一种ngr-peg-qd纳米材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药领域，特别涉及一种NGR-PEG-QD纳米材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]胶质瘤是中枢神经系统中最为常见的原发性恶性肿瘤，其发病率约为7.2/100, OOOo目前手术切除是治疗该疾病最有效的方法，但由于肿瘤全切困难，残留的肿瘤细胞无限增殖并导致胶质瘤复发，因此患者预后差，术后平均生存期通常少于14个月。因此对肿瘤细胞进行术前显影并在手术中实时显示出肿瘤轮廓以便尽可能有效全切胶质瘤将有助于避免术后复发，提高患者生存质量。
[0003]众所周知，构成血脑屏障(blood-brain-barrier，BBB)和血瘤屏障(blood-tumor-barrier，BTB)的脑血管内皮细胞与外周组织的血管内皮细胞有很大区别，脑血管内皮细胞有连续的紧密连接、不存在窗孔或孔隙很小，< 50nm(外周肿瘤细胞间隙为380-780nm，最大不超过2 μπι)、缺少胞饮作用等，这一坚固的屏障阻扰了绝大多数药物从血液进入脑组织而发挥其作用。同时，外周血液循环中的物质或药物要进入脑组织，除了需历经较长的体循环，躲避网状内皮细胞识别、吞噬和破坏，更主要的是还需依靠细胞旁路(被动转运)和跨细胞途径(主动转运)两种方式穿越血脑血瘤屏障。因此，一种能顺利通过体循环、跨越血脑屏障的生物材料必须要以纳米级粒径作为前提，才能顺利通过血脑屏障并靶向胶质瘤细胞。
[0004]量子点(Quantum Dot，QD)是一种能自发焚光的纳米晶体，尺寸限制在纳米量级。由于QD具有普通荧光物质无法比拟的光学特性，如荧光强度高，不易碎灭等，将其作为荧光探针用于生物医学分子标记和检测将拥有广阔的临床前景。CdSe/ZnS是构成QD的一种化学元素，它的激发波长范围极广，在350-650nm范围内均能被激发，尤其是在410-500nm范围内可激发出较强的绿光，且荧光可视浓度远小于细胞毒性浓度，因而在细胞或活体成像过程中避免了该物质自身带来的毒性作用。而且将QD进行聚乙二醇(PEG)化后，在很大程度上避免体内巨噬细胞对该物质的吞噬，因此能使QD有效进入长循环并随血流到达相应部位。
[0005]肿瘤的生长依靠周围血管中营养物质的供给，由于肿瘤细胞高代谢和无限增殖的特点，导致营养供应不足，肿瘤细胞处于长期缺氧状态，使之分泌大量血管生长相关因子，从而促进肿瘤微环境中血管内皮细胞活化和新生血管的形成。已有文献报道:肿瘤微环境中由于VEGF和bFGF等血管生长因子的释放以及缺氧将活化RAS信号通路并引起其下游P1-3K和ERK激活导致新生血管内皮细胞膜上⑶13表达显著增高，而在正常静息状态下的血管内皮细胞中⑶13表达阴性。⑶13又名氨基肽酶N，是一种分子量约为150kDa的具有金属蛋白酶活性的跨膜糖蛋白，由967个氨基酸构成，通过近N端的跨膜螺旋区固定在细胞膜上。⑶13基因编码序列定位于染色体15q25_26，基因全长35kb，包含20个外显子，拥有近端和远端两个启动子。目前已有大量证据表明CD13在甲状腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌、等恶性肿瘤中表达显著升高，并有助于肿瘤细胞生长，侵袭，迀移，粘附，耐药和血管形成。综上所述，针对CD13可能对胶质瘤及其肿瘤血管具有双靶向作用。
[0006]NGR多肽由天门冬氨酸-精氨酸-甘氨酸序列构成，是1998年用噬菌体展示技术筛选而得到的对活化的新生血管具有靶向性的短肽，能与活化的血管内皮细胞膜上CD13特异性结合，因此可作为⑶13特异性配体。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种NGR-PEG-QD纳米材料及其制备方法，所述将QD外表包被一层PEG使该纳米材料能在长循环中不被巨噬细胞吞噬而顺利通过血液循环，并将PEG-QD与NGR连接，使其能够与肿瘤血管上的CD13特异性结合，同时利用QD的纳米粒径使其顺利通过BBB或BTB并与胶质瘤细胞膜上的CD13结合，最终依靠量子点自发荧光的特点靶向胶质瘤及其血管荧光成像。以便能够在荧光手术显微镜视野下确定胶质瘤切除程度及残留部分，达到手术过程中尽可能全切肿瘤的目的。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0009]一种NGR-PEG-QD纳米材料，所述纳米材料包括NGR多肽、PEG和QD，所述NGR多肽的氨基酸序列包括天门冬氨酸-精氨酸-甘氨酸，所述PEG吸附在QD表面，形成PEG-QD，所述NGR多肽通过生物素与亲和素的连接作用将NGR多肽与PEG-QD连接，即形成所述的NGR-PEG-QD纳米材料。
[0010]本发明的另一目的是通过以下技术方案实现的:
[0011]所述的NGR-PEG-QD纳米材料的制备方法，包括以下步骤:
[0012]A) PEG-QD 的制备
[0013]将QD和PEG在避光条件下搅拌12?36h混匀，使PEG通过物理吸附作用，吸附在QD表面，并除去未与QD结合的PEG，即得到纯化的PEG-QD ；
[0014]B) NGR-PEG-QD 的制备
[0015]将步骤A)制备得到的PEG-QD与NGR多肽搅拌混匀，所述NGR多肽通过生物素与亲和素的连接作用将NGR多肽与PEG-QD连接，并除去未与PEG-QD连接的NGR，即形成纯化的NGR-PEG-QD纳米材料。
[0016]进一步的，步骤A)中除去未与QD结合的PEG的方法，以及为步骤B)中除去未与PEG-QD连接的NGR的方法，为离心法、透析法，或通过脱盐柱去除多余的NGR，所述脱盐柱为NAP_5Column0
[0017]进一步的，所述制备方法还包括对NGR-PEG-QD的无毒筛选处理，所述处理为MTT法。
[0018]进一步的，所述步骤A)中QD与PEG的混合比例为1: 100。
[0019]进一步的，所述步骤B)中PEG-QD与NGR的混合比例为1:6。
[0020]本发明利用了 NGR的靶向性，其靶向性主要由两个因素产生:1.⑶13基因中有两个不同启动子，即近端启动子和远端启动子，骨髓起源细胞中CD13表达主要源于远端启动子，而上皮细胞中CD13表达主要由近端启动子形成。这两个不同的启动子串联排列，中间间隔8kb，近端启动子紧靠⑶13编码区，而远端启动子在其下游。两者编码产生的⑶13中序列存在明显差异，而NGR仅与近端启动子所编码产生的CD13结合；2.肿瘤细胞中近端启动子出现部分突变，从而转录翻译出的CD13也与正常上皮细胞中CD13在部分序列和空间结构中存在不同，而NGR对近端启动子突变后产生的CD13蛋白亲和力更强。因此将NGR与化疗药物结合后不仅能增加化疗药物结合聚集肿瘤部位杀灭肿瘤细胞的作用，还降低了药物对机体的毒副作用，因此，本发明将靶向性应用在临床肿瘤治疗中。
[0021]本发明相比现有技术的有益效果是:
[0022]1、本发明所述的NGR-PEG-QD为纳米级，能够顺利通过体循环、穿过血脑屏障和血瘤屏障，并通过NGR多肽与胶质瘤细胞膜上的CD13特异性结合，通过依靠量子点自发荧光的特点，靶向胶质瘤及其血管荧光呈现，以便能够在荧光手术显微镜视野下确定胶质瘤切除程度及残留部分，达到手术过冲中尽可能全切除肿瘤的目的；
[0023]2、本发明所述的NGR-PEG-QD经过无毒筛选，对人体无毒副作用，可供手术时放心使用；
[0024]3、本发明所述的NGR-PEG-QD纳米微粒无创、高效、靶向性，使胶质瘤及其肿瘤血管荧光成像研宄，可改善对该疾病的诊断和治疗，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0025]图1为量子点电镜检测不意图；
[0026]图2为纳米材料焚光强度检测不意图；
[0027]图3为NGR-PEG-QD不同波长下的荧光强度检测示意图；
[0028]图4为紧密连接蛋白表达的电泳结果图。
【具体实施方式】
[0029]实施例1
[0030]一种NGR-PEG-QD纳米材料，所述纳米材料包括NGR多肽、PEG和QD，所述NGR多肽的氨基酸序列包括天门冬氨酸-精氨酸-甘氨酸，所述PEG吸附在QD表面，形成PEG-QD，所述NGR多肽通过生物素与亲和素的连接作用将NGR多肽与PEG-QD连接，即形成所述的NGR-PEG-QD纳米材料。
[0031]所述生物素与亲和素的结合具体为:PEG-QD上修饰了 streptavidin，NGR—端上修饰了 b1tin，主要是通过avidin-b1tin之间的结合，这两个东西是自然界自发结合非常强的物质，把它们混在一起就能彼此之间有效结合