专利名称：无限增殖的前成骨细胞及其生产方法
技术领域：
本发明涉及新的、来自骨的骨膜层的无限增殖化前成骨细胞系，其具有分化成成骨细胞的能力。具体地说，本发明是在试验中利用这样的细胞系检测控制由骨膜衍生的前成骨细胞向成骨细胞分化的物质，以及检测能够改善骨形成、保持骨质、进行骨修复和防止引起骨质疏松症的物质。
在骨组织中、通过分别由成骨细胞和破骨细胞在细胞水平控制的循环加工过程，使骨不断地被破坏、再吸收和从头产生。成骨细胞主要参与骨形成过程，而骨物质的破坏和再吸收的过程似乎是由破骨细胞调节的。
骨包含两个主要的区域，内部区域称作＂骨松质＂，外部区域称作＂皮质＂。所述的外部区域中藏有Havers通道和骨膜。所述的骨膜，即所谓骨的外壳通过用于关节的proviso覆盖着骨的环状面。所述的骨膜主要是为骨提供包容物，以保证腱的附着和为大多数神经提供庇护。最近发现该骨膜还可能参与骨的生长，并进一步参与个体再生过程，如骨折后的修复。
骨膜本身也包含两个主要的区域，外部的区域称作＂纤维层＂，其主要包含连接组织，＂Kambium＂或＂成骨层＂与骨本身接近，其包含许多非分化的细胞，如前成骨细胞。目前推测，这些前成骨细胞或其衍生的细胞似乎参与骨折修复和/或其他的重构过程。但这些前成骨细胞似乎不同于在＂骨松质＂中发现的前成骨细胞，这是因为上述的细胞缺乏分化成脂肪细胞的能力，并且据推测其不支持破骨细胞分化。
随着年龄的增长，个体倾向于逐渐损失骨质，这包括皮质中Havers通道加宽以及骨松质质量减轻。这一现象主要是由于在细胞水平上，破骨细胞的骨吸收超过了成骨细胞的骨形成，这一情况称作解偶联。一旦所述的解偶联持续较长的时间，就会有越来越多的骨物质自毁/再吸收，最终导致称作骨质疏松症的疾病。骨质疏松症引起骨痛并使骨易碎，最终导致在该处发生骨折，并引起腰背痛。
过去，已有多种疗法用于治疗骨质疏松症，包括增加钙的摄取，光照运动，晒太阳，或施用提高存在于＂骨松质＂中的成骨细胞活性的化合物。在这方面US 5,002,968公开了一种用于使成骨细胞增殖的有机锗化合物，其激活成骨细胞增殖，由此刺激骨形成并平衡破骨细胞的胜过活性。另外，在EP 0 725 080中公开了一种新的蛋白质，基本成骨细胞生长因素II(bOGF-II)，其可刺激成骨细胞生长。
然而，最近发现成骨细胞不仅仅在骨化过程中起作用，而且似乎在与破骨细胞的分化和活化密切相关的骨重组现象中起控制中心的作用，该细胞介导骨分解作用。鉴于此，单纯活化现存的成骨细胞以促进和保持骨质是否有效颇值得怀疑。
同时，已发现在内部骨损失的同时，骨被添加到骨膜表面，但比生长期间慢得多，其表明这一过程不同于由骨分解作用产生的骨不稳定。
由此使人们有兴趣评价和研究存在于骨膜中的成骨细胞及其对骨修复和骨形成的作用，以便提供可影响骨膜中的这一过程的物质。
为了提供这种化合物，就需要阐明影响骨代谢中的细胞的作用的有效工具。
如本领域所知，进行此种试验的最好的工具就是所述过程中所涉及的细胞。然而，直接由供体获得的细胞，即所谓的原代细胞仅有非常有限的增殖寿命，这使其在体外研究中的使用受到限制。另外，并不是所有类型的细胞都能进行分离培养。特别是对于前体细胞，往往不能分离出使所述实验能够进行的足量的前体细胞。
过去，尽管证明了有些细胞能耐受这种操作，还可利用癌基因，如猴病毒40大T抗原(SV40 T抗原)感染原代细胞培养物中的细胞使某些细胞，如肠或角膜细胞的增殖得以延续。已知所述的SV40大T抗原能有效地灭活在细胞周期进程中起关键作用的蛋白，特别是p53和成视网膜细胞瘤蛋白(pRb)。但是，尽管这种癌基因在人原代细胞中的过表达可在有限的细胞分裂数量中延续所述细胞的增殖，但所述细胞最终在被称作＂临界＂的阶段停止分裂。在这一阶段中，正常情况下出现在第10代到20代，仍保持活力的细胞处于称作“衰老”的状态或简单死亡。在极少的情况下，一些细胞可逃过这一阶段重新开始增殖。据认为这种开始从头增殖的能力是由于在这些细胞中发生的外来事件所产生的基因组重组造成的。但是，这些重要的基因组修饰通常导致所述的细胞丧失其所源于的原代细胞的最初的特性。
因此，本发明所基于的问题在于提供一种工具，用于进一步确定影响骨形成的物质及其对骨新陈代谢的多种效果。
这些问题已通过提供新的来源于骨的骨膜层且具有分化成成骨细胞的无限增殖化前成骨细胞系得以解决。
在导致本发明的实验中，发明人用含有编码SV40大T抗原DNA序列的构建体转染由健康的成年人骨膜获得的原代成骨细胞前体细胞。通过碱性磷酸酶活性，特异标记，如成骨细胞特异性因子-1(OSF 1或Cbfa-1)，骨桥蛋白和骨钙蛋白，以及形成矿化节结的能力确定，这样获得的细胞(称作hPOB细胞)与和原代成骨细胞基本一致的表型的细胞一样，能分化成成骨细胞。然而，可以预见，那些细胞仅有有限延续的寿命，然后即进入临界使细胞周期停滞在G1阶段。
用带有端粒酶反转录酶基因的构建体转染这些细胞(Bodnar，A.G.，et al.，Extension of life-span by introduction oftelomerase into normal human cells.Science，1998.279(5349)p.349-52)。在进一步传代称作hPOB-tert的转染细胞时，发现它们不进入临界，而是继续增殖。因此，用带有端粒酶基因的构建体转染前无限增殖细胞可获得真正的无限增殖化细胞系，在其中没有发生基因组重组。由于所述的细胞基本上没有改变其基因组结构，基因的转录和表达基本上与原代培养物细胞相一致。
本发明的细胞系能能在培养物中培养至少60，优选80，甚至更优选至少100代。具体地说，本发明的细胞系是真正无限增殖的，并在需要时可进行离体培养。它们可从任意来源，特别是从哺乳动物例如，人制备，由此获得来自骨膜层的前成骨细胞。在优选的实施方案中，所述的细胞系是依照布达佩斯条约于2000年10月25日保藏在巴斯德研究所的细胞系，其登记号为CNCM I-2573。
另外，令人惊讶的是其基本上保持了原代培养细胞的表型，具体说来，由骨膜衍生的本发明的细胞能分化成成骨细胞，所述细胞负责这一区域的骨质形成。这一特征与研究骨形成和骨修复演变非常相关。
与衍生该细胞原代细胞培养物中的细胞相比，本发明的前成骨细胞细胞系也表现出基本上同一的表型。具体说来，它们表现出碱性磷酸酶活性，表达特异标记，例如成骨细胞特异性因子-1(OSF-1或Cbfa-1)、骨桥蛋白和骨钙蛋白等等，和形成矿化节结的能力，其与在原代培养的细胞中发现的基本上没有差异。
利用下述分化的试剂，例如地塞米松和维生素D3的混合物刺激本发明的前成骨细胞细胞系，使其分化成成骨细胞，所得的成骨细胞也显示出与直接从供体获的成骨细胞基本相同的分化标记。在这方面已表明通过诱导分化，与衍生所述细胞的细胞相比，来自本发明细胞系的成骨细胞的碱性磷酸酶的水平、特异标记，如成骨细胞特异性因子-1(OSF-1或Cbfa-1)，骨桥蛋白和骨钙蛋白，以及形成矿化节结的能力基本上没有变化。
总之，与衍生所述细胞的原代培养细胞相比，本发明的细胞系表现出基本上同一的形态学模式，并能够分化成成骨细胞。因此，可以断定由于前无限增殖化和端粒酶表达的结合应用，所述细胞的基因组组成得以维持。
本发明的细胞系可按照下述方法获得，该方法包括下述步骤(a)从适当的来源中分离前成骨细胞，(b)用带有解偶联(uncoupling)正常细胞周期的基因的构建体转染该细胞(c)选择性地从培养物中分离转染细胞，(d)用使得端粒酶反转录酶基因表达的构建体转染由步骤(b)或(c)获得的细胞；和(e)筛选步骤(d)的细胞以获得其中整合了两个基因的细胞。
在第一步骤(步骤(a))中从个体的骨膜中分离前成骨细胞。将这些细胞转移到培养物中，然后用带有一种或多种能解偶联正常细胞周期的基因的构建体转染，由此延长原代细胞的寿命，所述的基因，如那些其产物能结合或灭活p53蛋白产物和成视网膜细胞瘤基因的基因。这可通过用重组载体稳定转染细胞来实现，所述的载体如，重组质粒，或其末端的DNA序列与细胞基因组内源DNA序列同源的线性DNA片段。这一技术允许含有所述构建体的线性DNA整合到宿主的染色体中，同时有利于其转染祖细胞。另外，也可以用重组病毒，如带有SV40病毒(猿猴病毒)大T抗原基因或HPV病毒(人乳头状瘤病毒)E6/E7基因的病毒感染所述的细胞。
从经过上述处理的细胞中筛选带有所述构建体的细胞，这可通过对细胞培养物进行几次传代培养来进行。在其中已引入了所述构建体的细胞，将表现出寿命延长并继续在培养物中增殖，而非感染细胞则停止生长。另外，也可在构建体中包含选择标记，根据所述标记的存在来筛选被转染的细胞。
经选择的细胞再用一种构建体感染，在这一构建体中所包含的端粒酶基因可以表达。这可通过与上述相同的方法实现，即利用重组体载体，依赖于同源重组现象的线性DNA片段或通过重组的反转录病毒感染所述细胞，上述的各种DNA片段中均带有所述的端粒酶基因。除编码端粒酶的基因外，所述构建体中还包含控制基因转录的调节序列，所述基因与所述的调节序列可操作地连接。作为这样一种调节序列，可设想使用控制邻近DNA序列转录的启动子序列。
从所获得的细胞中筛选包含通过前述的方法步骤引入的两种基因的无限增殖化细胞，例如，可通过稀释所述的细胞评估在不同的细胞培养物中是否出现了临界。此外，也可以通过分析细胞自身的基因组物质来判断其中是否存在不同的构建体，即从所述细胞中分离DNA确定是否存在被引入的基因，这可通过如，PCR技术等实现。
因此，依照本发明的一个优选实施方案涉及用这样的细胞系进行实验寻找可用于影响从前成骨细胞到成骨细胞的衍化的物质。在更多的优选实施方案中，本发明的细胞系用于寻找直接指导由前成骨细胞向成骨细胞分化的物质的实验中。这在下述的情况下特别有用，即当个体的骨中需要更多的成骨细胞存在以改善自身的骨形成或辅助骨质形成或骨修复的情况。另外，由于前成骨细胞和分别地存在于骨膜中参与骨结构化事件，例如，在内层的骨质分解的过程中，在该骨的外围同时有潜在的骨形成，本发明的细胞系还非常适合于寻找能通过在骨膜中特异地活化骨形成从而延长乃至防止骨质疏松症发作的物质。
在附图中，
图1显示用直接针对人SV40T抗原的单克隆抗体对hPOB细胞进行免疫染色；用特异于人SV40T抗原的一级抗体通过免疫荧光法对融合细胞进行染色；图2显示在hPOB和hPOB-tert细胞中的端粒酶活性；道1是在对照条件下的端粒酶活性，即没有细胞存在的条件下；道2和道3在两不同代数的hPOB细胞中的端粒酶活性；道4到10是在不同代数的hPOB-tert细胞中的端粒酶活性。
图3显示在hPOB和hPOB tert细胞分化期间碱性磷酸酶活性的调节作用；在融合前(第1天)，和在融合到hPOB细胞(A)和hPOB-tert细胞(B)后的第2、4、6和第9天，无效应物存在下(○)、在10nM地塞米松(DELTA)、10nM维生素D(●)存在下，或两效应物均存在下(■)分别测定碱性磷酸酶活性。所示数据为至少三次实验的平均±标准误差(SEM)。不同于未处理的细胞统计数值用*(p＜0.05)；**(p＜0.01)表示。
图4显示在hPOB和hPOB tert细胞中Cbfa-1表达的调节；从无效应物存在、或有10nM地塞米松、或10nM维生素D，或两效应物均存在的条件下培养了6天的hPOB(A)和hPOB-tert细胞(B)制备RNA。并行地通过半定量RT-PCR分析Cbfa-1和肌动蛋白RNA表达。对获得的信号进行定量，以肌动蛋白作为内在的标准。所示数据为至少三次实验的平均±标准误差(SEM)。不同于未处理细胞的统计数值用*(p＜0.05)表示。
图5显示在hPOB和hPOB-tert细胞中骨粘连蛋白表达的调节；从无效应物存在、或有10nM地塞米松、或10nM维生素D，或两效应物均存在的条件下培养了6天的hPOB(A)和hPOB-tert细胞(B)制备RNA。并行地通过半定量RT-PCR分析骨粘连蛋白和肌动蛋白RNA表达。对获得的信号进行定量，以肌动蛋白作为内在的标准。所示数据为至少三次实验的平均±标准误差(SEM)。不同于未处理细胞的统计数值用*(p＜0.05)；**(p＜0.01)表示。
图6显示在hPOB和hPOB-tert细胞中骨钙蛋白表达的调节；从无效应物存在、或有10nM地塞米松、或10nM维生素D，或两效应物均存在的条件下培养了6天的hPOB(A)和hPOB-tert细胞(B)制备RNA。并行地通过半定量RT-PCR分析骨钙蛋白和肌动蛋白RNA表达。对获得的信号进行定量，以肌动蛋白作为内在的标准。所示数据为至少三次实验的平均±标准误差(SEM)。不同于未处理细胞的统计数值用*(p＜0.05)；**(p＜0.01)表示。
图7显示hPOB和hPOB-tert细胞对细胞外基质的矿化；在10nM地塞米松和10nM维生素D存在下培养hPOB(A)和hPOB-tert(B)细胞；在第21天，如材料和方法部分所述，将细胞固定并用Alzarin-红染色。
下述给出的实施例是本着示意性的目的，而非试图对本发明做任何形式的限制。
材料和方法材料细胞培养物质、培养基和胎牛(FBS)血清购自Gibco BRL(Basel；Switzerland)。Alizarin Red S和维生素D3、1α，25-二羟基(1α，25-dihydroxy)分别购自Sigma(Buchs；Switzerland)和Calbiochem(Lucerne；Switzerland)。抗坏血酸和β-甘油磷酸盐购自Merk(Switzerland)。
实施例1逆转录病毒载体的制备和扩增以标准重组DNA技术，通过插入带有组氨醇基因作为选择标记的pLHXSD反转录病毒载体(Stockschlaeder等Hum Gene Ther.2(1991)，33-39)的BamHI位点，构建带有猿猴病毒(SV40-T抗原)大T抗原基因、或人端粒酶反转录酶(hTERT；有由CAMBIA，Canberra，Autralia提供)的重组反转录病毒载体。
感染重组病毒颗粒是通过下述方式产生的，即将重组反转录病毒载体转染到兼性包装细胞系Phoenix(Clontech)中，然后与由ATCC获得的亲嗜性包装细胞系、Psi2共培养进行“乒乓”感染以产生高滴度的病毒(Lynch C，Miller D.1991).将带有不同宿主范围外壳的包装细胞混合培养以产生高辅助病毒-游离逆转录病毒载体(J.Virol.653887-3890)。
实施例2制备和感染人成骨细胞前体通过下述方式制备来自13岁的女性患者股骨骨膜的细胞，在添加了10％FBS的Opti MEM(Gibco BRL；Basel；Switzerland)中，在95％空气/5％CO2、37℃下将preriosteal组织碎片培养物培养3星期。在融合中使细胞胰蛋白酶化并将其置于25cm2烧瓶中。在70-80％融合度，在20μg/ml DEAE右旋糖酐存在下使所述细胞在37℃(90％湿度)条件下与如实施例1所述制备的含SV40T抗原重组病毒共同温育3小时。感染后，用添加了10％FBS和青霉素/链霉抗生物素蛋白的α-MEM替换所述的培养基。3到4代后非感染的原代细胞停止生长，而来自感染库的细胞继续生长直到第12-15代。将这些表达SV40T抗原的细胞命名为hPOB。
如上所述，在第9代hPOB细胞被带有hTERT基因的重组病毒感染。这些细胞称作hPOBtert。
实施例3hPOBtert的培养和分化在添加有10％FCS和青霉素/链霉抗生物素蛋白的αMEM中培养经感染的细胞。这一培养基称作基础培养基。为进行分化，将细胞以12000细胞/cm2的密度接种到胶原I(30μg/ml；牛皮-I型胶原；RocheBiomedical；Basel；Switzerland)包被的平皿的基础培养基中。在添加了1mMβ-甘油磷酸盐和添加了10nM地塞米松或10nM维生素D3(vitD)的50μg/ml抗坏血酸的基础培养基中将融合细胞培养2到21天。
在感染细胞培养的第0天和在不同的分化条件下融合21天后追踪矿化基质的形成。在用冰冷的70％乙醇共同温育固定细胞1小时后，用Alzarin红色-S比色反应对矿化基质进行染色。
实施例4碱性磷酸酶活性测定在第0，2，4，6和9天收获在不同分化条件下培养的hPOBtert细胞，在含10mM Tris(pH7.5)，0.5mM MgCl2和0.1％100X Triton的裂解缓冲液中融合和匀浆。用可商购的试剂盒(Sigma)测定细胞匀浆的碱性磷酸酶(ALP)活性，将所得的结果校正为如Bradford测定法所测定的总蛋白含量。
实施例5SV40-T抗原蛋白质在hPOB细胞中的免疫检测hPOB细胞以90％融合度在八-孔小室载玻片上用Hanks盐缓冲液(HBSS)浸湿在至少-20℃下与冰冷的甲醇/丙酮混合物(v/v)一起固定30min。固定的细胞在室温下与直接针对SV40-T抗原(1/30稀释)的小鼠单克隆抗体一起，在添加了1％牛血清白蛋白(BSA)且含有0.05 M Tris pH8.6，1.8％NaCl和0.2％聚乙二醇的缓冲液(TNP缓冲液)中温育1小时。用TNP缓冲液洗涤3次后，所述细胞在室温下、黑暗中与添加了1％BSA的TNP缓冲液和荧光素-结合的抗鼠IgG抗体(1/250稀释)一起温育1小时。用荧光显微镜(Zeiss)观察细胞核。
实施例6RNA的制备和RT-PCR表达分析融合后第6天，在分化条件下培养的细胞用HBSS洗，然后贮存于-80℃，直至用RNeasy总RNA纯化系统(Qiagen AG，Basle，Switzerland)抽提RNA。
加入10μg总RNA，用RT-PCR(AMV；Roche Biomedical，Basle，CH)第一链cDNA合成试剂盒，oligod(T)15作为引物进行反转录。用Mycrosynth(Windisch，CH)合成用于扩增有用的cDNA的引物。
正向和反向引物分别是5’-GTTGCTATCCAGGCTGTG-3’和5’-CATAGTCCGCCTAGAAAGC-3’用于肌动蛋白基因5’-ATGAGAGCCCTCACACTCCT-3’和5’-GATGTGGTCAGCCAACTCGT-3’用于骨钙蛋白基因5’-AGAGGTGGTGGAAGAAACTG-3’和5’-GCTTCTGCTTCTCAGTCAGA-3’用于骨粘连蛋白5’-CAGTGATTTAGGGCGCATTC-3’和5’-GAAATGCGCCTAGGCACATC-3’用于Cbfa-1基因。
所述的PCR反应的头两个循环为98℃1min，60℃min和72℃2min，然后是按下述条件的28个循环94℃2下变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，以上反应在DNA热循环仪(Bioconcept，Allschwill，Switzerland)中进行。反应中的肌动蛋白引物作为内部对照。在2％琼脂糖凝胶上分离PCR产物(10μl)，用溴化乙锭染色观察结果。用密度计NIH图像程序量化PCR产物。
实施例7TRAP试验如前所述用细胞抽提物进行端粒酶重复扩增方案(TRAP)试验(Kimet al.，Science 266(1994)，2011-2015)。将106个细胞在200μl裂解缓冲液(10mM tris-HCl，pH7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.5％CHAPS，10％甘油)中裂解。将所述的细胞裂解物在4℃下14000rpm离心20min。收集上清液，用Bradford蛋白质试验(Biorad)确定蛋白的数量。将相当于50μg蛋白质的2μl细胞裂解物添加到48μl反应混合物中，该混合物含有下述成分5μlTRAP缓冲液10X(200mMtris-HCl，pH8.3，15mM MgCl2，10mM EGTA，680mm KCl，0.5％Tween)，0.25μl 10mM dNTPs，1.8μl 50ng/μl引物M2，1.8μl50ng/μl引物CX和0.4μl 5U/μl taq聚合酶。引物序列为5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’对于引物M2，和5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’用于引物CX在PCR反应开始前，端粒酶反应在室温下进行30min，所述的PCR反应为94℃ 2min进行1个循环，然后依下述条件进行30个循环，即在94℃变性10sec，50℃退火25sec和72℃延伸30sec，此后再进行一个附加的循环94℃变性15sec，50℃退火25sec，72℃延伸1min，上述PCR反应均是在DNA热循环仪中进行的。在10％丙烯酰胺凝胶中分离20μl PCR产物，然后通过SYBR绿色I凝胶染色(Molecular Probes)观察结果。
实施例8核型分析半融合的培养物送到密歇根儿童医院的细胞培养实验室进行核型的分析。为进行染色体研究，将指数生长的培养物用0.04μg/ml的乙酰甲基秋水仙碱处理1-2小时，胰蛋白酶化并用0.0375M KCl处理9min，再用3∶1甲醇∶冰醋酸混合物固定。所述的悬浮液用定影液离心洗涤两次，最后如前所述滴到冷的湿玻片上(Peterson，W.D.Jr.etal，Methods in Enzymology 58；164-178，1979)。将玻片空气干燥再用4％ giemsa溶液染色。Giemsa染色后的玻片用于倍性分配、和计数和组成型畸变研究。对于胰蛋白酶化的Giemsa带(GTG)，用改进的Seabright方法制备核型(Seabright，M.A，Lancet；971-972，1971)(2).将所述的玻片在载物片加温器上于60℃下老化16-20小时，浸没于0.025％胰蛋白酶中1-2sec，用Giemsa溶液染色11min，在缓冲液中清洗、干燥后插在permount中。用AKSII图象分析系统对结合好的中期片进行核型分析。
由这些印片制备7核型最低值并按照标准人核型编排。按照标准命名描述所述的核型(ISCN An international System for HumanCytogenetic Nomenclature，Mitelman F.(ed.)BasleKarger，1995)。
更为详细地研究了两个染色体标记。显示出与hPOB细胞突出相关的染色体11和15，现在显示出在hPOB-tert细胞中已建立的标记。其同工酶表型模式与h-POB细胞一致。这些发现确定了hPOB-tert细胞确实是由hPOB细胞衍生而来。在培养物中没有检测到除hPOB-tert(第39代)细胞系之外的细胞。
序列表<110>雀巢制品公司<120>无限增殖化的前成骨细胞<130>80281<140><141><160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>18<212>DNA<21>人<400>1gttgctatcc aggctgtg 18<210>2<211>19<212>DNA<213>人<400>2catagtccgc ctagaaagc 19<210>3<211>20<212>DNA<213>人<400>3atgagagccc tcacactcct 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人<400>4gatgtggtca gccaactcgt 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人<400>5agaggtggtg gaagaaactg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人<400>6gcttctgctt ctcagtcaga 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人<400>7cagtgattta gggcgcattc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人<400>8gaaatgcgcc taggcacatc 20
权利要求
1.一种由骨膜(peritoneum of the bone)衍生的无限增殖化前成骨细胞细胞系，其表达至少一种基因，解偶联正常细胞周期，包含能使端粒酶基因表达的构建体，并能分化为成骨细胞。
2.如权利要求1所述的无限增殖化细胞系，其具有碱性磷酸酶活性，使成骨细胞特异因子-1(OSF-1或Cbfa-1)、骨桥蛋白和骨钙蛋白表达，并具有与其所衍生自的原代培养物的前-成骨细胞基本一致的形成矿化节结的能力。
3.如权利要求1或2所述的无限增殖化细胞系，其中，所述的解偶联正常细胞循环的构建体和可使端粒酶基因表达的构建体包含于染色体上。
4.如前述任意一项权利要求所述的无限增殖化细胞系，该细胞系来源于人。
5.如权利要求4所述的无限增殖化细胞系，该细胞系是CNCM I-2573。
6.一种制备无限增殖化细胞系的方法，该方法包括下述步骤(a)从骨膜中分离前成骨细胞，(b)向所述细胞中引入带有某种基因的构建体，所述的基因的产物解偶联正常细胞周期，(c)选择性地从培养物中分离转染细胞，(d)用指导端粒酶基因表达的构建体转染由步骤(b)或(c)获得的细胞；和(e)筛选步骤(d)的细胞以获得其中整合了两种构建体的细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中，至少一个构建体在载体上。
8.如权利要求6所述的方法，其中，用于步骤(b)和(d)的至少一个构建体整合到细胞的染色体中。
9.如权利要求6-8中任意一项所述的方法，其中，所述的影响解偶联正常细胞周期的构建体包含编码SV40大T抗原的基因。
10.权利要求1到5中任意一项所述的细胞系在检测控制由前成骨细胞向成骨细胞的分化的物质的分析中的用途。
11.权利要求1到5中任意一项所述的细胞系在检测能改善骨形成、保持骨质、骨修复和防止引起骨质疏松症的物质的分析中的用途。
全文摘要
本发明涉及新的骨膜衍生的无限增殖化前成骨细胞细胞系，其能够分化为成骨细胞。具体地说，本发明是在试验中利用这样的细胞系检测由骨膜衍生的控制前成骨细胞向成骨细胞分化的物质，以及检测能够改善骨形成、保持骨质、进行骨修复和防止发生骨质疏松症的物质。
文档编号C07K14/47GK1471576SQ01818136
公开日2004年1月28日 申请日期2001年10月26日 优先权日2000年10月27日
发明者E·奥福德卡文, C·德里蒙特-尼科劳, C·梅斯, E 奥福德卡文, 锩商 尼科劳 申请人:雀巢制品公司