专利名称：大豆异黄酮及用大孔吸附树脂制备该大豆异黄酮的方法
技术领域：
本发明涉及大豆异黄酮及其制备方法，尤其涉及采用经过筛选的专一性大孔吸附树脂制备的高纯度大豆异黄酮产品及其工业化生产方法。
大豆异黄酮是一种植物性雌激素，它具有雌激素的生理功能，研究表明，大豆异黄酮可有效抑制人类乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等常见的多发性病症，对防治中老年妇女骨质疏松具有重要的作用，却没有一般激素的副作用。鉴于大豆异黄酮优异的保健功能，研究和提取大豆异黄酮已成为本领域的一个热点。
大豆异黄酮是大豆及大豆制品中所含有的异黄酮类生物活性物质，包括12种异构体成分，它们在大豆中的总含量很低，平均只有0.2～0.3％左右，而且在水中的溶解度较低，主要溶于醇溶性溶剂中，另外，大豆中成分复杂，有许多成分如大豆低聚糖、色素等与大豆异黄酮的性质相近，较难分离，使生产制备高纯度的异黄酮成为技术难度较大的课题。
在本发明以前，有关提取制备大豆异黄酮的研究报道已有很多，根据这些现有技术的记载，大豆异黄酮的提取制备方法一般包括大豆原料的脱脂、用水溶性醇溶液进行提取、用吸附柱处理提取液(称上柱)、醇溶液洗脱等过程，洗脱液经浓缩干燥即得到大豆异黄酮产品。上述方法中，影响产品的得率和纯度的因素主要是上柱和洗脱条件的确定，一般选用的吸附树脂是乙基-乙烯基苯-二乙烯基苯、苯乙烯-二乙烯基苯、或聚苯乙烯聚合物，可以是离子化的或非离子化的，但试验结果表明，这样的树脂对吸附大豆异黄酮的专一性不强，经过一次吸附、洗脱后制备的异黄酮成分的总纯度最多只有20～30％(可参见日本公开特许公报，昭62-126186)，为得到高纯度的大豆异黄酮，必须进一步采取重结晶等其它精制手段，例如申请号是98119864.3的中国专利公开的方法中，采用了二步水解，第一次水解在柱层析前进行，第二次水解在柱层析后进行，产物还需进行精制，才能得到高纯度的异黄酮产品；再如美国专利USP.5,679,806，提取产物需经过包括活性炭脱色、甲醇结晶等多次精制的过程，这样产品的纯度提高了，但多次操作导致损失大，使产品得率降低，生产成本大大提高，因而无法工业化生产。
据考证，目前只有美国和日本的个别厂家有此产品上市，国内从事此项研究的单位很多，但仅停留在实验室阶段，阻碍研究进展的主要原因是尚未筛选到有特异吸附功能的专一性树脂，产品纯度及得率低，生产工艺繁琐，导致生产成本高，产品缺乏市场竞争力。
本发明的目的之一是提供一种高纯度的大豆异黄酮产品，其以四种主要异构体成分的总量计的纯度在50％以上，可用作食品添加剂或用于保健食品的制造。
本发明的另一主要目的在于提供一种提取制备高纯度大豆异黄酮的工艺方法，通过筛选出有特异性的大孔吸附树脂，配合相适应的操作处理，采用一步法吸附解脱纯化工艺，制备出纯度高达50％以上的大豆异黄酮产品，降低了生产成本，从而实现工业化生产。
在大豆异黄酮包括的12种异构体成分中，公认的主要成分有4种，它们是黄豆苷(Daidzin，简称D)、黄豆苷原(Daidzein，简称De)、染料木素(亦称染料木苷，Genistin，简称G)和染料木因(亦称染料木黄酮，Genistein，简称Ge)，其结构式如下 黄豆苷 染料木素(染料木苷)Daidzin(D) Genistin(G) 黄豆苷原 染料木因(染料木黄酮)Daidzein(De)Genistein(Ge)异黄酮苷分解得到相应的苷原，大量的体外试验证实，大豆异黄酮具有生理活性的成分是苷原，而经体内试验表明含糖苷的异黄酮同样具有上述功能，这是因为生物体内肠道细菌酶具有切除糖苷的能力，异黄酮糖苷可通过肠道细菌作用后成为苷原，经小肠吸收后以游离异黄酮的形式起作用。有人在用动物模型试验大豆异黄酮对大鼠血脂和过氧化状态的影响时，分别用异黄酮苷原和异黄酮糖苷作喂养试验，结果表明两者的作用特点和效果基本一致，同等重量的苷原略优于糖苷，可以断定是分子量不同所引起的差异。因此本发明人认为将大豆异黄酮用作食品添加剂或保健食品时，没有必要将异黄酮苷先行分解成苷原。
根据本发明的第一个方面，提供了一种大豆异黄酮产品，其基本上由上述四种异构体组成，其纯度为50％以上，是指其它异构体忽略不计，而基于四种主要的异黄酮异构体D、De、G、Ge总含有量计的纯度。
根据本发明的第二个方面，提供了该大豆异黄酮的一种制备方法，以大豆的脱脂产物为原料，该制备方法包括用甲醇溶液提取原料制成提取液、使用絮凝剂对该提取液进行絮凝澄清及用极性大孔吸附树脂分离纯化该澄清后的提取液。
本发明的方法是从大豆中提取异黄酮，所述的原料可以包括大豆、豆胚或豆粕。如果使用大豆、豆胚作原料，需要先进行脱脂处理。也可以以脱脂豆粕为原料，直接进行提取。
根据本发明优选的技术方案，大豆异黄酮的制备方法包括以下过程(1)用浓度为65～78％的甲醇溶液提取原料制成提取液，提取温度70～78℃，提取时间2-5小时，然后浓缩提取液并回收甲醇；(2)将上述提取液稀释成总固形物含量≤20％的溶液后加入絮凝剂，絮凝澄清；(3)将澄清液加到装填有极性大孔吸附树脂的吸附柱中；(4)以60～80％乙醇溶液解吸。
发明人在实际操作中发现，传统的静置沉淀分离不利于浓缩液的上柱吸附分离，所以本发明在上柱前要求加入絮凝剂对浓缩液进行絮凝澄清，絮凝剂可以使用本领域常用的絮凝剂，其中有效的絮凝剂优选明胶、甲壳素、氨基化甲壳素(或称JA澄清剂)，加入絮凝剂的目的主要是为了除去溶液中的蛋白质等杂质，确保提取液中的有效成分在通过吸附柱时被树脂充分吸附。絮凝剂可以按常规方法使用，但优选在使用前将其配成1～2％的溶液，并将上述的提取浓缩液适当稀释(通常使用去离子水)后添加絮凝剂，添加时要施以慢速搅拌，添加完毕后静置2-4小时即可达到澄清的要求，絮凝剂的添加量可以按照常规方法或通过试验确定，优选是使该絮凝剂在提取液中的浓度为200～400ppm。
絮凝澄清后的上清夜可以直接上柱，也可以向其中加入乙醇，并使乙醇在澄清液中的浓度不大于10％，即用含有0-10％乙醇(工业乙醇)的澄清液上柱。
极性大孔吸附树脂的筛选是实现本发明目的的关键所在，本发明经过对弱极性、极性的多种适用于分离纯化黄酮类树脂的吸附解脱特性的试验比较，最终确定为极性大孔吸附树脂，尤其是筛选出一类用聚苯乙烯再交联上功能极化基团的特效极性大孔吸附树脂，增加了对大豆异黄酮的亲和力，使物料中的异黄酮组分特别是所述的四种主要组分能被充分吸附，在水洗过程中只能洗去寡糖、色素等杂质，而在解吸时又能最大限度地解脱下来，从而保证了最终产品的纯度。根据发明人的筛选结果，聚苯乙烯与酰胺基团交联形成的吸附树脂具有非常好的效果，具体实例包括南开大学生产的标号为ADS-5、ADS-17、ADS-7的大孔吸附树脂等产品。
用于上柱后进行解吸的溶液，一般使用乙醇，优选60～80％的乙醇。根据本发明优选的技术方案，澄清液上柱及用乙醇溶液解吸时，速度控制在1-3倍柱体积/小时。在用乙醇解吸前，先用水洗，以除去其中的寡糖、色素等杂质，然后用乙醇解吸，收取到的解吸液蒸发除去乙醇和部分水分，然后经浓缩干燥，优选采用真空浓缩干燥，即可得到最终的异黄酮产品。
除以上所述，在实施本发明方法的过程中所涉及的其它操作，例如提取液或澄清液中滤渣的分离，可以采用离心分离，也可以直接过滤(真空抽滤等)，上柱和解吸过程的具体操作属于本领域的基本技能，而涉及到的有机溶剂回收和物料的浓缩等，均可采用常规的常压或减压操作或其它可行的操作，这些不属于本发明的范畴，本发明亦没有特别限定。
发明人还采用HPLC方法对本发明方法得到的产品中异黄酮含量进行了定性和定量分析检测，从得到的峰图中可以看出，本发明各样品的杂峰都很少，与标样的峰图对比，可知其中主要是D、De、G、Ge四个异构体的峰(见图2、4、5)，其它异构体忽略不计，仅以这四种异构体的含量计算，已超过50％。作为对比，图6是将豆粕的提取液经浓缩、脱溶等一般方法制备的异黄酮产品的HPLC谱图，由于仪器和吸附柱的不同虽然使试验中出峰时间不同，但从图谱中可见杂峰众多，并可知其成品(四种主要成分)的纯度小于30％。
从检测结果可以证实，由于本发明使用了专一性的吸附树脂，树脂中的功能性极化基团如酰胺基团与异黄酮分子中的酚羟基形成氢键(而不同于现有技术的吸附依靠分子间的范德华力)，达到特异性吸附的目的，因而在清洗时能把许多杂质洗去，使解吸液中的杂质含量降低至最少，大大提高了解吸液经干燥后产品中异黄酮的纯度，体现在检测结果中就是杂峰很少，主要是D、De、G、Ge四个异构体的峰，并且从谱图分析可得出，其它异构体忽略不计，仅四种主要异构体D、De、G、Ge的总量已超过50％。
综上所述，本发明成功地筛选和使用了特效极性大孔吸附树脂从大豆及大豆产品中分离纯化异黄酮，同时通过提取、分离、浓缩、澄清各工艺环节中最佳条件的确定，成功实现大豆异黄酮的一步吸附解吸纯化，制备出以主要成分计算的纯度高达50％的大豆异黄酮产品，通常产品的得率大于0.4％(因原料中异黄酮含量的多少而异)，即1公斤大豆原料可生产4克以上，纯度大于50％的大豆异黄酮产品，做到了提高原料利用率，降低生产成本，并且工艺简单，易于控制，产品质量稳定，有效成分含量高，为工业化生产提供可能，所以本发明的实施对利用大豆异黄酮，开发系列抗肿瘤新药和保健食品的发展将起到巨大的推动作用，对推动大豆行动计划，促进大豆综合利用起到积极作用，为大豆的深加工开辟了新的领域。
图1是本发明制备方法的工艺流程示意图。
图2是实施例1从豆粕中分离制备出异黄酮产品的HPLC峰图。
图3是D、De、G、Ge四种异构体标准样品的HPLC峰图。
图4是实施例1制备出的异黄酮产品样品与标样叠加试验的HPLC峰图。
图5是实施例3从豆胚分离制备出异黄酮产品的HPLC峰图。
图6是采用未经本发明吸附柱分离的产品作出的HPLC峰图。
下面通过实施例进一步详细说明本发明，但不应对本发明的实施范围构成任何限制。
实施例1取1kg脱脂豆粕，加入12kg 70％甲醇，在78℃水浴中回流萃取2小时，离心分离(3800rpm×10min)，取上清液在旋转蒸发仪中蒸发回收甲醇，使溶液浓缩成近似膏状，用去离子水稀释至其中固形物含量约15-20％，搅拌同时加入1％明胶溶液作为絮凝剂，使絮凝剂的最终浓度为400ppm，然后静置2～3小时，使其澄清。取上清液加入工业乙醇配成含10％乙醇的水溶液，上柱，上柱速度控制为每小时2倍柱体积，所用吸附柱内装填聚苯乙烯交联成的大孔吸附树脂ADS-5(极性树脂，南开大学生产)。然后先用去离子水清洗柱，再用60％乙醇溶液解吸，解吸速度为2.5倍柱体积/小时，收集解吸液在旋转蒸发仪上蒸发掉乙醇及部分水分，最后采用真空浓缩进行干燥，粉碎，得大豆异黄酮原粉4.23g，定量测定出其纯度为51％。
为对上述产品的的组成和纯度作出确定，首先用这四种异构体的标样和上述产品样品分别作出HPLC峰图，见图2和图3，其中De和Ge采用美国Sigma公司提供的试剂级标样，D和G采用日本国际农业研究中心提供的试剂级标样。然后再将该标样与本实施例制备的产品样品同时进样，即进行叠加试验，结果见图4的峰图。
测定方法依次将样品的甲醇萃取液经0.45μm微滤后，各取一定量溶液注入反相化学键合柱，经过与标样比较，根据标样的保留时间定性，根据标样的峰面积定量。该定量检测方法可参见发明人的研究报告(发表在《食品与发酵工业》，2000年第五期，P7)。
主要仪器高压液相色谱仪(日本岛津LC-6A)紫外检测器SPD-6AV中心控制器SLC-6A色谱柱箱CTO-6A数据处理装置C-R3A超纯水器Milli-Q50
色谱条件色谱柱Shim-pack clc-ods碳18柱0.15m×6.0mmΦ流动相甲醇∶5％乙酸＝30∶70流速1.0ml/min(8.5分钟前)；1.5ml/min(8.5分钟后)波长254nm检测灵敏度0.08AUFS柱温50℃进样量10μl纸速0.2cm/min比较各峰图，可以看到，图3与图2中各有四个出峰时间基本相同的峰，而从图4看到，这四个主峰完全叠加在一起，由此证明本发明产品中的异黄酮应该是由这四种主要成分组成，经计算其含量为51％。
实施例2取1kg整大豆，粉碎，过40目筛后用正己烷脱脂(可以使用索氏提取器)。用11kg 75％甲醇溶液在75℃的水浴中回流萃取3小时，然后用减压抽滤法过滤，除去滤渣，将滤液在旋转蒸发仪中浓缩至膏状，并同时回收甲醇。将浓缩液稀释至其中固形物含量约15-20％，然后边搅拌边加入2％明胶溶液至明胶的浓度为400ppm，静置2小时使其絮凝澄清，取上清液加入工业乙醇配成5％的醇溶液，上柱，上柱速度控制为每小时1倍柱体积，柱中装ADS-17大孔吸附树脂(极性树脂，南开大学生产)。用去离子水清洗后，用75％乙醇溶液解吸，解吸速度为2倍柱体积/小时，将收集的解吸液浓缩成浓浆状，同时回收乙醇，然后将浓缩液干燥，粉碎，得到3.81g异黄酮原粉，检测方法同实施例1，产品纯度为52％。
实施例3取1kg豆胚，粉碎，过40目筛，用正己烷脱脂，然后用12kg 78％的甲醇溶液在75℃的水浴中回流萃取4小时，将提取液离心分离，取上清液在旋转蒸发仪中减压浓缩，回收甲醇，取浓缩液用去离子水稀释至固形物含量约20％，加入1％甲壳素溶液，加入量为其在浓缩液中浓度达到300ppm，边加边搅拌，使其中的蛋白质等杂质絮凝沉淀，静置3小时后取上清液上柱，上柱速度控制为每小时2倍柱体积，柱内装极性大孔吸附树脂ADS-7(南开大学生产)，用去离子水洗去糖等杂质，然后用80％乙醇溶液解吸，解吸速度为1倍柱体积/小时，收集解吸溶液浓缩干燥后得到异黄酮原粉20.01克，产品色谱图见图5，检测方法同实施例1，D、De、G、Ge总纯度为50.5％。
实施例4取1kg脱脂豆粕，用14kg 65％的甲醇溶液在75℃水浴中回流萃取5小时，萃取液抽滤分离除去残渣，取上清液在旋转蒸发仪中减压浓缩，回收甲醇，取浓缩液稀释后，向溶液中加入2％JA澄清剂，轻轻搅拌，静置2小时后，取上清液上柱，柱内装大孔吸附树脂ADS-7(极性树脂，南开大学生产)，上柱速度控制为每小时2倍柱体积，然后用纯水洗去糖类等杂质，用70％乙醇解吸，解吸速度每小时1.5倍柱体积，收集解吸液，浓缩干燥后得到4.01g经检测纯度为48.5％的大豆异黄酮原粉(检测方法同实施例1)。
实施例5取1kg脱脂豆粕，用12kg 75％的甲醇溶液在75℃的水浴中回流萃取3小时，萃取液离心分离(3800r.p.m×10min)，取上清液用旋转蒸发仪减压浓缩，然后加水稀释成固形物含量20％，加入2％甲壳素溶液作为絮凝剂，按实施例4的叙述完成后面过程，得4.0g纯度为49.95％的大豆异黄酮原粉(检测方法同实施例1)。
实施例6取1kg大豆，粉碎，过40目筛，用正己烷脱脂后，用13kg 65％的甲醇溶液在75℃水浴中回流萃取4小时，离心分离(3800r.p.m×10min)，取上清液用旋转蒸发仪减压浓缩至膏状，同时回收甲醇。浓缩液加水稀释成固形物含量20％后，用2％的JA澄清剂絮凝澄清，取上清夜加入乙醇配成10％乙醇溶液上柱，上柱速度为每小时3倍柱体积，柱内装有大孔吸附树脂ADS-5(极性树脂，南开大学生产)，用去离子水清洗后，加65％乙醇溶液解吸，收集解吸液浓缩干燥后得3.5g纯度为50.5％的大豆异黄酮原粉(检测方法同实例1)。
权利要求
1.大豆异黄酮制品，其基本上由黄豆苷、黄豆苷原、染料木素和染料木因组成，以这四种异构体成分总量计的纯度为50％以上。
2.大豆异黄酮的制备方法，以大豆的脱脂产物为原料，该制备方法包括用甲醇溶液提取原料制成提取液、使用絮凝剂对该提取液进行絮凝澄清及用极性大孔吸附树脂分离纯化该澄清后的提取液。
3.权利要求2所述的制备方法，其包括以下过程(1)用浓度为65～78％的甲醇溶液提取原料制成提取液，提取温度70～78℃，提取时间2-5小时，然后浓缩提取液并回收甲醇；(2)上述提取液稀释成总固形物含量≤20％的溶液后加入絮凝剂，絮凝澄清；(3)澄清液加到装填有极性大孔吸附树脂的吸附柱中；(4)以60～80％乙醇溶液解吸。
4.权利要求3所述的制备方法，其中，所用絮凝剂包括明胶、甲壳素、氨基化甲壳素。
5.权利要求3或4所述的制备方法，絮凝澄清时，絮凝剂配成1～2％的溶液加入，使该絮凝剂在提取液中的浓度为200～400ppm。
6.权利要求2或3所述的制备方法，其中，所述极性大孔吸附树脂是聚苯乙烯与功能极化基团交联的树脂。
7.权利要求6所述的制备方法，其中，该极性大孔吸附树脂是聚苯乙烯与酰胺基团交联的树脂。
8.权利要求3所述的制备方法，其中，上柱和解吸的速度为1-3倍柱体积/小时。
9.权利要求2-8中任一项所述的制备方法，其中，所用原料为脱脂豆粕。
10.权利要求2-8中任一项所述的制备方法，以大豆或豆胚为原料，先用常规方法脱脂。
全文摘要
本发明涉及一种基本上由黄豆苷、黄豆苷原、染料木素和染料木因组成的大豆异黄酮产品及从大豆或大豆产品中分离制备这种异黄酮产品的方法,本发明产品中基于上述四种主要成分的纯度为50%以上,其制备方法包括用甲醇溶液提取原料制成提取液、使用絮凝剂对该提取液进行絮凝澄清及用极性大孔吸附树脂纯化处理该澄清后的提取液,该方法具有生产成本降低,工艺简单,产品有效成分含量高,质量稳定的优点,为工业化生产提供了可能。
文档编号C07D311/36GK1349987SQ0013000
公开日2002年5月22日 申请日期2000年10月20日 优先权日2000年10月20日
发明者孙梅君, 史长颖, 骆炼, 钱英燕 申请人:中国食品发酵工业研究所