，一个链霉亲和素分子能结合4个生物素分子，两者亲和常数(K)为1015mol/L。
[0032]所述的NGR-PEG-QD纳米材料的制备方法，包括以下步骤:
[0033]A) PEG-QD 的制备
[0034]将QD和PEG在避光条件下搅拌12?36h混匀，优选搅拌24h，使PEG通过物理吸附作用，吸附在QD表面，并除去未与QD结合的PEG，即得到纯化的PEG-QD ；
[0035]B) NGR-PEG-QD 的制备
[0036]将步骤A)制备得到的PEG-QD与NGR多肽搅拌混匀，所述NGR多肽通过生物素与亲和素的连接作用将NGR多肽与PEG-QD连接，并除去未与PEG-QD连接的NGR，即形成纯化的NGR-PEG-QD纳米材料。
[0037]进一步的，步骤A)中除去未与QD结合的PEG的方法，以及为步骤B)中除去未与PEG-QD连接的NGR的方法，为离心法或透析法，或通过脱盐柱去除多余的NGR，所述脱盐柱为 NAP-5Column0
[0038]进一步的，所述制备方法还包括对NGR-PEG-QD的无毒筛选处理。
[0039]实施例2
[0040]本实施例是在实施例1基础上的优选方案，具体方案如下:
[0041]本实施例所述的NGR-PEG-QD纳米材料的制备方法，包括以下步骤:
[0042]A)将QD与PEG (混合比例为1: 100)混合搅拌混匀24h，用透析袋滤出多余未与QD结合的PEG，得到纯化的PEG-QD ；
[0043]B)将纯化的PEG-QD与游离肽段NGR(混合比例为1: 6)通过生物素与亲和素之间的连接方式构建NGR-PEG-QD，并再次利用透析袋除去未与PEG-QD结合的NGR，获得纯化的 NGR-PEG-QD。
[0044]上述所有合成过程均在暗处进行，构建完成后使用荧光光谱法，电镜，原子力显微镜和紫外分光光度计等方法验证纳米材料是否有效合成。
[0045]为检测制备得到的NGR-PEG-QD对血脑屏障的穿透效果，构建了 “背靠背”模式的血脑屏障体外模型。
[0046]首先，提取大鼠脑微血管内皮细胞和原代大鼠星形胶质细胞，并分别用Vonffi 11 ebrand Factor (VffF)(血管性血友病因子)和GFAP (神经胶质酸性蛋白)验证其细胞类别和纯度，同时培养大鼠胶质瘤C6细胞株。在细胞插入器的基础上构建接触式BBB体外模型，并通过跨内皮细胞电阻(血流屏障164±13欧.cm2,血脑屏障是247±21欧.cm2)，紧密连接蛋白表达，荧光素钠(血脑屏障是0.032±0.002 (cm/min) χ10_3;血瘤屏障是0.143±0.026 (cm/min) xlCT3)和伊文斯蓝通透性(血脑屏障是0.013±0.003 (cm/min)xl(T3;血瘤屏障是0.058±0.007 (cm/min) xlO 证实BBB构建成功，具体步骤如下:
[0047]A)取4周龄大鼠全脑，去除脑膜和大血管后用II型胶原酶裂解，进行BSA密度离心，沉淀即为脑微血管段。所述脑微血管段经胶原分散酶裂解成血管碎段后进行Percoll离心，收集得到较为纯化的脑微血管段继续培养。在培养过程中添加嘌呤霉素以纯化脑微血管内皮细胞，通过VWF分别采用免疫荧光和流式细胞技术鉴定其细胞类别和纯度。
[0048]B)取大鼠全脑用胶原酶裂解并通过合适滤网后得到大鼠星形胶质细胞，采用GFAP验证；同时培养大鼠胶质瘤C6细胞株。
[0049]C)在1.0um滤孔的细胞插入器中构建接触式BBB体外模型，既保证双层细胞不会混合，又能使星形胶质细胞的突起能与血管内皮细胞结合，有效模拟体内生理结构。并在铺种细胞后加入cAMP和氢化可的松诱导紧密连接迅速形成。
[0050]D)分别采用跨内皮细胞电阻，电镜，荧光素钠和伊文斯蓝通透性等方法验证BBB模型构建成功。
[0051]NGR-PEG-QD生物安全性的检测:
[0052]首先，采用CCK8法检测不同浓度NGR-PEG-QD纳米材料对细胞活力的影响，同时通过酶标仪检测该纳米材料溶血作用，以保证体内外研宄的生物安全性。经过验证，所述NGR-PEG-QD纳米材料在50nmol/L浓度下无毒性。
[0053]尾静脉注入NGR-PEG-QD和PEG-QD，观察该纳米材料在体内对各器官功能的影响。
[0054]NGR-PEG-QD体外荧光成像作用:
[0055]观察NGR-PEG-QD是否能通过血脑/血瘤模型体外模型的内皮细胞层。
[0056]在内室加入无毒剂量，即2nmol/L的NGR-PEG-QD或PEG-QD，采用免疫荧光和流式细胞技术观察该纳米材料对星形胶质细胞，胶质瘤细胞，与星形胶质细胞共培养的血管内皮细胞以及与胶质瘤细胞共培养的血管内皮细胞的荧光成像作用。之后加入游离NGR肽段，观察NGR-PEG-QD所产生的荧光成像作用是否能被NGR抑制，结果证实游离NGR阻止了NGR-PEG-QD与细胞膜表面表达CD13的胶质瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞结合。
[0057]NGR-PEG-QD体内荧光成像的研宄:
[0058]首先，在定位仪辅助下在大鼠颅内种入大鼠胶质瘤C6细胞构建颅内原位肿瘤模型，并用Micro CT和HE染色证实模型构建成功。
[0059]尾静脉注入无毒剂量的NGR-PEG-QD，24h后处死大鼠取肿瘤和对侧正常脑组织冰冻切片，荧光显微镜下观察NGR-PEG-QD对胶质瘤组织荧光成像的作用。此外，取重要器官组织分析个组织器官对该纳米材料的摄取。
【主权项】
1.一种NGR-PEG-QD纳米材料，其特征在于，所述纳米材料包括NGR多肽、PEG和QD，所述NGR多肽的氨基酸序列包括天门冬氨酸-精氨酸-甘氨酸，所述PEG吸附在QD表面，形成PEG-QD，所述NGR多肽通过生物素与亲和素的连接作用将NGR多肽与PEG-QD连接，即形成所述的NGR-PEG-QD纳米材料。
2.—种如权利要求1所述的NGR-PEG-QD纳米材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: A)PEG-QD的制备 将QD和PEG避光条件下搅拌12?36h混匀，使PEG通过物理吸附作用，吸附在QD表面，并除去未与QD结合的PEG，即得到纯化的PEG-QD ； B)NGR-PEG-QD 的制备 将步骤A)制备得到的PEG-QD与NGR多肽搅拌混匀，置于4°C过夜，所述NGR多肽通过生物素与亲和素的连接作用将NGR多肽与PEG-QD连接，并除去未与PEG-QD连接的NGR，即形成纯化的NGR-PEG-QD纳米材料。
3.根据权利要求2所述的NGR-PEG-QD纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤A)和步骤B)均在避光条件下进行。
4.根据权利要求2所述的NGR-PEG-QD纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤A)中除去未与QD结合的PEG的方法，以及为步骤B)中除去未与PEG-QD连接的NGR的方法，为离心法、透析法或通过脱盐柱去除多余的NGR。
5.根据权利要求2所述的NGR-PEG-QD纳米材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对NGR-PEG-QD的无毒筛选处理，所述处理方法具体为MTT法。
6.根据权利要求2所述的NGR-PEG-QD纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤A)中QD与PEG的混合比例为I: 100。
7.根据权利要求2所述的NGR-PEG-QD纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤B)中PEG-QD与NGR的混合比例为1:6。
【专利摘要】本发明提供了一种NGR-PEG-QD纳米材料及其制备方法。所述NGR-PEG-QD为纳米级，能够顺利通过体循环、穿过血脑屏障和血瘤屏障，并通过NGR多肽与胶质瘤和肿瘤血管细胞膜上的CD13特异性结合，通过依靠量子点自发荧光的特点，靶向胶质瘤及其血管荧光呈现，以便能够在荧光手术显微镜视野下确定胶质瘤切除程度及残留部分，达到手术过冲中尽可能全切除肿瘤的目的。所述NGR-PEG-QD纳米微粒无创、高效、靶向性，使胶质瘤及其肿瘤血管荧光成像研究，可改善对该疾病的诊断和治疗，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61P35-00, A61K49-00, A61K48-00
【公开号】CN104784708
【申请号】CN201510164375
【发明人】程远, 黄宁
【申请人】程远, 黄宁
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月9日