一维磷酸钙纳米/微米材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及基因载体
技术领域：
，特别涉及一种一维磷酸钙纳米/微米材料及其制备方法和应用。
背景技术：
：基因治疗通过将外源基因导入到靶细胞核内以修复导致疾病的缺陷基因或者抑制导致疾病的有害基因，从而达到治疗疾病的目的。成功的基因治疗依赖于有效的基因载体，常见的载体分为病毒类载体和非病毒类载体。而病毒类载体因存在极大的安全隐患而限制了其发展。近年来，微环dna(minicircledna，mcdna)的出现，成为基因载体中的一大亮点，微环dna是一个环状的表达盒子，是通过dna重组技术，把标准质粒的细菌骨架dna去除后的产物，只含有一个基因表达框而没有外在的细菌骨架序列，其优点是能有效延长靶基因在细胞内的表达时间、携带的基因量大且几乎无毒性。但是由于裸露的dna在生理环境中会被迅速清除，不能有效进入靶细胞，仍需合适的投递系统将微环dna递送至靶向组织或器官。常用的基因投递系统包括阳离子脂质体，阳离子多聚物(聚乙烯亚胺pei)等。这类投递系统免疫原性较低、基因装载容量大，但是转染效率低，大大限制了其临床应用。因此，研究开发高效，具有良好生物相容性且具有靶向性的基因投递系统是解决基因药物临床应用的关键。磷酸钙作为基因载体，生物安全性比较高，在很好的保护包裹dna的同时，没有明显的细胞毒性。但一般存在粒径不可控、容易团聚、转染效率低等问题。但是磷酸钙-基因共沉淀法转染效率非常低(约10～20％)，制备的磷酸钙颗粒粒径大且难于控制，稳定性差，易团聚，难于用于体内转染研究。leafhuang等提出通过反相微乳法制备的磷脂双分子层包裹的dna/磷酸钙纳米颗粒系统，但对磷酸钙的纯化步骤较繁琐，制备过程使用的阳离子脂质体具有较高的细胞毒性，且磷脂材料价格昂贵，不利于进一步临床应用。技术实现要素：有鉴于此，本发明通过微波水热合成法制备了一维磷酸钙纳米/微米材料，其具有较大的长径比(其为纳米棒或具有尖端的针状物)，所述一维磷酸钙纳米/微米材料与微环dna混合后，经腹腔注射，可以在小鼠腹腔内高效转染。可以作为高效转染的基因载体。第一方面，本发明提供了一种一维磷酸钙纳米/微米材料的制备方法，包括以下步骤：(1)将水溶性钙盐和水溶性磷酸盐分别溶于水中，配制得到水溶性钙盐和水溶性磷酸盐溶液，将所述水溶性钙盐和水溶性磷酸盐溶液加入到第一溶剂中，混合后得到第一混合溶液，其中，所述第一溶剂为水，或者水和醇的混合溶剂，所述醇包括乙醇、乙二醇和丙三醇中的一种或多种；(2)调节所述第一混合溶液的ph值为5-11，将调节ph后的混合溶液置于微波水热釜中进行微波辅助水热反应，其中，反应温度为110-180℃，反应时间为10-60min；(3)对反应后所得产物进行离心分离，并对分离出的固形物进行洗涤、干燥，得到一维磷酸钙纳米/微米材料。优选地，所述水溶性钙盐为氯化钙和/或其水合物、硝酸钙和/或其水合物(ca(no3)2·4h2o)、和/或乙酸钙和/或其水合物(ca(ch3coo)2·h2o)，但不限。优选地，所述水溶性磷酸盐为磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾等；，但不限于以上列举的可溶性无机磷酸盐。即，包括但不限于(nh4)3po4，(nh4)2hpo4，(nh4)h2po4，na3po4，na2hpo4，nah2po4，k3po4，k2hpo4，kh2po4或k2hpo4。优选地，所述水溶性钙盐和水溶性磷酸盐溶液的ca：p摩尔比为(0.5-5)：1。进一步优选地，所述水溶性钙盐和水溶性磷酸盐溶液的ca：p摩尔比为(0.5-2)：1。进一步优选成(0.5-1.5)：1。优选地，所述第一溶剂为水和醇的混合溶剂。进一步优选地，所述第一溶剂中，水与乙醇的体积比为(0.1-10)：1。进一步优选地，所述第一溶剂中，水与乙醇的体积比为(0.5-3)：1。优选地，第一混合溶液的ph值为7-11。优选地，所述调节ph采用的是酸或碱。进一步优选地，所述调节ph采用的酸为盐酸、硝酸或醋酸；所述调节ph采用的碱为氨水、naoh或koh。优选地，步骤(2)中，所述反应温度为120-160℃，例如为130、140、150℃。步骤(2)中，所述反应时间可以为20、30、45、45、50或60min。优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料为棒状结构。优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料的直径为10-1000nm。优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料的长度为50nm-500μm。进一步优选为100nm-100μm；或者是350-30μm。更优选为150-350nm。优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料的长径比大于5：1。进一步优选为大于10：1。所述一维磷酸钙纳米/微米材料可以是两端平整的纳米/微米棒，也可以是两端均为尖端的纳米/微米棒结构(此时也可称为针状结构)，还可以是一端平整、另一端为尖端的结构。进一步优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料为两端均为尖端的纳米/微米棒结构。此种情况下长径比大于20：1。更优选为(20-50)：1。进一步地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料上还修饰有细胞特异识别的配体。所述细胞特异识别的配体包括但不限于如乳糖或半乳糖配体，透明质酸配体，叶酸配体、转铁蛋白配体，脂多糖配体、多肽配体(如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸系列多肽)等的修饰。可以理解的是，所述特异性配体靶向的细胞类型包括但不限于各种肿瘤细胞、免疫细胞(如巨噬细胞、dc细胞、t细胞、b细胞、nk细胞等)、正常组织细胞(如干细胞、肝细胞、肌肉细胞、上皮细胞等)。所述配体可以由所述一维磷酸钙纳米/微米材料在用作基因载体时的递送的目的地来选择。所述细胞特异识别的配体，可以在微波辅助水热法制备得到所述一维磷酸钙纳米/微米材料后，修饰上所述配体，也可以在上述第一混合溶液中加入细胞特异识别的配体。但若选择在制备过程中加入所述配体，需要确保在所述第一混合溶液中添加配体后，仍可以得到配体修饰的一维磷酸钙材料结构(不改变其一维结构)。优选地，在制得所述一维磷酸钙纳米/微米材料后，再修饰上述配体。在本发明一实施方式中，可以将目标蛋白和/或多肽配成一定浓度水溶液，将制备好的一维磷酸钙纳米/微米材料分散于上述蛋白/多肽溶液中，充分搅拌过夜后，离心得到表面修饰有蛋白/多肽的一维磷酸钙材料。在本发明另一实施方式中，将一维磷酸钙纳米/微米材料先在多氨基化合物(如聚乙烯亚胺)溶液中反应过夜，通过正负电荷吸引过程，使磷酸钙表面分布大量氨基，再通过连接的氨基与带羧基的配体(rgd环肽和/或叶酸分子)在偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)等的作用下共价偶联达到接枝上配体的目的。本发明第一方面提供的一维磷酸钙纳米/微米材料的制备方法，其制备流程简单，产率较高，且无需使用昂贵的原料，通过调节反应温度、时间、体系ph、钙源与磷源的比等条件可以控制所得磷酸钙纳米/微米材料的形貌、尺寸等。所得一维磷酸钙纳米/微米材料，具有较高的长径比，生物相容性良好，可以作为基因载体，直接与dna(例如微环dna)混合得到dna-磷酸钙溶液，当dna-磷酸钙溶液经腹腔注射至小鼠腹腔内，由于其为较高长径比的一维结构，所述一维磷酸钙材料可以容易刺激间皮细胞，细胞在分裂或者增生的过程中细胞膜的通透性增大，使dna快速进入到细胞中，而且，细胞在受到刺激时会增殖分裂，这时细胞核核膜打开，细胞核一分为二，使dna能进入细胞细胞核实现高效转染。第二方面，本发明提供了由本发明第一方面所述的制备方法制得的一维磷酸钙纳米/微米材料。第三方面，本发明提供了一种药物组合物(或称为基因载体复合物，基因递送系统)，包括上述一维磷酸钙纳米/微米材料和核酸。所述一维磷酸钙纳米/微米材料负载所述核酸，所述负载可以为共混或结合。优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料与核酸的质量比为(1-200)：1。进一步优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料与核酸的质量比为(10-150)：1。进一步优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料与核酸的质量比为(15-100)：1。更优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料与核酸的质量比为100：1。优选地，所述核酸包括dna片段和rna片段中的一种或多种，但不限于此。如本发明所述的，“dna片段”包括人工合成和在生物样品中提纯的dna片段的一种或多种；“rna片段”包括人工合成和在生物样品中提纯的rna片段的一种或多种。具体地，所述人工合成或在生物样品中提纯的dna片段可以为质粒dna、微环dna或dna片段等；具体地，所述人工合成或在生物样品中提纯的rna片段可以为microrna(微型rna)、sirna(小干扰rna)、shrna等。进一步优选地，所述核酸为微环dna，但不限于此。优选地，所述药物组合物还包括生物药物和化学药物中的至少一种，其中，所述生物药物包括但不限于多肽、蛋白和疫苗中的一种或多种；所述化学药物包括但不限于抗癌药物、显影剂和示踪剂中的一种或多种。所述示踪剂可以是荧光染料、淋巴示踪剂等。第四方面，本发明提供了上述药物组合物的制备方法，包括以下步骤：将一维磷酸钙纳米/微米材料溶液及核酸溶液混合后，经孵育制得所述药物组合物。其中，所述一维磷酸钙纳米/微米材料负载所述核酸，所述负载可以为共混或结合。优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料与核酸的质量比为(1-200)：1。进一步优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料与核酸的质量比为(10-150)：1。进一步优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料与核酸的质量比为(15-100)：1。更优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料与核酸的质量比为100：1。优选地，在所述一维磷酸钙纳米/微米材料溶液及核酸溶液混合时，还可以加入生物药物和化学药物中的至少一种，其中，所述生物药物包括但不限于多肽、蛋白和疫苗中的一种或多种；所述化学药物包括但不限于抗癌药物、显影剂和示踪剂中的一种或多种。进一步优选地，所述一维磷酸钙纳米/微米材料溶液为一维磷酸钙纳米/微米材料的水系溶液，但不限于此。具体地，包括但不限于一维磷酸钙纳米/微米材料的水溶液、一维磷酸钙纳米/微米材料的生理盐水溶液、一维磷酸钙纳米/微米材料的葡萄糖溶液、一维磷酸钙纳米/微米材料的磷酸盐缓冲液等。进一步优选地，所述核酸溶液为核酸的水系溶液，但不限于此。具体地，核酸的水系溶液包括但不限于核酸的水溶液、核酸的生理盐水溶液、核酸的葡萄糖溶液、核酸的磷酸盐缓冲液等。如本发明所述的，所述孵育直接在室温下进行反应，无须加热或降温，所述孵育温度为20-37℃。优选地，所述孵育的时间为10-100min。优选地，所述药物组合物可经过稀释、浓缩制成水溶液针剂，用于基因治疗。优选地，所述药物组合物还可通过冻干等工艺，制成冻干粉针剂，用于基因治疗。第五方面，本发明提供了如本发明第一方面所述的一维磷酸钙纳米/微米材料或如本发明第三方面所述的药物组合物在制备核酸投递药物中的应用。所述一维磷酸钙纳米/微米材料或所述药物组合物在用作核酸投递药物时，其毒性小，生物相容性高，核酸的递送效率、表达效率较高。第六方面，本发明还提供了一种投递核酸分子到细胞的方法，其包括使所述细胞与本发明第三方面所述的药物组合物接触。优选地，所述细胞在体内，但不限于此。进一步优选地，所述使所述细胞与本发明第三方面所述的药物组合物接触的方式为：采用体外转染或体内皮下注射(如腹腔注射)或肌肉注射的方式使所述细胞与本发明第三方面所述的药物组合物接触。其中，采用腹腔注射方式来将所述药物组合物注射如小鼠体内时，可以在腹水及血液中检测出高浓度的dna表达产物。优选地，采用体内皮下或肌肉注射的接触方式时，所述药物组合物按照不低于0.1-10μg核酸/kg动物体重的使用量施用，但没有特别限定。本发明的有益效果包括以下几个方面：1)所述一维磷酸钙纳米/微米材料的结构独特，生物相容性良好，在用作基因载体时的转染效率高、毒性小；2)所述一维磷酸钙纳米/微米材料与核酸(如微环dna)构成的药物组合物的稳定性良好，可以高效、长期表达微环dna；3)本发明所述一维磷酸钙纳米/微米材料、药物组合物的制备方法简便易行，可控程度高。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。图1为本发明不同实验组提供的一维磷酸钙纳米/微米材料的xrd结果；图2为本发明不同实验组及对比实施例提供的一维磷酸钙纳米/微米材料的电镜照片，及其介导的带荧光素的微环dna在腹腔注射后的转染结果；图3为本发明实施例制得的一维磷酸钙纳米/微米材料与dna的琼脂糖凝胶电泳实验的结果；图4为不同质量比的一维磷酸钙纳米/微米材料/dna对小鼠腹腔转染荧光素酶的效果影响图；图5为本发明实施例中一维磷酸钙纳米/微米材料介导微环dna在腹腔转染cd3/cmet双靶向抗体的转染结果，左图为血清中抗体浓度；右图为腹腔中抗体浓度。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。制备实施例：一维磷酸钙纳米/微米材料的制备本发明提供了一维磷酸钙纳米/微米材料的制备方法，包括以下步骤：(1)将3mlnah2po4溶液(0.05mol/l)和3ml的cacl2溶液(0.1mol/l)加入到15ml去离子水和15ml无水乙醇组成的混合溶剂中，在室温下均匀混合；然后将混合后溶液的ph值调至7.0±0.5，得到反应溶液a。(2)将反应溶液a倒入微波水热反应釜中，在110℃下微波加热10min，等体系自然冷却到60℃以下时取出反应釜；(3)将反应釜内的产物在12000g下离心10min，并将对分离出的固形物采用无水乙醇洗涤3次，最后冷冻干燥，得到磷酸钙纳米/微米材料，将此样品命名为样品1。需要说明的是，根据不同需要，可以改变溶液a的ph、反应温度与时间、水溶性钙盐和水溶性磷酸盐溶液的ca：p摩尔比、水系体积等，得到不同粒径的一维磷酸钙样品。本实施例共提供了1～10组不同实验条件制备的磷酸钙样品，具体配比如下表1所示：表1实验组溶液a的pht/℃t/min17.011010211.01101035.01101046.01101058.01101069.011010710.01101087.011030910.0150301010.018010磷酸钙样品表征实验：将实施例1的各实验组制得的磷酸钙样品置于xrd测试仪上，进行xrd粉末衍射表征，结果如图1所示。从图1的xrd可以看出，反应溶液的ph值为7、11、6时，所得反应产物的晶体相为羟基磷灰石(p63/m，卡片编号25-0166)，而反应溶液ph值为5时，反应产物的晶体相为透钙磷石(la(9)，卡片编号11-0293)，都是磷酸钙常见的晶体结构。将各实验组制得的磷酸钙样品分散在水溶液中，超声10min以上至样品完全分散，然后滴在铜网上，用feitecnaig2f20s-twin型号电子显微镜在110v电压下获得各样品的电镜照片，结果如图2所示。磷酸钙样品的细胞活性实验：将上述表1中本发明实施例的实验组1制得的一维磷酸钙样品与293t细胞共孵育24小时后，用cck8试剂盒检测其细胞毒性。实验结果证明，在磷酸钙样品的浓度为1×10-5～1mg/ml时，283t细胞的存活率到90-100％，这说明磷酸钙样品对283t细胞无明显毒性，细胞形态及增殖正常。琼脂糖凝胶电泳实验：控制每个测试组均含有0.5μg的dna,按照磷酸钙样品与dna的不同质量比(0.25:1，0.5:1，1:1，2:1，4:1)，将dna溶液与磷酸钙样品(样品1)混合，至总体积20μl，(同时以单独的dna溶液作为对照)加入含有dna染料(1％，w/v)的琼脂糖凝胶。再加入2μlloadingbuffer(上样缓冲液)均匀混合后，加入到加样孔内。电泳过程在tris-醋酸缓冲溶液(tae)中进行，在80v电压下电泳进行40分钟，然后用凝胶成像仪在紫外照射下成像观察，结果如图3所示。dna为带负电的大分子，在电场作用下会向正极移动。图3的琼脂糖凝胶实验中，发现dna与磷酸钙孵育后，dna可在电场作用下移动，这说明磷酸钙对dna的移动并无阻滞作用，此实验证明dna与磷酸钙之间并没有化学作用力。磷酸钙样品介导微环dna腹腔转染(荧光素酶)：将2mg的各组磷酸钙样品分散在200μl超纯水中，超声10分钟，形成磷酸钙溶液；将20μg带有荧光素酶(luciferase)表达基因的微环dna分散在200μl水中，形成微环dna溶液b；将上述微环dna溶液b加入上述磷酸钙溶液中，形成药物组合物溶液c；将药物组合物溶液c经腹腔注射进年龄在6-8周、体重为20g的小鼠体内，24小时后用ivis小动物成像仪观测荧光素酶在小鼠体内的表达情况，结果如图2所示，图中，红色圆圈处代表roi(regionofinterest，感兴趣区域)。对比实施例1：(1)200mg蛋黄卵磷脂溶于15ml无水乙醇中，得到蛋黄卵磷脂溶液；将3ml的nah2po4溶液(0.05mol/l)和3mlcacl2溶液(0.1mol/l)加入到15ml去离子水和15ml无水乙醇组成的混合溶剂中，在室温下均匀混合，得到第一混合溶液；(2)将上述蛋黄卵磷脂溶液加入到上述第一混合溶液b中，得到第二混合溶液；将得到的第二混合溶液置于微波水热反应应釜中，在110℃下微波加热10min，等体系自然冷却到60℃以下时取出反应釜；(3)将反应釜内的产物在12000g下离心10min，并将对分离出的固形物采用无水乙醇洗涤3次，最后冷冻干燥，得到卵磷脂修饰的磷酸钙纳米颗粒，，将此样品命名为对1样品。对比实施例2：(1)将0.111g三磷酸腺苷二钠盐(atp)和0.111gcacl2溶解在50ml蒸馏水中，磁力搅拌至充分溶解，将溶液ph值调为7.0；(2)将跳后ph的溶液置于微波水热反应应釜中，在110℃下微波加热10min，等体系自然冷却到60℃以下时取出反应釜；(3)将反应釜内的产物在12000g下离心10min，并将对分离出的固形物采用无水乙醇洗涤3次，最后冷冻干燥，得到以三磷酸腺苷为磷源的磷酸钙纳米颗粒，将此样品命名为对2样品。图2为本发明实施例以及对比实施例制得的磷酸钙样品的电镜照片及各磷酸钙样品介导微环dna腹腔转染荧光素酶的结果。由图2看出，本发明提供的方法所制得的磷酸钙样品均为一维结构，其中，样品1、2均为两端均为尖端的一维纳米/微米棒结构(此时也可称为针状结构)，样品1、2直径分别为10nm、20nm，长度约为150nm、300nm。样品3、10为两端平整的纳米/微米棒。样品3的直径为600nm、长度约为20μm；样品10的直径为30nm、长度约为400nm。而且本发明实施例制得的各一维磷酸钙纳米/微米材料均能较好地介导微环dna的腹腔转染。而对比实施例1、2制得的样品为圆形颗粒，直径分别约为100、150nm；这可能是由于在磷酸钙结晶过程中加入可与钙离子螯合的有机物，钙离子可能会优先与有机物螯合，磷酸钙晶体在生长过程中长程有序的结晶过程被打断，形成无定型的球形磷酸钙颗粒。当它们分别用于体内转染带有荧光素酶(luciferase)表达基因的微环dna时，未在小鼠腹腔观察到表达的荧光素酶，这说明圆形颗粒的磷酸钙材料不能起到很好的刺激细胞的作用，进而不能实现dna的有效转染。不同质量比的一维磷酸钙纳米/微米材料/dna对小鼠腹腔转染荧光素酶的效果影响将0.3、0.6、1mg的各组磷酸钙样品分别分散在200μl超纯水中，超声10分钟，形成磷酸钙溶液；将20μg带有荧光素酶(luciferase)表达基因的微环dna分散在200μl水中，形成微环dna溶液；将上述微环dna溶液分别加入到上述各磷酸钙溶液中，形成药物组合物溶液；将药物组合物溶液经腹腔注射到年龄在6-8周，体重约为20g的balb/c小鼠体内，24小时后用ivis小动物成像仪观测荧光素酶在小鼠体内的表达情况，结果如图4所示。由图4可以看出，磷酸钙的剂量对体内转染效果有较大影响，同样的每只小鼠注射20μg的dna，磷酸钙剂量越大，转染效果越强。这可能是因为大量的磷酸钙更容易刺激间皮细胞的应激反应，有利于dna吞噬。磷酸钙样品介导微环dna腹腔转染(抗cd3/抗cmet双靶向抗体)：将2mg的各组磷酸钙样品分散在200μl超纯水中，超声10分钟，形成磷酸钙溶液；将20μg带有抗cd3/抗cmet双靶向抗体表达基因的微环dna分散在200μl的超纯水中，形成微环dna溶液c；将上述微环dna溶液c加入上述磷酸钙溶液中，形成药物组合物溶液d；将该药物组合物溶液d经腹腔注射进体重为20g的小鼠体内，24小时后将小鼠处死，监测小鼠的腹水和血清中表达的双靶向抗体浓度，结果如图5所示。其中，图5中左图为血清中抗体浓度；右图为腹腔中抗体浓度。图5的结果表明：经过磷酸钙介导，腹腔注射微环dna可以在腹腔中表达目标蛋白，如可在血清及腹水中检测到高浓度的抗cd3/抗cmet双靶向抗体，且血清中的抗体浓度高于腹水。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12