选的实施方案中，所述细胞在恒定的或连续的培养条件下或灌注条件下生长。在另一种实施方案中，所述细胞在不含G418的培养基中生长。在有些实施方案中，使用了编码完整N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)(优选的是人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)的cDNA。然而，在有些实施方案中，可以使用编码其生物活性片段或突变体的cDNA。具体而言，可以进行一个或多个氨基酸置换，同时保持或增强酶的生物学活性。在其他优选的实施方案中，使用了表达载体以将cDNA转入适当的用于表达的细胞或细胞系。在一种尤其优选的实施方案中，所述cDNA转入CHO(中国仓鼠卵细胞)细胞，如CHO-K1细胞系。在还有其他优选的实施方案中，生产工艺包括以下步骤(a)用编码完整人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段或突变体的DNA转染的细胞在适当的生长培养基中生长至适当密度，(b)将转染的细胞导入生物反应器，(c)向生物反应器提供合适的生长培养基，以及(d)将转染的细胞与含所述酶的培养基分离。
本发明的第四个方面提供了转染的细胞系，其特征在于能产生可以用于酶法治疗量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)。在优选的实施方案中，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶是N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体。在优选的实施方案中，本发明描述了如CHO K1细胞系的重组CHO细胞系，该细胞系稳定可靠地产生能用于酶法治疗量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突变体或类似物。特别优选的是称为CSL4S-342的转基因CHO-K1细胞系。在有些优选的实施方案中，该转基因细胞系含有一个或多个拷贝的表达构件。优选所述转基因细胞系含约10个或更多拷贝的表达构件。在更优选的实施方案中，该细胞系以至少每天每107个细胞约20-40毫克的量表达重组N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突变体或类似物。
本发明的第五个方面提供了适于产生能够用于酶法治疗量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突变体或类似物的新的载体。
本发明的第六个方面提供了按照本发明的方法产生的并且因而以能用于酶法治疗的量存在的新的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突变体或类似物。按照本发明的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的具体活性优选介于20-90单位/毫克蛋白，并且更优选大于约50单位/毫克蛋白。在优选的实施方案中，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶是N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体。
本发明的第七个方面描述了纯化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突变体或类似物的方法。按照第一种实施方案，转染的细胞量增长并去除留下重组酶。外源原料通常应该与粗提物中分开以避免堵塞层析柱。优选地，含重组酶的生长培养基经过超滤步骤。在另一种优选的实施方案中，纯化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的方法包括(a)获得含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的液体；(b)降低所述液体中能切割N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的蛋白酶的蛋白水解活性，其中所述的降低不损害所述的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体；(c)将液体与Cibracon蓝染料相互作用层析树脂接触；(d)将液体与铜螯合层析树脂接触；(e)将液体与苯基疏水相互作用层析树脂接触；(f)回收所述的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体。优选地，步骤(c)、(d)和(e)可以连续进行。精通本领域的人员很容易认识到，在本发明范围内可以省略或置换一个或多个层析步骤，或可以改变所述层析步骤的顺序。在其他优选的实施方案中，最后层析柱的洗脱液进行超滤/渗滤，并且进行适当的步骤以去除任何残留的病毒。最终，可以如所述进行适当的灭菌步骤。
图1提供了按照本发明用于生产人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的方法的流程图。
图2提供了按照分批处理方法(表14)用于纯化人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的方法的流程图。
图3提供了按照灌流处理方法(表14和15)用于纯化人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的方法的流程图。
图4A-4C描述了对Blue Sepharose柱(图4A)、Copper Chelating Sepharose柱(图4B)和Phenyl Sepharose柱(图4C)所获得的结果。
图5描述了展示灌流处理纯化方法(表14和15)的银染SDS-PAGE结果的4-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶。
图6A-6F描述了4-20％聚丙烯酰胺梯度SDS凝胶上以下样品的结果泳道1，NEB宽范围预染分子量标准(分子量单位kDa)；泳道2，5微克来自批次AS60001(陈旧的分批处理)的ASB；泳道3，5微克来自批次AP60109 UF4(灌流处理)的ASB；泳道4，5微克来自批次AP60109 UF10(灌流处理)的ASB；泳道5，5微克来自批次AP60109 UF15(灌流处理)的ASB；泳道6，5微克来自批次AP60109 AUF18(灌流处理)的ASB；泳道7，5微克来自批次AP60109 AUF22(灌流处理)的ASB；泳道8，5微克来自批次AP60109 AUF25(灌流处理)的ASB；以及泳道9，5微克来自批次AP60109 AUF27(灌流处理)的ASB。凝胶用考马斯亮蓝R-250或银染染色。
图7A描述了银染的4-20％聚丙烯酰胺梯度SDS凝胶上的结果。图7B描述了考马斯亮蓝染色的4-20％聚丙烯酰胺梯度SDS凝胶上的结果。泳道1，批次AP60202UF4；泳道2，批次AP60202 UF10；泳道3，批次AP60202 UF18；泳道4，批次AP60202(BMK)；泳道5，批次102PD0139x B3；泳道6，批次102PD0139x B5；泳道7，灌流对照标准品rhASB-202-002；泳道8，批次102PD0139P1；泳道9，批次102PD0139P2；以及泳道10，Mark 12标准(分子量单位kDa)。
图8A-8C描述了对Blue Sepharose柱(图8A)、Copper Chelating Sepharose柱(图8B)和Phenyl Sepharose柱(图8C)所得到的色谱图。图8B中组织蛋白酶活性用红线表示。
图9A描述了银染的4-20％聚丙烯酰胺梯度SDS凝胶的结果。图9B描述了从图9A的凝胶转移到硝化纤维素膜并用抗rhASB抗体探测的蛋白的结果。图9C描述了从图9A的凝胶转移到硝化纤维素膜并用抗组织蛋白酶抗体探测的蛋白的结果。BioLabPreStain表示分子量标准(分子量单位kDa)。
图10表示人体1/2期临床研究中用rhASB治疗96周后的血清抗ASB抗体水平。
图11表示人体1/2期临床研究中用rhASB治疗96周后全尿GAG水平的降低。
图12表示用rhASB治疗的人体内第96周的尿GAG水平与同年龄相适应的正常水平的比较。
图13表示人体1/2期临床研究中用rhASB治疗96周后6分钟步行测试结果的提高。
图14表示人体2期临床研究中治疗48周后的血清抗ASB抗体水平。
图15表示人体2期临床研究中治疗48周后全尿GAG水平的降低。
图16表示用rhASB治疗的人体内第48周的尿GAG水平与同年龄相适应的正常水平的比较。
图17表示人体2期临床研究中治疗48周后12分钟步行测试结果的提高。
图18表示人体2期临床研究中治疗48周后3分钟爬楼梯结果的提高。
图19表示人体2期临床研究中治疗48周后延长时间的起立并行走测试结果。
图20和21分别表示人体2期临床研究中治疗48周后关节疼痛和关节僵直问卷的结果。
发明详述本发明包括含高度纯化的前体形式N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的组合物生产、纯化与使用。如通过反相HPLC法所测定的，前体形式N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的纯度至少等于或高于总蛋白的95、96、97或98％。优选地，该纯度至少等于或高于99％。更优选地，该纯度至少等于或高于99.1、99.2、99.3或99.4％。甚至更优选地，该纯度至少等于或高于99.5、99.6、99.7或99.8％。甚至更优选地，该纯度至少等于或高于99.9％。N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的纯度使用反相HPLC法(见实施例9)测量。N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的纯度是该组合物基本不含任何可通过反相HPLC法检测的污染的细胞蛋白或降解的或成熟的或加工过的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的原因。所有百分比纯度建立在通过反相HPLC法测定的总蛋白的基础上。使用这里所公开的纯化工艺可以始终获得可重复的高纯度，这使得用每次治疗(例如每周)进行给药的高纯度rhASB制剂治疗那些需要长期持续治疗的患者成为可能。因此，本发明设想了长时期(例如12周、24周、48周、96周或更长)用这样高纯度的前体rhASB给药。
本发明的第一个方面描述了治疗完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)缺陷引起的疾病的新方法。在一种实施方案中，该方法描述了用单独或与制药上适当的载体组合的重组N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶，或其生物活性片段、突变体或类似物给药。在其他的实施方案中，该方法描述了编码完整或部分N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性突变体的核酸体内转移入一个或多个宿主细胞。优选的实施方案包括按所治疗生物体(优选哺乳动物或人)的要求对剂量进行优化以有效改善疾病症状。在优选的实施方案中，所述疾病是VI型黏多糖贮积症(MPS VI)，Maroteaux-Lamy综合征。
N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的纯度是组合物基本不含任何污染的细胞蛋白的原因，这些蛋白会引起N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体给药的个体的免疫或过敏反应。一种组合物基本上不含这样的污染的宿主细胞蛋白，如果对个体给药时不会引起任何免疫或过敏反应。N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的高纯度对于避免个体对存在于药物组合物中的杂质产生免疫或过敏反应来说是至关重要的。尤其是对于从中纯化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的细胞的蛋白而言。当在CHO细胞中表达并从中纯化重组N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体时，CHO蛋白能引起个体的免疫或过敏反应(例如荨麻疹)。避免这种类型的反应的唯一方法是确保N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体足够纯，这样污染的CHO蛋白的量不足以引起这样的反应。由于个体包括患MPS VI的患者并由此已经是缺乏免疫力的，所述药物组合物的纯度尤其重要。
同样优选地，N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的纯度使得组合物仅含有痕量加工过的或降解的形式。存在于宿主细胞中的蛋白酶将N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶分割成更低分子量的形式。虽然有些这样的形式也可以具有酶活性，对于细胞摄取和溶酶体靶向优选前体形式，因此希望在最终的制剂中具有更高量的未加工的前体ASB。而且，药品中ASB的降解形式也可能造成更高的发病率或更大量针对ASB自身的抗体，这在需要对患者进行长期治疗的情况下是非常不希望的。如通过SDS-PAGE、RPHPLC和SEC-HPLC组合所检测的，这里所述的灌流纯化工艺导致获得基本不含污染的宿主细胞蛋白或加工的/聚合形式的ASB的高纯度的制剂。对人体给药时，通过这一工艺生产的产品看来具有更长的半寿期。
重组的人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)的指征是MPS VI(也称作Maroteaux-Lamy综合征)的治疗。按照优选的实施方案，向遭受N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶缺陷折磨的患者提供1mg/kg(约50U/kg)的初始剂量。优选地，N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶每周通过注射给药。按照其他优选的实施方案，初始剂量约3个月内没有表现出尿粘多糖排泄降低至少50％的患者改为2mg/kg(约100U/kg)的剂量。优选地，只要疾病的显著临床症状持续存在，每周一次在约4小时的时间内用N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)或其生物活性片段、突变体或类似物进行静脉内给药。同样优选地，通过置于头静脉或其他适当的静脉内的静脉内导管以约30cc/小时开始将N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)随盐溶液灌注进行给药。进一步，优选地是将N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)稀释于约250cc普通盐溶液中。
本发明的第二个方面描述了含人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)或其生物活性片段、突变体或类似物的用于治疗N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶缺陷的药物组合物。除了上述的优选实施方案以外，该重组酶可以通过多种方式给药，例如注射给药、局部给药、鼻内给药、吸入给药或口服给药。本发明的另一个方面通过与药学上可接受的载体(可以是固体、半固体或液体或可吸收的胶囊)设计而提供该酶的给药途径。药物组合物的例子包括片剂、滴剂(如滴鼻剂)、用于局部使用的组合物(如油膏、凝胶剂、乳膏和悬液)、用于吸入的喷剂、鼻喷剂、脂质体。通常组合物包括重量0.05-99％或0.5-99％之间的重组酶，例如，用于注射的组合物含0.5-20％，用于口服给药的组合物含0.1-50％。
为生产用于口服的含治疗性酶的这一剂量单位形式的药物组合物，酶可以与固体粉末状载体混合，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、诸如马铃薯淀粉、玉米淀粉、支链淀粉等淀粉、海带粉、柑桔果肉粉、纤维素衍生物或明胶，并且也可以包含如硬脂酸镁或硬脂酸钙或碳蜡(Carbowax)或其他聚乙烯二醇蜡等润滑剂并压缩以形成片剂或糖丸核心。如果需要糖丸，核心可以用例如可能含阿拉伯树胶、滑石粉和/或二氧化钛的浓缩糖溶液或另外用溶于易挥发的有机溶剂或有机溶剂混合物中的成膜物质进行包被。可以在这些包衣中添加染料，例如用以区分不同活性物质包含物。对于由明胶和例如作为可塑剂的甘油构成的软胶囊或类似的封闭的胶囊，活性物质可以与碳蜡或适当的油(例如如芝麻油、橄榄油或落花生油)混合。硬胶囊可以包含活性物质颗粒以及固体的粉末状载体(诸如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、如马铃薯淀粉、玉米淀粉或支链淀粉的淀粉、纤维素衍生物或明胶)，并也可以包含硬脂酸镁或硬脂酸作为滑润剂。
本发明的治疗性的酶也可以通过单一注射或泵灌注或通过皮下植入持续释放采用诸如皮下、肌肉或静脉注射等注射方式给药，并且治疗性的酶也可以通过吸入给药。在皮下、肌肉和静脉注射中，治疗性酶(活性成分)可以溶解或散布在液态载体媒介上。对于注射给药，活性成分可以与允许的媒介(优选如花生油、棉花籽油等等的多种植物油)适当混合。也可以使用其他的注射媒介，如使用胂羧(solketal)、甘油、甲酸的有机组合物以及水性注射剂型。
对于通过注射的非肠道应用，组合物可以包括与本发明相应的活性酸的药学上可接受的水溶盐(希望浓度0.5-10％)的水溶液，以及任选水溶液中的稳定剂和/或缓冲物质。溶液的剂量单位可以方便地附在安瓿上。
当治疗性酶以皮下植入的方式给药时，所述化合物悬浮或分散在精通本领域的人员所知的缓释材料中，或通过使用如渗透泵等恒定推力的装置缓慢释放活性物质进行给药。在这样的情况下给药时间可能延长。
对于局部应用，药物组合物的适当形式是油膏、细胞、悬液、乳膏等等。活性物质的量可以是变化的，例如重量比0.05-20％之间的活性物质。这样的局部应用的药物组合物可以通过将活性物质与诸如异丙醇、甘油、石蜡、硬脂醇、聚乙二醇等等已知的载体原料混合的已知方式进行制备。药学上可接受的载体也可以包括已知的化学吸收促进剂。吸收促进剂的例子有，例如二甲基乙酰胺(美国专利3,472,931)、三氯乙醇或三氟乙醇(美国专利3,891,757)、某些醇及其混合物(英国专利1,001,949)。英国专利说明书1,464,975中也描述了一种在完整皮肤上局部使用的载体材料，该说明书公开了由含40-70％(v/v)异丙醇和0-60％(v/v)甘油的溶剂和如果存在则不多于溶剂总体积40％的惰性成分稀释剂作为平衡液构成的载体材料。
含药物组合物的治疗性酶的给药剂量可以在宽广的区间内变化并且应取决于如疾病严重度、患者年龄等等多种因素，并且可以进行个体化调节。提到的可以每日给药的治疗性酶量的可能的区间从约0.1毫克到约2000毫克或从约1毫克到约2000毫克。
含治疗性酶的药物组合物可以是适当剂型的，从而它们提供了这些区间内作为单一剂量单位或多种剂量单位的剂量。除了含治疗性酶之外，所述剂型可以含一种或多种参与由组合物中治疗性酶催化反应的底物或辅助因子。含治疗性酶的组合物也可以含一种以上治疗性酶。同样地，治疗性酶可以以与另一个部分(例如PEG)结合的偶联形式存在。此外，治疗性酶可以含一个或多个靶向部分或转运肽以帮助向感兴趣的组织、器官或细胞器传送。
所述方法和组合物中所使用的重组酶也可以通过用编码N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、突变体或类似物的核酸转化患者细胞的方式进行给药。如此编码的核酸序列可以结合在载体上用以转化所治疗患者的细胞。这里描述了这样的载体的优选实施方案。载体可以设计成整合入主体染色体(例如逆转录病毒载体)或在宿主细胞中自我复制。含编码N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶核苷酸序列的载体可以如此设计以实现酶的持续或可控表达。此外，编码所述酶的遗传载体可以设计成稳定整合入细胞基因组或只是瞬时存在。常规遗传治疗的通用方法可以用于编码N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的寡核苷酸序列。常规遗传治疗技术的综述可以参见Friedman，Science2441275-1281(1989)；Ledley，J.Inherit.Aletab.Dis.13587-616(1990)；以及Tososhev等，Curt Opinions Biotech.155-61(1990)。
重组酶给药的尤其优选的方法是静脉给药。尤其优选的组合物包括重组N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、标准盐溶液、维持pH约5-7的磷酸缓冲液和人白蛋白。组合物可以另外包含如聚山梨醇酯20或80(Tween-20或Tween-80)等聚氧乙烯山梨聚糖以提高稳定性并延长保存期。另外，组合物可以包括本领域已知的表面活化剂或非离子去垢剂，这包括但不限于聚氧乙烯山梨聚糖40或60；聚氧乙烯脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨聚糖单异硬脂酸；聚醚，如聚醚188或聚醚407；辛苯聚糖-9或辛苯聚糖40。
优选地，表面活化剂或非离子去垢剂存在的浓度至少是0.0001％、或至少是0.0005％、或至少是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％或0.005％(w/v)。优选地，该浓度是达到希望的稳定性的最低的必须量，不过可以达到0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％或0.02％(w/v)。最优选地，该组合物包括浓度为0.005％±0.003％(例如0.002％到0.008％)的聚山梨醇酯。这些组合物成分可以优选地以以下的量提供N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶1-5mg/ml or 50-250units/ml氯化钠溶液 IV袋中150mM，50-250cc总体积磷酸钠缓冲液 10-100mM，pH5.8，优选10mM人白蛋白(可选) 1mg/mlTween20或Tween80 0.001％-0.005％(w/v)在优选的实施方案中，ASB剂型是150mM NaCl、10mM NaPO4，pH5.8、0.005％聚山梨醇酯80中1mg/ml ASB。
本发明的第三个方面描述了生产满足酶治疗量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突变体或类似物的方法。在一般的实施方案中，该方法包括将编码完整或部分N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性突变体或类似物的cDNA转染适于其表达的细胞的步骤。在有些实施方案中，使用了编码完整N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(优选人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)的cDNA。然而，在其他实施方案中，可以使用编码其生物活性片段或突变体的cDNA。具体而言，可以进行一个或多个氨基酸置换，同时保持或增强酶的生物学活性。
在其他优选的实施方案中，使用表达载体以将cDNA转移至适于其表达的细胞或细胞系。在一种尤其优选的实施方案中，将cDNA转染中国仓鼠卵细胞(如CHO-K1细胞系)。在还有其他优选的实施方案中，生产工艺包括以下步骤(a)用编码完整人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段或突变体的DNA转染的细胞在适当的生长培养基中生长至适当密度，(b)将转染的细胞导入生物反应器，(c)向生物反应器提供合适的生长培养基，(d)收获所述含重组酶的培养基，以及(e)将转染的细胞与所收获的培养基充分分离。
适于转染细胞生长的培养基是补充了L-谷氨酸、葡萄糖和次黄嘌呤/胸苷、可选地含或不含G418的JRH Excell 302培养基。在一种优选的培养基中，所述JRHExcell 302培养基进一步补充了叶酸、丝氨酸、以及天冬酰胺酸，并且培养基中不存在G418。使用这一优选的培养基培养细胞与使用补充了G418但不含叶酸、丝氨酸和天冬酰胺酸的培养基相比提供了更高纯度的前体rhASB(见图6泳道2)。优选地，细胞在这样的培养基中生长达到细胞密度约1×107细胞/毫升导致获得10-40mg/ml活性酶。而且，转染细胞优选地在生物反应器中生长约5到15天，更优选约9天。优选地，使用灌流处理并收集策略使转染细胞在生物反应器中生长持续到35天。更优选地，使用灌流处理并收集策略使转染细胞在生物反应器中生长持续到45天。甚至更优选地，使用灌流处理并收集策略使转染细胞在生物反应器中生长持续到60天。较之更优选地，使用灌流处理并收集策略使转染细胞在生物反应器中生长持续到90天。
按照优选的实施方案，通过经连续的膜(如10μm膜，随后1μm膜，随后0.2μm膜)过滤可以将转染细胞与生物反应器上清液充分分离。过滤前可以丢弃任何剩余的收获的培养基。
重组的人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶可以在中国仓鼠卵细胞中生产(Peters等，J.Biol.Chem.2653374-3381)。其摄取由大部分(如果不是全部)细胞所表达的高亲和甘露糖-6-磷酸受体介导(Scriver等主编的《遗传疾病代谢基础》(TheMetabolic Basis of Inherited Disease.New YorkMcGraw-Hill(1989))一书1565-1587页Neufeld等所著“黏多糖贮积症”(The mucopolysaccharidoses))。一旦与甘露糖-6-磷酸受体结合，该酶经表面的凹陷内吞并转运至溶酶体。在溶酶体的pH值下，该酶具有活性并开始从累积的硫酸皮肤素上去除硫酸残基。在MPS VI成纤维细胞中，酶储备的清除是迅速的并在酶暴露的92小时之内得以简单地展示(Anson等，J.Clin.Invest.99651-662(1997))。按照符合图1描述的流程图的过程，可以以10升发酵规模(约90升工作体积)进行重组酶的生产重组酶可以使用下列如表1A-C中所示的方法进行生产。
表1A通过分批补料方法的细胞培养过程
在一种实施方案中，转染细胞在细胞培养过程中生长，该过程是一种具有收集步骤的持续35天或更多天的灌流方法，收集速度是从110升反应器中每天收集约400升。优选地，收集速度是从110升反应器中每天收集约800升。表1B中说明了比较灌流细胞培养方法和分批细胞培养方法的流程图。表1C中概述了与分批补料方法的比较以及实现基于灌流的细胞培养方法的具体该动的细节。
表1B分批补料与灌流方法细胞培养过程比较
表1C分批补料与灌流方法之间差异的综合描述
对于分批补料和灌流方法来说，用于放大过程的接种体制备是相同的。在一种实施方案中，通过从工作细胞库中复苏一管细胞并将其内容物(约1毫升)移到T75cm2细胞培养瓶约25毫升EX-CELL 302培养基中(改进的含L-谷氨酸，不含苯酚红)开始rhASB细胞培养。在每个放大步骤中，孵育细胞培养物直到活细胞计数达到约0.8×106细胞每毫升。每个细胞放大步骤用细胞生长(细胞密度)和活力(通过台盼蓝染色排除法)进行监测。所有的EX-CELL 302培养基(改进的含L-谷氨酸，不含苯酚红)的添加和细胞转移在无尘操作柜无菌条件下进行。细胞培养物依次从T75cm2烧瓶放大到250毫升摇瓶、到两个250毫升摇瓶、到两个3升摇瓶并最后放大到两个8升摇瓶。整个放大过程持续约14天。当两个8升摇瓶达到至少1.0×106细胞每毫升的密度时，摇瓶作为110升反应器的种子。
对于rhASB表达或生产或制造的反应器操作优选采用基于灌流的细胞培养过程。优选地，相比于使用分批补料方法的每毫升4-5百万个细胞，使用灌流方法的反应器可以控制细胞密度达到每毫升3千7百万个细胞。
灌流方法(35天)比分批补料方法(11-12天)运行时间更长并产生比分批补料方法(每次运行190升)更大体积的收获的细胞培养液(以每天5倍导管体积的灌流速度每天约400升)。优选地，直到35天进行收获，总共收集约8400升上清液。
细胞生产的结束(EPC)按照ICH指导评价其遗传稳定性、一致性、无菌性和外来物污染。优选地，从在cGMP条件下生产的AC60108为期35天的反应器运行得到的EPC结果表明没有生长或阴性结果，或没有检测到细菌和真菌、支原体、外来病毒污染、小鼠病毒或其他污染物或颗粒的存在。
本发明的第四个方面提供了转基因细胞系，其特征是能产生能满足酶治疗量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突变体或类似物。在优选的实施方案中，本发明描述了稳定可靠产生满足酶治疗量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的重组中国仓鼠卵细胞系(如CHO K1)。尤其优选称为CSL4S-342的CHO-K1细胞系。在有些优选的实施方案中，该细胞系含一个或多个表达构件。更优选地，该细胞系含约10个或更多拷贝的表达构件。在甚至更优选的实施方案中，该细胞系每107个细胞每天表达至少约20-80或40-80毫克的量的重组N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)。
由称为CSL4S-342的稳定的转染CHO-K1细胞系可以产生重组人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)。文献中对该细胞系进行了描述(Crawley，J.Clin Invest.99651-662(1997))。主要细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)在TektagenInc.(Malvern，PA)制备。这些细胞库按照ICH对重组哺乳动物细胞系的建议指导进行了特征描述。
本发明的第五个方面提供了适于生产满足酶治疗量的人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突变体或类似物的新的载体。
本发明的第六个方面按照本发明的方法提供了新的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突变体或类似物，并满足使用酶治疗所需的量。按照本发明，N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)优选的具体活性是约20-90单位，更优选每毫克蛋白大于50单位。优选地，该酶具有去糖基化分子量约55-56kDa，最优选约55.7kDa。优选地，该酶具有糖基化分子量约63-68kDa，最优选约64-66kDa。本发明也包括了含天然的人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的截短分子、类似物和突变体的生物活性片段。
由人的cDNA预测N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶是含41个氨基酸的信号肽的533个氨基酸组成的蛋白质(Peters等，J.Biol.Chem.2653374-3381)。去除信号肽后预测的分子量是约55.9kDa。由于糖基化修饰，重组酶在SDS-PAGE上的表观分子量是64kDa。预测的蛋白序列含6个N-相连的寡聚糖修饰位点，基于2kDa的平均分子量和预测的与表观分子量之间8kDa的差异，可以使用其中4个位点。胞内蛋白的成熟形式是3个由半胱氨酸键连接的肽。最大的肽的分子量是47kDa；其他两个分子量分别是6和7kDa。
表2提供了按照本发明的方法生产并纯化的药物的描述。
表2药物初步说明
*对由反应器收获的上清液进行检测(通过过滤去除细胞以后)本发明的第七个方面描述了纯化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突变体或类似物的新方法。按照第一种实施方案，培养并去除转染的细胞量从而留下重组酶。通常应将外源材料与粗提物分离以防止堵塞层析柱。优选地，含重组酶的生长培养基经过超滤和渗滤步骤。在一种方法中，过滤的溶液流经DEAESepharose色谱柱，随后Blue Sepharose色谱柱，随后Cu++Chelating Sepharose色谱柱，以及随后的Phenyl Sepharose色谱柱。这样的包括依次使用DEAESepharose、Blue Sepharose、Cu++Chelating Sepharose和Phenyl Sepharose的四步柱层析导致获得特别高度纯化的重组酶。精通本领域的人员认识到，在本发明的范围内可以省略或置换一个或多个层析步骤或可以改变这些步骤的顺序。在另一种优选的实施方案中，对来自最后一个色谱柱的洗脱液进行超滤/渗滤，并且进行适当的步骤以去除任何残留的病毒。最后，可以按需要进行适当的灭菌步骤。重组酶可以按照图2所述的过程进行纯化。对于患者来说重组酶的质量是关键的。通过这一方法生产的rhASB是足够纯的(＞95％)。
在一种优选的实施方案中，采用约10mM的磷酸钠溶液和约100mM的氯化钠溶液在pH约7.3的条件下进行超滤/渗滤。在另一种实施方案中，DEAE Sepharose层析步骤在pH约7.3的条件下进行，其中洗脱液用适当的缓冲液(优选氯化钠和磷酸钠缓冲液)进行调节。在另外的优选实施方案中，Blue Sepharose层析步骤在pH约5.5的条件下进行，其中洗脱液用适当的缓冲液(优选氯化钠和醋酸钠缓冲液)进行调节。同样地，在优选的实施方案中，Cu++Chelating Sepharose层析步骤用含氯化钠和醋酸钠的洗脱缓冲液进行。在特别优选的实施方案中，对来自层析的洗脱液(其中重组酶在如氯化钠和磷酸钠缓冲液(pH约5.5-6.0，最优选pH5.8)的剂型缓冲液中浓缩至浓度约1mg/ml)进行第二次超滤/渗滤。由于磷酸盐缓冲液能防止酶的严重降解并提高其稳定性，磷酸盐缓冲液是所述过程中优选使用的缓冲液。
表3中显示了对本发明范围内尤其优选的纯化方法的更详细的描述。
表3纯化过程综述
调配的原料药物质可以在100级无尘操作柜中经0.04微米或优选2微米滤器灭菌装入1型玻璃瓶。使用半自动充液器可以装满这些小瓶至终体积约5毫升。随后这些小瓶可以手工加盖、密封并标记。
纯化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的更优选的方法包括(a)获得含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的液体；(b)降低所述液体中能切割N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的蛋白酶的蛋白水解活性，其中所述的降低不损害所述的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶；(c)将该液体与Cibracon蓝染料相互作用层析树脂接触；(d)将该液体与铜螯合层析树脂接触；(e)将该液体与苯基疏水相互作用层析树脂接触；以及(f)回收所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体。优选地，步骤(c)、(d)和(e)依次进行。这一方法要求不多于3个层析步骤或层析柱。为了获得高度纯化的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体，不需要另外的层析步骤或层析柱。这一方法不包括将液体与DEAE Sepharose树脂接触。回收的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体具有至少等于或大于99％的纯度。整体的回收率可以达到至少约40-60％。
优选地，获得含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的液体包括使用编码N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的基因转化的细胞培养物生长；优选地，该基因编码人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞。更优选地，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵细胞。该获得步骤可以进一步包括由所述细胞培养物收获该液体。该获得步骤可以进一步包括将所述液体浓缩约20倍。
这一方法的一个特征是蛋白酶活性与N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的早期分离。这一分离可以包括(1)蛋白酶活性的降低、抑制或灭活，或(2)蛋白酶与N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的物理分离。优选地，在纯化过程中这一分离尽可能早地发生。其目的是使切割成成熟或加工形式和/或其他降解形式的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的分子数量达到最低。由于其更容易被目标组织吸收并更易于随后靶向溶酶体，相比于成熟或加工形式，N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的前体形式是优选的形式。蛋白酶活性更早或更快地与N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体分离，可能切割成成熟或加工形式的前体分子的数量就越少。
通过将液体pH值调节到约4.8-8.0之间降低或抑制蛋白酶活性。优选地，该pH值介于约4.8-5.5之间。更优选地，该pH值介于约4.8-5.2之间。希望降低的具体蛋白酶活性是将前体形式N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶特异性切割成成熟或加工形式的蛋白酶活性。在一种或多种半胱氨酸蛋白酶中发现了这样的蛋白酶活性。组织蛋白酶L是一种特异性切割N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的半胱氨酸蛋白酶。这一组织蛋白酶L的无活性形式具有约36kDa的分子量，当暴露在低于5.0的pH值时，它转化成大小21-29kDa的活性形式(见图9C)。可以将pH值调节为任何值，使得该蛋白酶不由其无活性形式转化成活性形式并且需要的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体或其生物学活性不受损害或不可逆的损害。
优选地，步骤(c)包括该液体流经Cibracon蓝染料相互作用层析柱。更优选地，该Cibracon蓝染料相互作用层析柱是Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱。优选地，步骤(d)包括该液体流经铜螯合层析柱。更优选地，该铜螯合层析柱是Chelating Sepharose Fast Flow层析柱。优选地，步骤(e)包括该液体流经苯基疏水相互作用层析柱。更优选地，该苯基疏水相互作用层析柱是Phenyl Sepharose 6Fast Flow High Sub层析柱。优选地，步骤(c)、(d)和(e)的时间顺序是步骤(c)、步骤(d)和步骤(c)。
回收步骤可以包括该液体的超滤以及/或渗滤。回收可以包括过滤该液体以去除DNA以及/或过滤该液体以去除病毒。用于去除病毒的过滤步骤可以包括将所述液体流经0.02微米的滤器。
这一方法也可以用于纯化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、类似物或突变体。
使用基于疏水性差异分离蛋白质的反相高效液相色谱(RP-HPLC)测量或确定rhASB的纯度。这一检测法使用C4色谱柱(Phenomenex Jupiter)作为固定相和水乙腈梯度作为流动相。蛋白样品最初注入水中的色谱柱；在这些条件下，所有蛋白质会与柱结合。随后在柱中注入逐步提高的乙腈浓度。这一乙腈梯度将流动相的疏水性提高到个别蛋白质在流动相内成为可溶的并从柱上洗脱的临界点。这些洗脱时间对于一种混合物的每种蛋白是可以精确重现的。蛋白质通过210纳米处的紫外吸收作为色谱图上的峰进行检测。计算每个峰的面积，样品纯度可以通过色谱图上rhASB峰面积与所有峰的总面积的比率进行计算。RP-HPLC是一种确定rhASB纯度的经证明高分辨率、可重复的方法。
本申请之前的研究表明，通过进行杂质蛋白ELISA确定了ASB纯度。这一使用杂质蛋白ELISA(其细节没有公开)可能使用了针对可能的宿主细胞杂质蛋白混合物的抗体。ELISA应当通过使用用于产生所述抗体的可能杂质蛋白的相同混合物的标准曲线得以进行。待测样品应当对相对于标准混合物的杂质水平进行定量。这些检测法是蛋白纯化中有用的工具，但是出于以下原因，用于确定产物纯度时不如RP-HPLC精确在RP-HPLC检测中，rhASB和杂质的比例都通过相同的测量方法(UV吸收)确定。在ELISA中，杂质浓度通过抗体结合确定，而目标蛋白含量通过另一种检测法(通常是UV吸收或Bradford)确定。“纯度百分比”值应当通过具有相同单位、通过相同方法实验确定的数量的比率进行计算。
为了使ELISA工作良好，由抗体检测的样品应当与标准品具有相同的蛋白组成。这在杂质蛋白ELISA的情形中不太可能实现。此类检测的标准品应当是针对其产生所述抗体的许多独立蛋白的混合物。然而，在纯化的rhASB产物中应当只存在其中一小部分杂质蛋白。因此，所述抗体试剂现在在检测蛋白质的不同混合物，并且相对标准品的反应可能会是完全非线性的。当这样的情况发生时，该检测法对每个样品稀释度产生不同的净值，这样就不知道哪种稀释度(如果存在)给出了正确值。
此外，在如兔等用于产生抗体的动物体内，不是所有可能的杂质蛋白具有免疫原性或相同的免疫原性。而且，通过ELISA确定的杂质水平可能仅反应了存在于纯化的产物中一部分杂质。完全可能在产物中存在一种或多种完全无法检测的主要杂质。相反，由于UV吸收是蛋白质分子的普遍性质，RP-HPLC对所有蛋白质进行检测。
最后，在纯化的药物中存在两类杂质产物不相关杂质(如上所述的宿主细胞蛋白)和产物相关杂质(包括加工形式和聚合物在内的降解产物)。后者不能通过杂质ELISA进行检测，却可以通过RP-HPLC方便地进行检测。
因此，由杂质蛋白ELISA获得的实际数字是存有疑问的，并且RP-HPLC的数字是更为可信的。
此外，SDS-PAGE分析允许对宿主细胞杂质和所需药物蛋白产物的加工或降解的形式进行检测。当与免疫印迹组合使用时，可以将来自宿主细胞污染的产物不相关杂质与产物相关杂质进行区分。最后，由于其能检测不同分子量的杂质(包括该蛋白较低分子量的加工的或降解的形式，以及单体、二聚体和其他多聚体)，SEC-HPLC可以对产物相关的杂质水平进行定量。
表4中描述了这一纯化方法的一种实施方案。
表4纯化方法
表5中展示了由此获得的药物产品的成分。本发明范围内的药物产品组合物的成分展示在表6中。
表5药物产品成分
表6药物产品组合物
已经对本发明进行了描述，提供了以下实施例以通过举例来说明本发明，而不是对本发明的限制。
实施例1对重组人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的临床评价概述重组人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)是针对MPS VI(也称为Maroteaux-Lamy综合征)的治疗的。我们计划了一项rhASB临床发展计划，该计划包括最初的公开标记临床试验，该试验能提供对每周灌注该酶的安全性、药代动力学以及对受试者和明确的临床终点的反应的评估。这一试验应进行至少3个月以收集对5位评估患者充分的安全性信息。在这一时期，如果最初1mg/kg的剂量不能产生过量的尿液粘多糖的合理降低或产生明显的直接临床效果，该剂量应加倍并保持另外3个月以确定安全性并评估进一步的功效。
目标我们的主要目标是证实在最少3个月的时间内对MPS VI患者每周灌注rhASB的安全性。安全性的测量应包括有害情况、免疫反应和过敏反应(针对重组酶的补体激活和抗体形成)、完整的临床化学分析(肾和肝功能)、尿样分析以及分类全血计数(CBC with differential)。
我们的次要目标是通过监测已知受MPS VI影响的几个指标的变化来评估功效。这些指标包括6分钟步行(作为运动耐量的度量)、完整肺功能(PFT)评估、尿液粘多糖和肝肿大水平的降低(作为肾和肝GAG储存的度量)、生长速率、关节运动范围、儿童健康评估问卷(CHAQ)、视敏度、心脏功能、睡眠研究以及两种不同的综合评估一种有研究者进行，一种由患者/护理者进行。第二个次要目标是使用白细胞和口腔组织作为组织来源，确定灌注的药物在循环中的药代动力学参数、大体分布以及细胞内酶的半衰期。基于输递到细胞溶酶体的酶水平，预期这些测量能帮助建立剂量与临床反应的关系。
方法我们将进行单中心、公开标记的研究以证实安全性并评估对MPS VI患者用rhASB治疗的临床指标。患者应允许进行两周的基线评估，这应包括病史和体检、心理测试、耐久性测试(踏车)、一整套常规的临床实验室测试(CBC，Panel 20，CH50，UA)、身体的和磁共振或CT扫描(肝和脾体积测定、骨和骨髓评估以及淋巴结和扁桃体腺大小)、心脏检测(超声波心动图、EKG、CXR)、气管评估(肺功能测试)、睡眠研究以评估睡眠中的干扰事件、关节限制性分析(应测量肘部和指骨间关节处运动范围)、中枢神经系统压力、以及生化检测(两种情况下的口腔N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶活性、两种情况下的白细胞N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶活性、三种情况下的尿液GAG、血清生成抗rhASB抗体的ELISA以及24小时尿液肌酐清除)。除了上述评估以外，对每位患者进行的一些诸如尝试将其手举过头顶和步行的身体运动进行拍照和录影。患者可用抗组胺剂滴定，在灌注酶之前可以有效地用这些物质进行这样的预处理。建议的1mg/kg(50U/kg)的人剂量可以通过4小时静脉灌注每周给药。最初两周患者留院观察，随后在随后的4周留在家里。最后6周的治疗应在患者家附近的机构内进行。3个月时患者应返回医院进行全面评估。如果剂量需要增加到2mg/kg，患者应在最初的12周内遵守上述计划。在任何一种情况下，从开始试验起的6个月也应该进行完整评估。安全性的监测应贯穿于整个试验。只要安全性和功效条件许可，完成试验的患者应继续按照长期方案进行治疗，直到BLA认可。
患者数量和参加率在试验开始时一名患者参加，一个月后另两名患者参加，两周后又有两名患者参加，这样以防止任何与治疗有关的无法预料的并发症。如果任何参加的患者病危，或儿童需要对威胁生命或有害状况进行紧急临床处理，可以允许另外的患者参加。
诊断和包含/排除标准患者可以是男性或女性，年龄在5岁或以上，具有通过可测量的MPS VI临床症状证实的、并且由降低的成纤维细胞或白细胞ASB酶活性水平所支持的MPS VI的书面诊断。具有分娩可能的女性患者必须在每次给药之前具有阴性的怀孕测试结果(尿液β-hCG)并且必须建议在整个研究过程中使用医学上允许的避孕方法。如果患者先前接受过骨髓移植、正在怀孕或在哺乳期、在参加研究之前30日内服用过试验药物、或者具有疾病状态、严重并发症或其他可能显著降低研究顺应性的情况，这样的患者排除在这一研究之外。
剂量、给药途径和规则在本研究的最初3个月，患者应接受剂量为1mg/kg(约50U/kg)的rhASB。在过量的尿液GAG没有得到合理地降低并且没有观察到临床效果的情况下，应对剂量加倍。只有当所有5名患者接受了3个月的治疗以后，可以增加剂量。这一rhASB剂量形式应当在约4小时的时间内每周一次通过静脉内给药并延续至少连续12周。外周静脉导管可以置入头静脉或其他适当的静脉，并且以30cc/小时开始盐溶液灌注。在试验前完成的滴定实验的基础上，可以对患者用1.25mg/kg以内的二苯羟基胺(diphenyhydramine)静脉内给药进行术前用药。rhASB可以稀释到100cc补充了1mg/ml人白蛋白的标准盐溶液中。稀释的酶可以以1mg/kg(约50单位每千克)的剂量在4小时内进行灌注，并用心肺和脉搏血氧计进行监测。对患者可以进行临床监测并对任何对灌注的不良反应进行监测。如果观察到任何不寻常的症状(包括但不限于不适、呼吸短促、血氧不足、高血压、心动过速、恶心反胃、寒战、发热以及腹痛)，应当立即终止灌注。根据临床症状和表征，可以采用另外剂量的苯海拉明、氧气面具、静脉内液体的集合药团或其他诸如类固醇治疗等适当的临床干预手段。如果发生急性反应，应当对血清中补体消耗的评估进行检测。第二个静脉内位置可以用于药代动力学分子所要求的取样。
可评估的患者只要在12周的治疗中没有错过多于两次的非连续的灌注，来自任何患者的数据应认为是可评估的。必须完成最初的、中点的和最后的评价。
安全性如果没有发生不能通过改变该酶的给药速度、或紧急使用抗组胺或类固醇得以防止的显著的急性反应，这样的酶治疗应被确定为安全的。如果在临床检查、临床实验室分析或其他适当的研究中观察到显著的异常，该酶的长期给药应确定为安全的。抗体的存在或补体激活本身不能认为是不安全的，但这样的抗体需要通过ELISA进行监测，并通过临床研究评估可能的免疫复合病。
功效本研究的一个目的是评价关键试验设计可能的终点。作为酶输递和从体内清除粘多糖储存的结果，预计了受试者和临床终点的改进。如果过量尿液粘多糖水平的平均值在3个月内没有降低合理的数量并且在3个月后没有观察到显著的临床效果，应当增加剂量。希望所述改善与在最近完成的MPS I临床试验中观察到的结果具有可比性，并且应包括改善的气管指标或睡眠呼吸暂停的消退、改善的关节运动性和提高的耐久力。
实施例2下面展示了对患MPS VI的猫科动物以及相关药理学和毒物学研究的有用信息的全面回顾酶替代疗法已经成为针对诸如Gaucher病、Fabry病和I型粘多糖贮存症等多种遗传的代谢紊乱的有前途的治疗方法。在有些所述的功能紊乱中，天然动物模型提供了临床前试验中预测人类治疗的临床功效的能力。这在MPS I(犬类模型)中是正确的。带着这样的想法，在开始这一疾病的人体研究之前对患MPS VI的猫科动物进行了研究。存在的充分的安全性和功效数据支持在人类MPS VI患者中继续进行临床试验。
对患MPS VI的猫的rhASB研究指出，没有猫因为给药而死亡。正如所预测的，对患MPS VI的猫的研究说明，rhASB摄取取决于甘露糖-6-磷酸修饰的糖类侧链的存在。也已经表明，患MPS VI的猫中的rhASB能从多种主要器官中清除存储物并适度地改变骨密度。长期的剂量范围的功效研究说明，每周1mg/kg的剂量是能观察到显著的临床功效的最低浓度。也进行了集合药团和缓慢灌注(2小时)后酶分布比较、组织粘多糖储存的清除、以及尿粘多糖水平降低的研究。进展中的研究继续评价在患MPS VI的猫中1mg/kg的rhASB的计划临床剂量每周灌注的安全性。20世纪70年代对暹罗猫的多个家族中自然产生的MPS VI进行了鉴定(Jezyk，Science 198834-36(1977))，并且公开了这些动物中病理学改变的详细报告(Haskins等，Am.J.Pathol.101657-674(1980)；Haskins等.J.Am.Vet.Med.Assoc.182983-985(1983)；Konde等，Vet.Radiol.28223-228(1987))。虽然这些猫的临床表现有所不同，它们都具有文献中已有报道的常规变化(Jezyk等，Science 198834-36(1977)；Konde等，Vet.Radiol.28223-228(1987)；Crawley的《VI型粘多糖贮积症的猫科动物模型中的酶替代治疗》，澳大利亚阿德莱德大学博士论文，1998)。从这些来源构建的表7提供了人们可能在未治疗的患MPS VI的猫中预期观察到的“平均”改变。
表7患MPS VI的猫的模型
其他的生化/形态学确定说明，在35天内未治疗的猫的器官具有组织中最高的粘多糖储备(Crawley等，J.Clin.Invest.99651-662(1997))。正常的和患MPS VI猫的尿粘多糖水平在出生时均有提高，但是约40天后，正常的猫具有降低的水平。患MPS VI猫的尿粘多糖保持高水平或继续提高直到在约5个月后达到稳定状态。
临床表现的可变性可以在受疾病侵袭的一胎出生的小猫中发现。除了具体异常的发作时间的一些可变性，一些临床和病理学改变的发展的时间过程也是可变的。一般而言，骨损害通常是逐步发展的(Konde等，Vet.Radiol.28223-228(1987))，而角膜混浊则不是。此外，有些瘫痪的猫被注意到症状随时间改善为严重的局部瘫痪。个别猫中的疾病发展的详细研究局限于临床(或X光片)观察。其中有些具有明显不同的病理学相关性，诸如相对于胸腰部骨组织增殖来说是次要的神经系统缺陷和脊髓压缩(Haskins等，J.Am.Vet.Med.Assoc.182983-985(1983))。
在新生患MPS VI猫中进行了使用重组猫ASB的酶替代疗法的为期6个月的功效研究。这是由于观察到几只经治疗的MPS VI猫发展了针对人类的酶的抗体(参见6.5部分)。这些抗体可能改变酶的摄取和稳定性(Brooks等，Biochim.Biophys.Acta 1361203-216(1997))。猫的酶每周1mg/kg进行灌注。这一研究的主要结论是相对于在先前研究中使用的相同剂量的人的重组酶，改善了尿GAG、体重/生长状况、骨形态测量以及从多个组织清除储备的材料；在正常猫中观察到的范围之外没有检测到抗体；以及在面对面的比较中，剂量为1mg/kg的猫的酶在逆转疾病方面与剂量为5mg/kg的人的酶具有可比性(Bielicki等，J.Biol.Chem.，27436335-43(1999))。这些研究表明，当对猫给予猫源酶的情况下，终点和免疫原性的递增改善是可能的。这为用每周1mg/kg的人的酶对患者给药提供了另外的支持。表8中展示了这一研究的结果。
表8在新生患MPS VI的猫中每周CHO来源重组的猫的ASB的集合药团注射的功效
表9提供了在MPS VI猫模型中使用重组的人ASB所进行的所有研究的汇总。
表9rhASB研究结果
实施例3分布和可行性进行了最初的研究以说明酶的摄取和分布，并作为对进一步功效研究可能的终点的引导研究(Crawley等，J.Clin.In.vest.91，864-1873(1996))。重组的人ASB每周一次或每两周一次以0.5-1.5mg/kg的剂量通过集合药团注射对受疾病侵袭的猫进行给药。对一只未经治疗的MPS VI猫(Cat D)以及一只提供了与之进行比较的数值的正常的猫进行了评价。来自未经治疗的猫的数据进一步得到了另外38只未经治疗的猫的历史评估数据的支持。使用允许在存在正常猫的酶的条件下检测人的ASB的免疫测定法对正常的猫进行了灵敏的酶摄取和分布研究。
这些研究的主要结论说明了该酶的广泛摄取，其中如在MPS动物模型的其他酶替代研究中所观察到的肝脏和脾脏在摄取方面具有预期的显著优势。摄取效率取决于该酶的甘露糖-6-磷酸修饰的糖类侧链的存在。该酶的半衰期确定为2-4天。在治疗上，该酶的确从多种组织中清除了溶酶体储存物并且的确适度地改变了骨密度。在年老的MPS VI猫中，角膜、骨形态以及软骨缺陷没有得到有效治疗。研究结果汇总在表10中。
表10MPS VI猫中酶分布/可行性研究
实施例4在从出生开始进行治疗的MPS VI猫中的功效在从出生开始进行长时期剂量范围治疗的MPS VI猫进行了功效研究(Crawley等，J.Clin.Invest.99651-662(1997))，并将结果汇总在表11中。从出生开始每周用0.2、1和5毫克/千克rhASB通过集合药团静脉内注射对MPS VI猫进行了治疗。共对9只猫进行了5、6或11个月的治疗。此外，12只MPS VI和9只正常的猫作为未经治疗的对照。主要的结论是，0.2mg/kg的剂量在一只研究的猫中没有改变疾病进程，并且唯一证明的临床功效是肝脏枯否细胞中储存物的降低。在较高剂量组中，在试验过程中尿GAG水平减少到接近正常。除了主要器官中的改善以外，从出生开始的较高治疗剂量能够防止或改善脊椎的骨畸形和许多骨骼的异常形态。在1和5毫克/千克组之间存在着L-5脊椎骨钙化体积、骨小梁厚度以及骨表面密度改善上的剂量依赖效果，虽然两者在ERT5到6个月时改善骨形成上是等价的(Byers等，Bone 21425-431(1997))。二尖瓣和主动脉是剂量依赖的，并且在1mg/kg剂量时降低并不完全但在5mg/kg剂量时基本完全降低。每任何剂量下没有观察到软骨和角膜中储存物的改善。这一研究表明，每周1mg/kg的剂量是观察到明显临床效果的最低浓度。研究结果汇总在表11中。
表11新生MPS VI猫中CHO来源的重组人ASB每周集合药团注射的功效(PC-BM102-002研究)
实施例5新出生的MPS VI猫中每周两次重组人ASB灌注的功效在新生猫中进行了为期6个月的研究以评估每周两次0.5mg/kg灌注的功效。此外，这一研究中使用的酶专门来自CSL-4S-342细胞系。这一研究的主要结论包括，与先前所报道的每周一次1mg/kg的剂量相比，本项研究在身体、生化、神经和放射学指标中产生了类似的改善。最显著的差异是稍差的颈椎屈伸性以及在如心脏瓣膜和大动脉等致密结缔组织中溶酶体储存物的较少清除。结果汇总在表12中。
表12新生MPS VI猫中每周两次CHO来源的重组人ASB的集合药团注射的功效
实施例6MPS VI猫中作为酶灌注速度的函数的酶摄取和分布的评估本研究的主要目标是在相同的1mg/kg剂量的集合药团灌注或缓慢灌注(2小时)后比较酶分布、组织GAG储存的清除以及尿GAG水平的降低。缓慢给药计划是建立在α-L-艾杜糖醛酸苷酶治疗MPS I的临床前和临床研究经验的基础上的。此外，本研究提供了在BioMarin从CSL-4S-342细胞系生产的酶具有生物学活性并是安全的的最初数据。本研究的主要结论包括，本发明中处理的全部4只猫(每组两只)对缓慢或快速灌注没有表现出急性不良反应和酶重复灌注的有害结果。然而，集合药团灌注导致了非优选的高度肝脏摄取。缓慢灌注提供了更好的组织分布因而是临床试验的优选方法。
本发明获得的rhASB组织分布说明，2小时灌注可以提高除肝脏以外其他器官中的酶水平，这包括大脑中酶活性的提高。紧接着第一次获第二次灌注之后，观察到了尿GAG水平降至未治疗MPS VI猫中所观察到的范围以下的水平。5次灌注之后，在网状内皮组织细胞中观察到了、在一些成纤维细胞中(心脏瓣膜)和平滑肌细胞(大动脉)中观察到了非常温和的溶酶体储存物的改善。每组中都没有观察到其他对灌注的显著的临床反应，然而由于本研究较短的持续时间以及由于治疗开始于已经发生了明显的疾病改变之后，这样的结果并不令人意外。相对于先前研究中所使用的短时间方案，延长的2小时灌注是安全的并具有良好耐受性。基于可用于评价的猫的酶组织分布数据，所述2小时灌注可以提供酶分布上的改进。
实施例7MPS VI猫中为期6个月的重组人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的安全性评价使用按照本发明的制造过程生产的酶在MPS VI猫中启动了两个为期6个月的研究。这些研究的目的是评价在患MPS VI的猫中设计的人的临床剂量rhASB每周灌注的安全性和功效。研究6包括最初在3-5月大小时开始给药的小猫。研究7包括从出生开始用每周灌注设计的人的临床剂量rhASB治疗的小猫。这些研究是为了获取潜在的毒理学指标。对重组酶灌注过程中猫的行为的变化进行观察以评估可能的免疫反应。监测血清中的补体消耗以及重组酶抗体的形成。通过全面临床化学检测(肾和肝功能)、尿分析以及分类全血计数监测全面的器官功能。尿粘多糖水平在与酶灌注有关的每周指定时间进行监测。应记录疾病临床改善的证据。这些数据能提供治疗潜在功效的额外评估并能证实该酶的体内活性和摄取。这些研究已经并应当以尽可能与GLP法规的原则和实践相一致的方式进行。
第一个研究的初步结果表明，rhASB的给药没有对任何一只实验动物造成任何有害的影响，体重和临床化学通常保持在参照范围以内。然而，具有显著提高的抗体滴度的两种猫在灌注过程中均发展出了异常的临床症状，虽然一旦酶灌注结束两只动物行为正常并似乎没有遭受长时期的疾病影响。延长的灌注时间(4小时)和提高的抗组胺剂术前用药使得在猫身上进行持续治疗而没有任何异常症状成为可能。尿GAG水平的温和降低说明，治疗在降低组织或循环中储存的粘多糖方面的一些功效，虽然随时间不同而观察到的这些水平的波动使得难以解释这些结果。没有一只猫表现出对于ERT反应的明显的临床改善，但这会要求基于以前研究基础上的至少6个月的治疗。5只猫中的4只中发展出了抗体滴度，ERT 2个月以后观察到滴度的明显提高。这些猫中的两只在2或3个月后发展出显著提高的滴度。
实施例8用rhASB治疗的MPS VI猫的安全性特征进行了由出生24小时以内进行治疗的患病的猫参加的研究。使用rhASB对41只MPS VI猫进行了治疗。在对贵重的患病的猫进行治疗之前，用酶对1到2只正常的猫给药以验证新的批次的急性安全性。总地来说，没有猫由于给药而死亡，虽然4只猫死于病毒感染牛或潜在的先天异常。研究中的酶按照本发明的生产方法进行生产。初步数据显示在表13中。
表13从Hopwood实验室的MPS VI猫的功效研究汇总
实施例8A缓慢灌注的组织分布使用长时间(2小时)或短时间(10到15分钟)灌注方案(ASB-PC-004)为比较在年轻MPS VI猫(开始时小于10周)中rhASB的摄取速度和组织分布进行了单独研究。给7只正常的猫(12-24月大)服用镇定剂并植入股动脉套管以允许血液取样。1.0mg/kg或7.3mg/kg剂量的rhASB以40毫升体积40秒内注入头静脉。给药后约2、4、6、8、10、20、30、40、60和120分钟后获得连续的肝素化动脉血样品。
通过离心收集血浆冻存直到用于分析。4小时后，对动物实行安乐死并收集组织，称重并冻存直到用于分析。
在单独的研究中，3只正常的猫(8-66个月大)接受7毫升剂量体积的1.0mg/kgIV集合药团剂量的rhASB。给药后2、4、7天在每个时间点对一只猫实施安乐死。收集、称重并冻存选择的组织直到用于分析。对另外一只正常的没有接触rhASB的猫实施安乐死以提供用于分析对比的组织中猫的ASB的水平。使用ELISA测定技术对血浆和组织中的rhASB或猫的ASB进行定量。样品中的rhASB吸附于固定的抗rhASB单克隆抗体上，猫的rhASB吸附于与猫的ASB交叉反应的多克隆抗rhASB抗体上。随后使用荧光底物对吸附的ASB进行定量。
血浆浓度分析表明，1.0mg/kg剂量的rhASB的t1/2是13.7±3.2分钟，并且7.3mg/kg剂量的约为45分钟。在肝脏、脾脏、肺部、肾脏和心脏中1.0mg/kg剂量给药后的组织t1/2介于2.4-4.2天。给药后7天内在这些组织中(除了心脏)能观察到很低但仍可检测的水平。1.0mg/kg ASB给药4小时后，主要剂量运送至肝脏，能在除软骨和角膜的所有其他组织中测量到药物水平，而大部分位于肝脏中。除了大脑和小脑以外，药物水平比未治疗的对照猫中猫的ASB的水平高4(动脉)到495(肝脏)倍。本研究中确定的组织半衰期(1.0mg/kg剂量时2.4-4.2天)支持每周临床给药的频率。
本研究的主要目的是评价灌注速度对酶分布、组织GAG储存的清除以及尿GAG水平降低的影响。10周龄的MPS VI猫的实验组(n＝2/组)按每周1.0mg/kg的剂量短时间(10-15分钟)或长时间(2小时)灌注rhASB 5周。最后一次灌注2天后对动物实施安乐死并收集挑选的组织(肝脏、脾脏、心脏、肺、肾、皮肤、动脉、大脑、小脑、软骨、角膜和淋巴结)以确定ASB浓度并进行组织病理学评价。分析之前冻存组织。本研究使用如上所述(ASB-PC-001)相同的免疫测定法来确定组织ASB水平。2小时灌注组中的一只猫与其他经处理的猫相比具有降低的组织酶水平。最后一次灌注后在导管插入位置附近检测到高的酶水平，而在对侧肢体中发现低的酶水平。这些结果表示，导管过早地从这只动物移走并导致了在组织中发现的ASB的低组织水平。其余3只猫中酶活性的比较表明2小时灌注的猫相对于10分钟灌注的实验动物，在肝脏、肺、肾脏、大脑和小脑中酶活力提高以及在肠膜淋巴结中酶活力的降低。在皮肤、软骨和角膜中没有发现该酶。虽然来自本研究的数据有局限性，本研究的发现表明，相对于10分钟灌注，2小时灌注可以导致组织中(除肝脏以外)酶的水平的提高，这表示延长灌注时间提供了更好的组织分布。
实施例9生产和纯化方法(灌流过程)表14中提供了比较分批补料和灌流细胞培养纯化过程的过程流程图。表15中汇总了与分批补料纯化过程的比较以及对灌流过程材料进行纯化所实行的具体变化的详细描述。表16描述了用于灌流细胞培养的纯化方法。
表14分批和灌流过程之间纯化过程的比较
表15纯化步骤改变的汇总描述
表16rhASB纯化方法(灌流过程)
如表15和16中所示，所有纯化层析柱在使用前进行再生，使用后进行清洁并保存在适当的缓冲液中。
纯化原材料所有材料均由合格的供应商提供。
表17用于纯化的原材料
所采用的甘油由合成工艺获得。所有使用的原材料符合名为《经人的和兽医医学产品传播动物海绵状脑病物质风险最小化》(Minimising the Risk ofTransmitting Animal Spongiform Encephalopathy Agents Via Human andVeterinary Medicinal Products)的最新版CPMP/CVMP指导注意事项，其中通过包括高温和高压条件或已知最终消灭疯牛病(BSE)物质的化学反应生产的如甘油和脂肪酸等动物脂衍生物认为不太可能具有传染性。因此，认为由甘油传播BSE的风险是低的。
rhASB的病毒安全性通过组合运用供应商选择和资格认定、原材料检测、细胞库性质研究、病毒清除研究以及rhASB纯化过程的灭活能力、以及日常批次放行检测进行证实。参考了相关的美国、欧盟以及ICH法规和指导方针以保证rhASB的病毒安全性。
柱层析、DNA清除以及病毒过滤现在使用一系列层析和过滤步骤纯化rhASB。发酵液通过超滤浓缩20倍、调节pH、过滤并上样于Blue Sepharose Fast Flow层析柱(45cm×16cm)。BlueSepharose Fast Flow洗脱液过滤后上样于Copper Chelating Sepharose层析柱。铜螯合柱洗脱液经过滤后上样于Phenyl Sepharose Fast Flow High Sub层析柱。所有3个柱层析步骤以结合/洗脱方式进行。Phenyl Sepharose柱洗脱液经阴离子交换过滤和病毒清除过滤后通过超滤进行浓缩和缓冲液交换。
病毒清除/灭活研究为评估改进的rhASB纯化过程的病毒清除能力进行了两个研究。使用两种模式病毒系统(异嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)和小鼠微体病毒(MMV))在BioReliance(Rockville，MD)进行了研究。XMuLV是一种对物理化学灭活具有低抗性的具有包膜的单链RNA逆转录病毒。MMV是一种微小的、没有包膜的对物理化学试剂具有高抗性的单链DNA病毒。
这些研究评价了rhASB纯化过程中使用的两个层析步骤(Copper ChelatingSepharose FF以及Phenyl Sepharose FF High Sub)以及病毒过滤(0.02微米)。使用这些工艺步骤的小规模形式进行了掺入和回收研究。所保持的重要参数是保留时间和基质-溶液相互作用。这通过复制缓冲液、线性流速和柱高度但调节柱直径实现。研究中使用的材料(产物和缓冲液)从实际的全规模生产中收集。
装好层析柱(Copper Chelating Sepharose以及Phenyl Sepharose)并用典型的rhASB样品(空白)或掺入病毒的缓冲液样品预先运行然后运至BioReliance。将存在病毒缓冲液条件下的色谱图和产物得率与空白对照相比较。相同的柱载样量掺入XMuLV或MMV随即进行层析。每个评价步骤的病毒下降量通过比较上样量和洗脱液中的病毒载量进行测定。本研究的结果汇总在表18中表示。
表18XMuLV和MMV下降倍数
过程检测贯穿整个过程进行过程检测并在图3中进行了说明。表19和20中描述了发酵液和纯化中间体的过程检测。
表19发酵液的过程检测
1在生产过程细胞培养物收集阶段的多个时间点进行取样。检测了细胞培养过程结束前取得的最后一个样品并且阴性结果对于批次放行是必需的。
表20纯化中间体的过程检测
1按照标准的操作程序对超过行动水平的结果进行研究。
2如果结果超过行动水平，FBDS应经0.2微米滤器滤至合适的无菌存储容器，并随后进行检疫以等待允许运送至填充点。
灌流方法纯化前体rhASB的结果表21提供了使用表15和16中所述方法获得的rhASB的纯度数据。“RP-HPLC纯度”栏表示针对前体和成熟形式rhASB组合量所获得的纯度。
表21rhASB批次放行结果
*“+”表示在调配的原料药物质中存在加工的形式(估计1-15％)；“-”表示没有加工过的形式存在。
图4A-4C提供了灌流纯化方法(表16)的3个层析步骤的代表性的层析图。表22提供了这3个层析步骤中每一个的前体rhASB平均回收率。图5提供了每个层析步骤过程中的样品和纯化的最终产品(前体rhASB)的纯度分析数据。
表22纯化回收率汇总
当对使用批处理和灌流处理所获得的纯化产物进行比较时，灌流处理明显产生了更纯的前体rhASB。即便是通过选择不同的洗涤组分或改变条件对批处理进行进一步优化不能导致可由灌流处理获得的始终纯的产品。灌流处理能够产生稳定的纯度99％或更高的前体rhASB，而批处理则不能(表21)。图6提供了使用其中细胞培养物用补充了G418并且没有补充叶酸、丝氨酸和天冬酰胺酸的培养基培养的传统批处理方法所获得的产物(泳道2)与使用灌流处理纯化的纯化产物(泳道3-9)之间的比较。rhASB样品在含还原剂的SDS中变性并经4-20％PAGE在SDS运行缓冲液中进行电泳。批处理纯化的产物比灌流处理纯化的产物明显包含多得多的杂质(特别是在48kDa附近)。批处理rhASB看来含可检测量的酶加工过的形式(估计1-15％)(泳道2)。灌流处理纯化的批次相互之间具有高可比性并比批处理纯化的rhASB标准品成分明显更简单，这表示灌流处理的材料具有更高的纯度。
表23提供了使用灌流处理纯化方法纯化的前体rhASB的纯度百分比。
表23最终产物的纯度
ND＝未确定表24提供了使用灌流处理纯化方法纯化的前体rhASB批次的纯度百分比，其中纯度通过RP-HPLC和SEC-HPLC(允许对诸如经加工的形式或多聚体等不同分子量的杂质进行定量)进行了评价。
表24经RP-HPLC和SEC-HPLC测定的纯度
*未确定灌流处理中蛋白酶的去除在180升每个批次的规模下，每个批次需要进行两个相对巨大的24L DEAESepharose层析。灌流处理产生10倍更大的发酵液体积，这对于实际的大规模纯化需要利用严重不切实际的DEAE Sepharose层析柱尺寸和缓冲液体积。因此，对尤其难以使用的DEAE Sepharose步骤的取消进行了评价以简化新的灌流纯化顺序。其结果是，3个层析柱的顺序(如表16中所述)克服了这一大规模生产的障碍。
批处理(表15中所述)中的DEAE Sepharose层析步骤主要用于去除总蛋白(包括蛋白酶)和pH指示剂染料苯酚红。后一个问题在新的工艺中通过从302培养基配方中去除苯酚红得以解决。通过DEAE sepharose步骤去除总蛋白导致了pH5.5时Blue sepharose更高的容量。在新的工艺中，需要确定Blue Sepharose的条件以平衡高rhASB容量同时限制蛋白酶活性。低pH值下，容量和蛋白水解均得以增强。此外，蛋白酶的清除应明显提高随后的铜螯合层析步骤的效率，其中蛋白酶(组织蛋白酶)的清除在批处理中已发现是有问题的。通过在低pH下进行加样、而洗涤和洗脱条件在更高的pH值下进行，发现了产生需要结果的条件，有效去除蛋白酶(组织蛋白酶)的条件具有可接受的0.8mg rhASB/ml树脂的载量。图8的色谱图中证明了蛋白酶活性(例如组织蛋白酶)的去除。
使用新的工艺(没有DEAE FT层析)或传统批处理纯化工艺(PS洗脱液(OP))由灌流操作纯化的rhASB(102PD0055)的比较表明，正如通过银染凝胶上额外的条带所说明的并由抗ASB抗体所检测到的(见图9)，相同的反应器运行中传统工艺纯化的材料(使用批处理方法)(泳道PS Eluate(OP))具有明显更高的蛋白水解水平。与传统批处理相比，新工艺的产物纯度更高。组织蛋白酶通过Blue层析得以去除。使用新工艺，在蓝染料层析的洗离组分中发现了抗组织蛋白酶交叉反应的物质。
在以下实施例11中所描述的药代动力学结果表示，更纯的rhASB制剂导致比先前的常规批处理产物更长的半衰期。
实施例10表面活性剂对颗粒形成的影响实行实验方案以确定聚山梨醇酯80对使用新的灌流细胞培养工艺制备的rhASB在小瓶中颗粒形成的影响。使用了视觉观察和颗粒计数方法以确定颗粒生成的程度。此外，进行了活性检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫印迹以及分子排阻层析(SEC)以证实在存在聚山梨醇酯80和/或晃动条件下相对于未经处理的对照品的产品质量。用于批处理rhASB的小瓶和瓶塞(Old，Wheaton 5ml，2905-B24B/WestS-127(4401/45))也与建议用于源于灌流材料的小瓶和瓶塞(New，Wheaton 5ml，2905-B8BA/West S-127(4432/50))进行了比较。
rhASB经0.2微米滤器过滤后使用10毫升一次性移液管填充小瓶。每种含rhASB的待测样品填充两个小瓶。两者都用于视觉测定，其中一个用于颗粒计数，另一个用于其余的测定法。只填充了一个缓冲液对照小瓶/待测样品。由于装配、样品操作、过滤或填充几乎没有引起颗粒形成。视觉观察和颗粒计数分析表明(结果展示在下面的表25A-C和26A-C中)，相对于仅含缓冲液的对照品，在含配制药物的未晃动小瓶中，第0、1和14天没有检测到明显的微粒形成。4℃晃动18小时后，在两个仅含配制缓冲液(10mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH5.8)不含聚山梨醇酯的rhASB小瓶中观察到了明显的颗粒增加。可以清楚地看到细屑。使用HIAC/ROYCOModel 9703颗粒计数器进行了颗粒计数。该液体颗粒计数器可以对介于2微米到150微米的颗粒进行大小排列并计数。每个不少于5毫升的3个试样量放入不透光度感应器。2到3次运行的平均颗粒计数以每毫升颗粒数的形式进行报告。基于大小10微米颗粒的HIAC-Royko定量，传统和新的小瓶设置中的计数分别是每毫升2069和1190个颗粒。在存在0.001％聚山梨醇酯80的条件下，观察到了明显更低的计数值，分别是每毫升21和49个颗粒。在0.005％聚山梨醇酯80浓度下，晃动和未晃动的小瓶之间基本上检测不到差异。
在不含聚山梨醇酯80的传统的小瓶/密封剂中，振动以后的的1到14天每毫升颗粒计数意外地从2069降到268。视觉观察测定表明，其中发现了更低计数的相同的14天的小瓶中存在更大的碎屑；可能是这些更大的碎屑干扰了HIAC-Royko测定法，或传统的小瓶设置通过最终的联合和聚合成体积更大的、虽然数量更少的颗粒引起颗粒形成的提高。
进行了另外的测试以证实振动之后蛋白质的完整性。特异活性没有发生改变。尺寸排阻色谱(能够检测可能受到机械振荡影响的蛋白质聚合的变化的方法)显示，没有更大分子量类型的增加。为了检测分解的产物，rhASB的SDS-PAGE凝胶用银染或转至硝酸纤维素并用抗rhASB抗体进行免疫印迹。任何一个样品中没有检测到额外的条带。
表25A视觉测定。第0天
表25B视觉测定。第1天
表25C视觉测定。第14天
视觉测定未见沉淀 -介于两者之间，观察结果不确定 +/-少量细小沉淀 +明显沉淀，混浊 ++非常混浊，大碎屑沉淀 +++表26A微粒分析，HIAC-Royko(颗粒/毫升)。第0天
表26B微粒分析，HIAC-Royko(颗粒/毫升)。第1天
实施例26C微粒分析，HIAC-Royko(颗粒/毫升)。第14天
结果表明，无论剂型如何，手工填充过程几乎不产生颗粒。以180rpm持续剧烈振荡后，在含未与聚山梨醇酯80配制的rhASB的小瓶中颗粒明显可见。
聚山梨醇酯80的存在对于抑制机械晃动引起的颗粒形成具有很好的效果。这一保护作用是引人注目的，0.001％和0.005％的聚山梨醇酯80能将摇瓶中颗粒计数降至接近于本底水平。0.005％的聚山梨醇酯80的浓度在降低颗粒计数方面表现出略好于0.001％聚山梨醇酯80浓度的改善。
正如通过活性、蛋白浓度、纯度或聚合百分比所评价的，没有观察到振荡或剂型会引起任何产物的不稳定性。
实施例11人体临床研究使用按照这里所述的批处理所生产的药物在患有VI型粘多糖贮积症(MPS VI)或Maroteaux-Lamy综合征的患者中进行了重组人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)的1/2期、随机双盲临床试验。浓度1mg/ml的rhASB的剂型是pH5.8，9mM单价碱磷酸钠·1H2O1mM二价碱磷酸钠·7H2O，150mM氯化钠。对患者给药时，rhASB通过在静脉袋中用标准盐溶液室温下稀释到适当量的药物溶液进行制备。所有患者在灌注前用抗组胺剂进行术前用药以降低灌注相关反应的可能性。
本研究的目标是对作为酶替代疗法的rhASB的两个剂量在MPS VI患者中的安全性、有效性和药代动力学情况进行评价。患者以双盲方式随机分成两个剂量组(0.2和1.0mg/ml)。药物通过4小时VI灌注每周给药一次。安全性指标包括生化全套、尿样分析、分类全血计数以及AE跟踪。对所有患者进行了免疫反应和灌注相关反应、补体激活和抗体形成的评估。有效性参数包括了运动忍耐力/耐受性(6分钟步行检测)、呼吸容量(肺功能检测)、关节运动范围(JROM)、功能状态(儿童健康评估问卷[CHAQ])、尿GAG水平以及肝肿大的变化、视敏度、心脏功能以及睡眠呼吸暂停。
在灌注过程的第1、2、12、24周进行药代动力学评价并随后在灌注过程中及以后定期测量抗原(酶)水平。药代动力学评价也在本研究的公开标记延伸期的第83、84和96周进行，此时患者从84周开始转而服用与0.005％聚山梨醇酯80配制的新的灌流工艺纯化的rhASB。共有7名患者参加临床试验，并包括了与病情快速发展及适度发展相一致的特征范围内的患者。一名患者在第3周出于个人原因退出试验并进行了替代。对于其他6名患者在完成24周的治疗以后进行了粗略的临时分析。来自第24周临时分析的数据说明，rhASB具有良好的耐受性，并且1.0mg/kg的剂量看来产生了更好的临床效果并且其安全性特征与0.2mg/kg剂量的安全性具有可比性。
低剂量组的患者以1.0mg/kg的剂量水平继续治疗。两名患者在48周以后的期间(59和69周)开始较高剂量水平的治疗。通过96周治疗的患者接受了计划的rhASB灌注的大部分。在整个试验期间没有患者错过两次以上灌注。治疗最初24周、随后48周过程中进行的安全性评估显示，用0.2或1.0mg/kg剂量rhASB每周治疗具有良好的耐受性并且这两个剂量组之间没有明显的差异。较长时期1.0mg/kg每周的治疗(经96周)也是良好耐受的。
抗rhASB抗体形成和补体水平进行药物研究的所有6名患者在30周发展出了针对rhASB的抗体。6名患者中的4名的抗体水平保持相对较低并在60周从峰值下降。发展出比其余4名患者更高抗体水平的两名患者中，一名患者的抗体水平在24周从峰值下降，另一名患者的水平在60周从峰值水平快速下降。在96周治疗过程中，没有观察到CH50、C3或C4补体水平的稳定变化。几名患者具有CH50水平的断续降低；然而，没有注意到补体消耗的证据或这些低水平和灌注相关症状之间的关联。图10显示了96周治疗过程中的抗体水平。
尿液粘多糖尿液GAG水平是MPS患者中溶酶体储存物水平的生化标记。在24周左右，高剂量组中尿液GAG平均下降70％相对于低剂量组中的55％。类似地，MPS VI主要储存产物DS的百分比分别下降44％和18％。作为对治疗的周数函数的GAG的尿液排出物中的变化的时间过程显示了高剂量组中6周左右的总体尿液GAG更显著的降低。这些数据证明，较高的剂量在尿液GAG和DS中产生了更大的改变。对于两个剂量组中留在本研究中的患者而言，在96周中尿液GAG持续降低。图11显示了96周中总尿液GAG水平的降低，图12显示了96周时的水平与相应年龄正常水平的比较。需要注意，0.2mg/kg剂量组中留在本研究中的的两名患者(患者41和45)，其剂量分别在69和59周转为1.0mg/kg。在96周时，这两名患者GAG筛查降低85％和63％。这与整个96周1.0mg/kg治疗的患者中所观察到的降低相似。患者42、43和44分别经筛查降低64％、77％和86％。在两个剂量组中，具有较高基线GAG水平的患者比GAG水平更接近正常范围(小于正常值上限的5倍，即平均值加2SD)的患者具有更高的下降百分比。
耐久性6分钟步行检测作为耐久性的主要临床指标。接受1.0mg/kg研究药物的开始时不能步行超过100米的两名随机患者(#43和#44)在24周左右在步行距离方面有了巨大进步。除了发展出C1-C2脊髓压迫的#44以外，所有患者在48周和96周左右表现出行走距离的改善。图13显示了治疗96周的6分钟步行检测结果。
有效性的其他指标在96周研究药物治疗过程中观察到了多种其他有效性参数的适度改善。在第24周，肩运动范围，尤其是关节弯曲，在6名研究患者中的5名中得到了改善。4名患者中的3名(#41、43和45)在96周的评估中持续表现出肩弯曲的改善。在96周时，在4名患者中的3名中也观察到了呼吸功能、用力肺活量(FVC)和1秒钟用力吐气量(FEV1)等指标的轻度改善。6名参加的患者中的4人测量的视敏度，其中3人提高了1条或更多谱线，虽然1名患者在此期间更改了其处方镜片。通过CT扫描测量的肝肿大，虽然不是该疾病的显著特征，也发生了适度降低，尤其在那些开始时具有较大肝脏的患者。
在其余有效性参数中几乎没有观察到改变，这些参数包括经ECG检测的心脏功能、抓力和握力、CHAQ问卷、身高和体重、骨骼矿物质密度以及睡眠研究。贯穿96周治疗期没有观察到任何这些参数的明显退化。
药代动力学在双盲研究的1、2、12和24周以及公开标记延伸研究的83、84和96周进行了药代动力学评价。从84周开始，患者开始接受通过实施例9中所述的灌流工艺制造的rhASB。
在灌注过程的0，15，30，60，90和180分钟，灌注结束时的240分钟，以及灌注后5，10，15，30，45，60，90，120和240分钟，收集血样。使用非房室方法计算rhASB的药代动力学参数。无限延伸的血浆浓度-时间曲线下的面积和第一时间使用线性梯形方法进行计算直到具有定量的合格界限之上浓度的最后时间点。
对于每周0.2mg/kg给药的患者，从第1周到24周的AUC0-t平均值是相对稳定的(第1周10,009±5,107，第2周11,232±3,914，第12周13,812±9,230，以及第24周13,812±9,230)。对于每周1.0mg/kg给药的患者，AUC平均值是第1周94,476±13,785，第2周180,909±46,377，第12周157,890±45,386以及第24周251,907±201,747。对于这一每周1.0mg/kg组，AUC0-t和AUC∞值的提高以及大的标准偏差是由于该组中一名患者的AUC比其他两名患者高约2倍。
每周0.2和1.0mg/kg组群之间AUC0-t平均值的比较显示了超出剂量提高5倍以上的提高，这表示在这一剂量范围内rhASB药代动力学不是线性的。
下面的表27中展示了83、84和96周的药代动力学参数。
表27
除了作为中位数的Tmax以外，公布了算术平均数和标准偏差。如果n＜3公布了20名单独患者的值。
83周的参数与从第2周到24周获得的数据具有可比性(除了一名具有高AUC的患者)，这说明在约18个月内每周接触后rhASB药代动力学的一致性。从83周到84周，AUC平均值提高约25％，同时总体的体内清除下降约25％。从83到84周，半衰期从约8.5分钟]提高到17-19分钟。96周的参数与84周所获得的数据具有可比性。虽然这一药代动力学数据来自少量患者并存在单独值的实质重叠，这些结果表明从实施例9中所述的改进工艺获得的高纯度rhASB制剂比最初的rhASB制剂具有更长的半衰期。
实施例12人体中进一步的临床研究使用按照实施例9中所述的新的灌流工艺生产的药物在患有VI型粘多糖贮积症(MPS VI)或Maroteaux-Lamy病的患者中进行了重组人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)的2期公开标记临床试验。浓度1mg/ml的rhASB的剂型是pH5.8，9mM单价碱磷酸钠·1H2O，1mM二价碱磷酸钠·7H2O，150mM氯化钠，0.005％聚山梨醇酯80。
研究的目标是对每周IV灌注1.0mg/kg rhASB的安全性、有效性和药代动力学进行评价。本研究的包含标准进行了修改以包括相对统一的具有削弱的耐久性的患者组。患者在开始时需要能步行至少1米但在12分钟步行检测的前6分钟行走不多于250米。其他的包含和排除标准与1/2期研究中所采用的相似，其中患者需要至少5岁大并具有书面证明的生化或遗传诊断。除了步行检测以外，本研究包括了多个在MPS患者中先前没有研究的终点。
安全性指标包括了临床实验室评价、尿样分析、分类全血计数、ECG和AE跟踪。对所有患者进行灌注相关反应以及补体消耗和抗体形成的评估。有效性参数包括了耐久性和运动性测量，这包括12分钟步行检测、延时起立行走检测、3分钟爬楼梯检测和身体活力。主观效果，如关节痛和关节僵直，用问卷进行评估，并且也评估了其他丹佛发育衡量指标，如系鞋带的时间、摸头顶、翻转毛线衫、以及拣起硬币并将其放入杯子里。其他的有效性指标包括了视敏度测量、骨密度研究、抓力和握力评估、肩运动范围、功能状态、肺功能、尿GAG排泄、视觉检查、心脏功能以及睡眠过程的氧饱和度。灌注过程中在1、2、12、24周进行了药代动力学评价以测量灌注过程中和之后的抗原(酶)水平。有10名患者参加-5名在美国5名在澳大利亚。所有患者完成了24周的治疗。没有死亡或中止的情况。所有患者接受了全部24次研究药物的灌注；因此，所有患者包含在安全性和有效性分析之内。
如1/2期研究一样，参加2期研究的MPS VI患者中间存在疾病严重程度的广泛差异。几名患者还具有该疾病的神经学特征，这包括交通性脑积水、颈椎不稳定和脊椎盘疾病。
临床实验室评定24周期间在这些患者中没有观察到临床上显著的实验室指标异常。
抗rhASB抗体和补体研究24周左右，10名患者中有8名发展出了抗rhASB抗体。在3名发展出比其他患者更高抗体水平的患者中，2名患者的抗体水平在24周以后继续上升但在48周左右似乎得以稳定。这两名患者或是“空缺”基因型或是在推测的ASB的主要抗原位置具有突变。与其他患者相比，这两名患者尿液GAG降低量较少。图14显示了48周治疗过程中的抗体水平。
在24周，1名患者在12周灌注前和灌注后均具有减少的C4和CH50值，这被研究者认为是临床上显著的。灌注之前C4和CH50略微低于正常值的下限并在灌注后显示出更大程度的减少。虽然这些结果提示了补体消耗的可能性，没有观察到与这样的消耗相一致的临床表征或症状。在本研究中任何其他的患者中没有观察到临床上显著的补体水平异常。
尿粘多糖尿粘多糖水平的平均下降是快速的，在第6周达到最低点并从第6周到24周保持相对恒定。在24周左右，尿GAG平均降低71％，并且在48周左右，尿GAG平均降低76％。所有10名患者显示出24周治疗后尿GAG水平减少至接近正常范围。这些数据与1/2期研究中针对7名患者所发现的结果相一致。图15显示了48周中总体尿液GAG水平的降低，图16显示了48周时该水平与相应年龄的正常水平的比较。
耐久性指标开始时以及随后每6周在针对所有患者的12分钟步行检测中评定了行走距离。距离以每次评价时两次独立的测量的平均数的形式进行记录并确定6分钟和12分钟的距离。
开始时，6分钟和12分钟行走的平均距离分别是152.4(±75.0)米和264.0(±161.7)米。在24周，6分钟步行的平均距离已经提高了57.3(±59.0)米(每位患者62％)，而12分钟步行的平均距离已经平均提高了155米(每位患者98％)。所有患者提高了其12分钟行走距离，并且除1名患者外的所有患者提高了其步行前面6分钟的距离。在48周，12分钟步行检测的平均提高是212米(每名患者138％)。图17显示了48周中12分钟步行检测结果的提高。
3分钟爬楼梯是检测的耐久性的第二个指标。开始时，10名患者能爬平均50.3(±29.5)级楼梯。24周左右，所攀爬楼梯的平均数已提高为98.1(±62.5)级楼梯，每名患者提高48级台阶或110％(±116％)。48周左右，所攀爬楼梯的平均数已经提高了61达到总共111级楼梯，每名患者147％的提高。图18显示了48周中3分钟爬楼梯结果的改进。患者在所攀爬的楼梯数方面变化很大，并且开始时的表现并不一定与24周时的改进程度相关联。
其他有效性指标本发明的最初24周内对多种其他有效性参数进行了评价。延时起立并行走检测用作综合功能能力的量度。总的说来，这一检测所需总的时间在开始时与第24周时之间没有显著降低，但在48周左右具有不大的改进。图19显示了48周治疗中延时起立并行走检测的结果。
进行了用力呼气时间(FET)、FVC和FEV1检测以评定肺功能。下面的表28展示了开始时、24周和48周时的肺功能值并且也显示了48周时身高和脏器肿大方面的改善。在24周时期内没有发现这些参数的明显变化。在第48周时，5/10名患者在FVC和FEV1方面有所改进，其中3名虽然发育状况变化小于2％，仍表现出改善。在第48周时，用力呼气时间(＞1秒)上也表现出平均43％的改善。
表28肺功能相对于生长和脏器肿大
1粗体值表示代表临床上有意义的提高的FVC值2表示开始时的肝脏大小是681.6±118cc3表示开始时的脾脏大小是146.8±40cc*开始时肝脏体积超出按体重调整的年龄的极限的95％，在第48周位于正常范围内+在开始时和第48周肝脏体积超出按体重调整的年龄的极限的95％表29肩部运动范围
对主动和被动的肩运动范围(弯曲、伸展、转动)进行了评估。对于该组总的来说，在主动和被动运动范围中均发现了适度百分比的提高；然而，有些病人在24周表现出某些指标的下降。在48周时，由于存在几个无关项导致了结果中高度的可变性；然而，发现尤其在开始时弯曲小于90°的患者中肩运动范围的持续改善。上面的表29显示了在开始时、第24和48周时肩运动范围的度数。
使用问卷评估了疼痛和关节僵直。虽然2名患者没有疼痛值的改变，7名患者在24周左右表现出疼痛状况的改善(1名患者没有开始时的评价)。所有评价的9名患者在第24周表现出僵硬症状的改善。通过使用问卷对疼痛和僵硬的评价在48周左右持续改善。治疗48周中的关节疼痛问卷和关节僵直问卷结果分别表示在图20和21中。
在整个患者组中均发现了抓力的显著进步。7名患者单手或双手的抓力都有改善。在24周的期间内几乎没有观察到握力检测中的变化。除了在48周时灵巧度和感官能力有适度改善(通过捡硬币检测测得)以外，在其他的生活质量评估中几乎没有发现显著变化。
使用附有带子的ActiTrac装置测量了活动水平。没有观察到活动水平的显著变化。
在心脏功能评估(ECG)中或站立高度和仰卧长度上没有观察到显著变化。在一部分患者中进行的睡眠研究没有表现出临床上显著的变化。
虽然参照所展示的优选实施方案对本发明进行了描述，应当理解到，可以作出各种改进而没有脱离本发明的精神。相应地，本发明只受以下权利要求的限制。
序 列 表<110>生物马林药物股份有限公司(BIOMARIN PHARMACEUTICAL，INC.)<120>N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体，使用所述酶治疗的方法以及生产和纯化所述酶的方法<130>30610/30011A<150>US 10/290,908<151>2002-11-07<160>22<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1656<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(45)..(1643)<400>1tagctacagt cggaaaccat cagcaagcag gtcattgttc caac atg ggt ccg cgc56Met Gly Pro Arg1ggc gcg gcg agc ttg ccc cga ggc ccc gga cct cgg cgg ctg ctc ctc104Gly Ala Ala Ser Leu Pro Arg Gly Pro Gly Pro Arg Arg Leu Leu Leu5 10 15 20ccc gtc gtc ctc ccg ctg ctg ctg ctg ctg ttg ttg gcg ccg ccg ggc152Pro Val Val Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Pro Pro Gly25 30 35tcg ggc gcc ggg gcc agc cgg ccg ccc cac ctg gtc ttc ttg ctg gca200Ser Gly Ala Gly Ala Ser Arg Pro Pro His Leu Val Phe Leu Leu Ala40 45 50gac gac cta ggc tgg aac gac gtc ggc ttc cac ggc tcc cgc atc cgc248Asp Asp Leu Gly Trp Asn Asp Val Gly Phe His Gly Ser Arg Ile Arg55 60 65
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340 345 350Trp Leu Pro Thr Leu Val Lys Leu Ala Arg Gly His Thr Asn Gly Thr355 360 365Lys Pro Leu Asp Gly Phe Asp Val Trp Lys Thr Ile Ser Glu Gly Ser370 375 380Pro Ser Pro Arg Ile Glu Leu Leu His Asn Ile Asp Pro Asn Phe Val385 390 395 400Asp Ser Ser Pro Cys Pro Arg Asn Ser Met Ala Pro Ala Lys Asp Asp405 410 415Ser Ser Leu Pro Glu Tyr Ser Ala Phe Asn Thr Ser Val His Ala Ala420 425 430Ile Arg His Gly Asn Trp Lys Leu Leu Thr Gly Tyr Pro Gly Cys Gly435 440 445Tyr Trp Phe Pro Pro Pro Ser Gln Tyr Asn Val Ser Glu Ile Pro Ser450 455 460Ser Asp Pro Pro Thr Lys Thr Leu Trp Leu Phe Asp Ile Asp Arg Asp465 470 475 480Pro Glu Glu Arg His Asp Leu Ser Arg Glu Tyr Pro His Ile Val Thr485 490 495Lys Leu Leu Ser Arg Leu Gln Phe Tyr His Lys His Ser Val Pro Val500 505 510Tyr Phe Pro Ala Gln Asp Pro Arg Cys Asp Pro Lys Ala Thr Gly Val515 520 525Trp Gly Pro Trp Met530
权利要求
1.一种包含人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的组合物，其特征在于，以蛋白质总量计，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的纯度至少等于或大于99％，其中所述纯度用反相HPLC(RP-HPLC)法测量。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，以蛋白质总量计，所述人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的纯度至少等于或大于99.2％，其中所述纯度用反相HPLC法测量。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体是糖基化的。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述纯度等于或大于99.8％。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述纯度等于或大于99.9％。
6.如权利要求1-5中任一所述的组合物，其特征在于，所述人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体是重组的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体。
7.如权利要求1-5中任一所述的组合物，其特征在于，以蛋白质总量计，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的纯度至少等于或大于99％，其中所述纯度用尺寸排阻色谱-HPLC(SEC-HPLC)法测量。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述经SEC-HPLC测定的纯度等于或大于99.5％。
9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述经RP-HPLC测定的纯度等于或大于99％并且所述经SEC-HPLC测定的纯度等于或大于99.5％。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1所述的组合物和药学上可接受的载体。
11.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物进一步包含氯化钠溶液和非离子去垢剂。
12.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体以约1-5mg/ml或每毫升约50-250单位的浓度存在。
13.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲液是浓度约10-50mM的磷酸钠缓冲液。
14.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述溶液的pH维持在约5.8。
15.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物进一步包含聚氧乙烯山梨糖醇。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述聚氧乙烯山梨糖醇是聚氧乙烯山梨糖醇20或80并且所述聚氧乙烯山梨糖醇20或80的浓度是约0.005％(重量/体积)。
17.一种用于治疗完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶缺陷引发的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予需要这种治疗的受试者有效量的如权利要求1-16中任一所述的组合物的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述疾病是粘多糖贮积症。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述疾病是MPS VI。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述疾病是Maroteaux-Lamy综合征。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述患者具有约10％或更低的正常N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶活性。
22.如权利要求17所述的方法，其特征在于，每周给予所述患者至少约50单位/千克或至少约1毫克/千克的所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体。
23.如权利要求17所述的方法，其特征在于，每周给予所述患者至少约100单位/千克或2.0毫克/千克的所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体。
24.一种生产重组N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(a)使用编码完整人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段或突变体的DNA转染的细胞生长；(b)将转染的细胞引入生物反应器；(c)向生物反应器提供生长培养基；(d)收获含所述酶的培养基；以及(e)从所述收获的培养基中充分去除转染细胞。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述细胞是哺乳动物细胞。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵细胞。
27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述转染细胞在含补充了选自L-谷氨酸、葡萄糖、次黄嘌呤/胸苷、丝氨酸、天冬酰胺酸和叶酸中一种或多种物质的JRH Excell 302培养基的生长培养基中生长。
28.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述生长培养基不含G418。
29.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述转染细胞在生物反应器中生长至多45天。
30.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述转染细胞在生物反应器中生长至多90天。
31.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述转染细胞经连续的滤膜与含所述酶的培养基充分分离。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述连续滤膜标定为4.0-0.75微米、0.45微米以及0.2微米。
33.一种用可操作的DNA转染以产生重组N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、类似物或突变体的细胞系，其特征在于，所述酶由该细胞系分泌或保留在细胞系内。
34.如权利要求33所述的细胞系，其特征在于，所述转染细胞是中国仓鼠卵细胞。
35.如权利要求34所述的细胞系，其特征在于，所述中国仓鼠卵细胞是CHO-K1细胞。
36.如权利要求35所述的细胞系，其特征在于，所述转染细胞是CSL4S-342细胞。
37.一种纯化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的方法，其特征在于，所述方法包括(a)获得含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的液体；(b)降低所述液体中能切割N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的蛋白酶的蛋白水解活性，其中所述降低不会损害所述的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体；(c)将该液体与Cibracon蓝染料相互作用层析树脂接触；(d)将该液体与铜螯合层析树脂接触；(e)将该液体与苯基疏水相互作用层析树脂接触；(f)回收所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述获得包括使用编码N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的基因转化的细胞培养物生长。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述基因编码人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。
40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述细胞是哺乳动物细胞。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵细胞。
42.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述获得进一步包括从所述细胞培养物中收获液体。
43.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述获得进一步包括将所述液体浓缩约20倍。
44.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述降低包括将液体的pH调节到等于或低于8.0。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述降低包括将液体的pH调节到约4.8-5.5。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述降低包括将液体的pH调节到约4.8-5.2。
47.如权利要求36所述的方法，其特征在于，步骤(c)包括使液体流经Cibracon蓝染料相互作用色谱柱。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述Cibracon蓝染料相互作用色谱柱是Blue Sepharose 6 Fast Flow柱。
49.如权利要求36所述的方法，其特征在于，其中步骤(d)包括使液体流经铜螯合层析柱。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述铜螯合层析柱是ChelatingSepharose Fast Flow柱。
51.如权利要求36所述的方法，其特征在于，其中步骤(e)包括使液体流经苯基疏水相互作用层析柱。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述苯基疏水相互作用层析柱是Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub柱。
53.如权利要求36所述的方法，其特征在于，其中步骤(c)、(d)和(e)的时间顺序是步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)。
54.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述回收包括液体的渗滤。
55.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述回收包括过滤液体以去除DNA。
56.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述回收包括过滤液体以去除病毒。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述过滤包括使所述液体流经0.2微米的滤膜。
58.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述回收的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体的纯度至少等于或大于99％。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述纯度使用反相HPLC法测量。
60.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述液体不与DEAE Sepharose树脂接触。
61.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含用权利要求36所述方法纯化的纯度至少等于或大于99％的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体。
62.一种纯化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、类似物或突变体的方法，其特征在于，所述方法包括(a)获得含所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、类似物或突变体的液体；(b)降低所述液体中能切割所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、类似物或突变体的任何蛋白酶的蛋白水解活性，其中所述降低不损害所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、类似物或突变体；(c)将该液体与Cibracon蓝染料相互作用层析树脂接触；(d)将该液体与铜螯合层析树脂接触；(e)将该液体与苯基疏水相互作用层析树脂接触；(f)回收所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、类似物或突变体；其中，步骤(c)、(d)和(e)可以任何时间顺序进行。
63.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前体和浓度介于约0.002％-0.008％(重量/体积)的聚氧乙烯山梨糖醇。
64.如权利要求63所述的药物组合物，其特征在于，所述聚氧乙烯山梨糖醇是浓度0.005％(重量/体积)的聚氧乙烯山梨糖醇80。
65.一种治疗完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶缺陷引起的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予需要这种治疗的人类受试者有效量的含重组人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)的组合物的步骤。
66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述rhASB的量可有效提供一种或多种选自关节活动性、关节痛、关节僵直、运动耐量、运动耐久性、肺功能、视敏度以及日常生活活动性的有益效果。
67.一种治疗VI型粘多糖贮积症(MPS VI)的方法，其特征在于，所述方法包括给予需要这种治疗的患者有效量的含重组人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)的组合物的步骤。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述rhASB的量可有效提供一种或多种选自关节活动性、关节痛、关节僵直、运动耐量、运动耐久性、肺功能、视敏度以及日常生活活动性的有益效果。
69.如权利要求65或67所述的方法，其特征在于，所述rhASB以至少每周0.2mg/kg的剂量给药。
70.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述rhASB以至少每周1.0mg/kg的剂量给药。
71.如权利要求65或67所述的方法，其特征在于，所述rhASB每周一次经2-4小时的灌注进行给药。
72.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述rhASB每周一次经4小时的灌注进行给药。
73.重组人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)在制备用于治疗遭ASB活性缺陷侵袭的人的药物中的应用。
74.重组人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)在制备用于治疗遭MPS VI侵袭的人的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了高纯度的重组人N－乙酰半乳糖胺－4－硫酸酯酶前体和其生物学活性突变体、片段和类似物以及包含高纯度重组人N－乙酰半乳糖胺－4－硫酸酯酶前体的药物组合物。本发明也提供了用于治疗完全或部分由人N－乙酰半乳糖胺－4－硫酸酯酶缺陷引起的包括MPS VI在内的疾病的方法以及生产并将重组前体酶纯化为高纯度形式的方法。
文档编号C07H21/04GK1726046SQ200380105922
公开日2006年1月25日 申请日期2003年11月7日 优先权日2002年11月7日
发明者M·秦, J·M·亨斯兰德, G·N·泽切尔勒, D·J·文特, W-P·占, L·陈, P·A·菲茨帕特里克, C·M·斯塔尔, S·斯韦德勒 申请人:生物马林药物股份有限公司