专利名称：包含蛋白毒素b亚基的治疗制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗制剂。具体而言，本发明涉及一种包含蛋白毒素B亚基的制剂，其被用于治疗病毒感染，本发明涉及一种含有该B亚基的融合蛋白，本发明还涉及含有该B亚基的组合物在药物生产中的用途，本发明还涉及一种治疗动物体的方法。全球90％的人口在成年初期携带有EB病毒(EBV)，因此使其成为最常见的病毒感染之一。
大多数初期EBV感染无症状或者只表现出亚临床症状。少数病例在临床上表现为传染性单核细胞增多症(腺热)，这是一种自限性、发热的疾病，其特征为全身性出疹、关节痛、淋巴结症以及肝脾肿大。
更有意义的是EBV可能与多种上皮肿瘤和淋巴瘤相关。这些疾病包括鼻咽癌、Burkitt氏淋巴瘤、Hodgkin氏淋巴瘤以及移植后淋巴增生。
EBV能够在体外转化B细胞，形成淋巴海蕾(lymphoblastoid)细胞系(LCLs)。LCL细胞与活化的B细胞很相象，不过，它还表达所有的EBV潜伏基因，表现为III型潜伏模式(latency III pattern)，这些基因编码的是核抗原EBNA1、2、3A、3B、3C和LP、潜在膜蛋白LMP1和2以及2个名为EBER1和2的小核糖核酸。
不过在一些体内被感染的B细胞和大多数EBV相关肿瘤中，表达的病毒潜伏基因的范围在一些情况下仅限于LMP2(潜伏期0)、EBNA1(潜伏期I)，其它一些情况下还表达LMPs和EBERs(潜伏期II)。
在初次感染中，宿主能够产生很强的体液和细胞免疫反应。不过，感染细胞以潜伏期0和I和II的形式存在时能够逃避免疫监视，病毒无法被清除。这样一来，病毒能够终生存储在宿主B细胞中。尽管尚未揭开真正的作用机制，不过，人们认为宿主B细胞的转化和获得永生是EBV致癌的一个关键步骤。
细胞毒T细胞(CTL)对EBV产生的响应对于调控已建立的潜伏感染具有重要意义(1)。实际上，目前的研究集中在产生和增强针对不同潜伏基因产物的CTL细胞方面，这可以提供指向EBV相关肿瘤的免疫治疗的基础。
CTL对EBV的响应的主要特征是EBNA3A，3B和3C具有免疫优势，而对LMP2，EBNA2只有弱响应，对LMP1则几乎没有响应(2)。由于EBNA1内部存在甘氨酸-丙氨酸重复结构域(GAr)(3)，因此没有免疫原性。因为多数EBV相关肿瘤表现潜伏I或者II期模式，所以研究重点集中在了增强抗LMP1或LMP2的CTL反应方面。
大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)的B亚基以及与其密切相关的类似物一霍乱弧菌毒素的B亚基CtxB都能够通过它的受体GM1(GM1是一种广泛存在于细胞表面的鞘糖脂)附着到靶细胞的表面，造成被结合的EtxB/CtxB迅速聚集或加帽，进而引发毒素的内吞。
已经显示，EtxB能够增加外源性抗原穿透粘膜表面的摄取，增强这些抗原的免疫原性。因此可以在经粘膜传送的疫苗(4)的设计中将其用作佐剂。
在LCLs以及一些EBV相关恶性肿瘤中发现了EBV潜在膜蛋白LMP1和2，这些肿瘤包括鼻咽癌(5)和Hodgkin病。已经显示，LMP1在质膜鞘糖脂丰富(GSL)的区域浓度很高(6)。在另一个研究中发现，用荧光显微镜可以观察到LMP2和LMP1的共区域化现象(7)。在这些区域GM1也很丰富。
虽然不希望被理论束缚，但是本发明的发明者认为在将非毒性重组形式EtxB添加到LCL细胞后，由于LMP1、2和EtxB受体GM1都存在于相同的GSL区域，所以LMP1和2能够和EtxB发生聚集和内化。这些病毒蛋白可能随后经历另外一种抗原加工过程，这最终可能会导致以前被保护的蛋白上的表位能够被更有效地加工和递呈到细胞毒T淋巴细胞。据信从理论可以推测CtxB也能够产生相似的效果，而且该理论能够扩展到通常在细胞表面表达的病毒抗原而不仅限于EBV潜在膜蛋白。
相应地，本发明的第一方面提供了选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)的B亚基和霍乱弧菌毒素(CtxB)的B亚基的蛋白毒素B亚基在改变病毒抗原和肿瘤抗原的抗原加工和递呈方面的应用。所述的病毒抗原是在细胞表面表达的病毒抗原，尤其指EBV潜在膜蛋白。因此在第二方面，本发明提供了选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)的B亚基和霍乱弧菌毒素(CtxB)的B亚基的蛋白毒素B亚基在药物生产中的应用，所述的药物用于治疗患有的EB(Epstein Barr)病毒感染相关疾病的动物(包括人在内)。在第三方面，本发明提供了选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)的B亚基和霍乱弧菌毒素(CtxB)的B亚基的蛋白毒素B亚基在药物生产中的应用，所述的药物用于治疗患有肿瘤疾病的动物(包括人在内)。
将会清楚选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)的B亚基和霍乱弧菌毒素(CtxB)的B亚基的蛋白毒素B亚基对患病动物(包括人在内)有治疗效果，其中的病毒细胞或者肿瘤细胞所具有的表面表达的抗原在病理上相关。因此，当包括人在内的动物体被感染或者携带EB病毒时，可以通过给予一定量的含有EtxB或者CtxB的组合物进行治疗。另外，当包括人在内的动物患有肿瘤疾病时也可以通过给予一定量的含有EtxB或者CtxB的组合物进行治疗。
所述的含有EtxB或者CtxB的组合物还可以含有细胞表面表达的抗原。
因此，本发明的另一方面提供了一种治疗制剂，该制剂含有选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)的B亚基和霍乱弧菌毒素(CtxB)的B亚基的蛋白毒素B亚基以及一种细胞表面表达的抗原。优选的细胞表面表达的抗原是细胞表面表达的病毒抗原，优选EB病毒潜在膜蛋白。该潜在膜蛋白可以是EBV的LMP1或者EBV的LMP2。
通常，蛋白毒素的B亚基和细胞表面表达的病毒抗原是连接或者偶联在一起的。或者，蛋白毒素B亚基和细胞表面表达的病毒抗原也可以是融合的。
本发明还提供一种含有蛋白毒素B亚基和一种细胞表面表达的抗原的融合蛋白，融合蛋白中的蛋白毒素优选EtxB，病毒抗原则优选EBV潜在膜蛋白。
融合蛋白的制备在该领域内已经很成熟，因此据信可以采用该领域内众所周知的技术和方法。在这一方面，可以参考US-A-5589384，EP-A-0418626和WO 00/14114。
本发明还提供了一种融合蛋白，该蛋白包含与大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)或霍乱弧菌毒素(CtxB)的B亚基同源的第一蛋白，并含有与细胞表面表达的病毒抗原同源的第二蛋白。所述的第一同源蛋白能够结合GM1受体，所述的第二同源蛋白能够内化进入细胞并改变抗原加工过程。本发明的制剂可用于治疗病毒性疾病。当细胞表面表达的病毒抗原是EBV潜在膜蛋白时，该制剂可以用来治疗与EBV相关的疾病或者治疗肿瘤，例如白血病。因此，本发明还提供了一种对患有EB病毒相关疾病的动物的进行治疗方法(所说的动物包括人)，该方法包括将有效量的所述制剂给予包括人在内的动物体。本发明还提供了一种对患有肿瘤疾病的动物的治疗方法(所说的动物包括人)，包括了将有效量的所述制剂给予包括人在内的动物体。
本发明的治疗制剂含有蛋白毒素的B亚基或者还含有细胞表面表达的抗原，可以将其以药物组合物的形式给予包括人在内的动物体，所述的药物组合物除了含有所述的治疗制剂外，还可以含有一种或者多种药学上可以接受的载体、稀释剂或者赋形剂。所述治疗制剂本身或以药物组合物形式存在的所述治疗制剂，可以根据预防或者治疗的目的进行给药，可以以传统制剂的任何一种给药途径进行给药，包括口服给药和肠胃外给药等。
参考下述附图，通过实施例对本发明进行描述。
图1展示的是同一条件下对6种不同LCL细胞系的LMP1进行标记的一系列图；图2是一张显示不同浓度下EtxB与LCL结合的图；图3是一张显示EtxB结合到胞浆膜上的免疫荧光显微照片图4是一张显示EtxB在细胞一极产生帽化作用的免疫荧光显微照片；图5是经EtxB处理后LCL细胞上LMP1的蛋白印迹的检测图；图6是经过SDS-PAGE后LMP1的蛋白印迹的检测图；图7是描述针对不同的靶细胞比较WT poly T的细胞毒性的直方8是描述针对不同靶点DA c64的CTL活性示意图。
实施例(A)细胞培养在实验中使用来源于各种供体的淋巴海蕾细胞系。EB4是一种EBV阴性B淋巴细胞系，将此细胞作为阴性对照。在含有10％胎牛血清、2mM谷酰胺、100μg/ml青霉素、100pg/ml链霉素的RPMI1640培养基(RPMI完全培养基)中培养该细胞，培养温度37℃，5％CO2孵箱培养。用台盼蓝染色的方法鉴定活细胞。
甲泛葡胺处理在某些实验中，用1ml甲泛葡胺(18％w/v甲泛葡胺和2％FCS的PBS)溶液和2ml含有LCLs的RPMI完全培养基混合，500g离心15分钟后，可以从健康细胞中分离出碎片。小心的从溶液的分界面收集活细胞并洗涤。
EtxB和抗体Bristol大学的T.R.Hirst教授惠赠非毒性重组EtxB、118.8单克隆鼠抗EtxB抗体和兔抗EtxB血清。CS1-4鼠抗LMP1抗体(Dako公司)、FITC偶联山羊抗鼠IgG抗体(Sigma公司)、Texas红色偶联的驴抗兔IgG抗体和FITC-偶联驴抗鼠IgG抗体(均来自Jackson ImmunoResearch公司)。
用EtxB处理细胞将含有1×106个/ml的LCL细胞培养液和10μg/ml的EtxB在2ml孔内共同孵育，每个实验根据指定的时间在37℃，5％CO2孵箱中培养。这些条件利于诱导帽化和内化。用冰预冷的含0.1％的叠氮化物的PBS洗涤中止上述过程。阴性对照细胞在上述相同的条件下进行孵育，不过不加入EtxB。第二组阴性对照加入EtxB进行处理，不过在4℃条件下孵育，这样处理后，允许表面结合但是抑制帽化和内化。
流式细胞仪为了检测LMP1和LCL细胞，用含1％多聚甲醛的磷酸赖氨酸缓冲液于4℃固定细胞1小时。用CS1-4(1∶100)间接标记LMP1后，用FITC偶联抗鼠IgG(1∶100)检测。为了检测EtxB对LCL细胞的亲和力，用不同浓度的EtxB在4℃条件下处理细胞1小时。洗涤后用118.8(1∶20)做为一抗标记EtxB，用FITC偶联抗鼠IgG抗体(1∶100)做为二抗进行处理。2个实验均在适当的染色后洗涤一次，并用Becton Dickinson FACS扫描系统进行分析。
共聚焦显微镜按上述方法，在用含1％多聚甲醛的磷酸赖氨酸缓冲液固定细胞之前，在4℃或37℃条件下，用EtxB处理细胞4小时。先用CS1-4(1∶50)和兔抗EtxB血清(1∶500)处理，然后用FITC偶联驴抗鼠IgG抗体(1∶100)和得克萨斯红偶联抗兔IgG抗体(1∶500)做为二抗进行处理。用10-20μl Vectashield封固介质(Vector)重悬细胞沉淀并且将细胞固定在载玻片上。用Zeiss立式扫描共聚焦显微镜同时对LMP1和EtxB进行40x和60x的放大显像。
凝胶电泳和蛋白免疫印迹用预先铺好的Bis-Tris微型凝胶(Novex)以及标准SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳和蛋白印迹，在加入和不加入EtxB的情况下，分别孵育10小时，检测在LCL细胞上的LMP1。在不同的时间点收集等量的细胞。
用添加了蛋白酶抑制剂(1∶7终体积)(Boehringer Mannheim)的预先混合的样本缓冲液(Novex)裂解全细胞以制备用于微型凝胶上样的细胞裂解物，加入蛋白酶抑制剂的目的是为了防止非特异的蛋白降解。然后煮沸5分钟并且超声处理30秒。裂解物中含有等同的细胞数量(1.3×105细胞/泳道)，用4-12％Bis-Tris梯度凝胶分离该裂解物。转移到硝化纤维膜上后用含有5％脱脂牛奶和0.05％吐温的TBS封闭非特异位点。首先在CS1-4(1∶50)中孵育印迹，然后在HRP偶联山羊抗鼠IgG抗体中孵育。最后放在HRP底物中(Pierce)，之后进行X射线显影(Kodak)。
对于标准的SDS聚丙烯酰胺凝胶，除了改变样品缓冲液(0.05MTris-HCl pH 6.8，2％2ME，10％甘油，0.01％溴酚蓝)之外按照上述的同样方法制备样品。再次将相等数量的细胞(1×106细胞/泳道))上样到每个泳道中并且在12-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶进行分离。转移到硝化纤维膜上，和微型凝胶系统一样封闭非特异性位点并且让CS1-4结合到LMP1上。使用碱性磷酸酶偶联二抗(Sigma)，通过ALP底物(Vector)处理来检测LMP1特异性条带。
CD8+细胞系和靶细胞WT poly T是一株针对LMP2的多克隆CTL细胞系。DA c64是一株针对HLA-A2.01限制性表位CLG的LMP2特异性T细胞克隆，抗原决定簇CLG是LMP2的第426-434位的CLGGLLTMV 9肽序列。在细胞毒分析中以自体同源LCL为靶细胞。这些细胞均由伯明翰大学癌症研究院CRC的A.B.Rickinson教授惠赠。
细胞毒分析该实验是在伯明翰大学CRC癌症研究院的协助下完成的。将WT polyT和DA c64做为标准5小时铬释放分析的效应器。每次经过如下处理后都要对不同组的靶细胞进行广泛的清洗(1)与EtxB单独作用2小时，(2)与CLG(0.1，μg/ml)作用2小时，洗涤并且和EtxB孵育2小时或者(3)用编码LMP2的重组牛痘病毒感染过夜后洗涤并且和EtxB孵育2小时。对照组重复上述操作但是不加入EtxB。如上所述准备完毕后，在37℃用51Cr标记靶细胞1小时，洗涤3次并且在U型底96孔板上按照已知的效应物靶细胞比例混合效应物，每个样品2个孔。当用1％Triton-X溶液代替效应物细胞孵育靶细胞可以得到最大释放，而单独用RPMI培养基处理靶细胞可以得到自然释放。经过5小时的孵育后，用γ计数器定量上清中的放射活性。
用流式细胞仪测定LCL细胞上LMP1的相对数量。
流式细胞仪可以测定不同淋巴海蕾细胞系的LMP1数量上的差异。这可能影响到在后续实验中对LCL细胞的选择。
在实验中使用了名为BER、HOMII、110W10、IR、JG和WT18的6种LCL细胞，并将EB4做为阴性对照。当抗体结合位点是蛋白位于胞浆的C末端时，必须在CS1-4结合LMP1之前固定和增渗处理细胞。
图1显示6种LCL细胞中的LMP1相对数量没有显著区别。这表明(1)LMP1的数量依赖于稳定的EBV转化的B细胞数量而不依赖于宿主细胞的数量。(2)对所用LCL细胞的选择将回使对后续研究EtxB对LMP1或2抗原加工通路影响的影响最小。
流式细胞仪测定EtxB的滴度虽然我们实验室在先前的实验中已经证明LCL和EtxB孵育72小时不会影响LCL的成活性(没有给出数据)，但是我们需要测定EtxB和细胞表面GM1达到最大结合时的EtxB最佳浓度。
取1×106细胞/ml的LCL和不同浓度的EtxB孵育后，然后用流式细胞仪测定LCL细胞中EtxB的数量(图2)。
结果表明，尽管各组间的差异很小，不过可以确定EtxB在LCL细胞上达到最大结合量时其浓度在1.0到20.0μg/ml之间(表1)。基于这些结果，在后续实验中采用10pg/ml作为EtxB的使用浓度。
表1所示的是用不同浓度的EtxB处理LCL细胞，然后对EtxB进行标记并用FACS分析。当用用浓度为1.0到20.0μg/ml的EtxB处理细胞时产生了最强的信号，表明在该浓度下，EtxB具有较高的结合亲和性。采用免疫荧光共聚焦显微镜观察EtxB和LMP1的共帽作用如前所述，GM1和LMP1二者都存在于细胞表面的鞘糖脂(GSL)富集区域。因此认为当EtxB结合GM1后会引起EtxB的帽化和内化，这可能会改变LCL表面LMP1的分布。
用偶联有荧光染料的抗体标记EtxB，它们会与GM1结合并发生帽化和内化，此过程可用免疫荧光显微镜观察。另外，用不同的荧光染料标记LMP1，就可以看到LMP1和EtxB的共区域化以及帽化后的重分布的情况。共聚集荧光显微镜具有所需的光学敏感度，可用来同时观察标记蛋白在细胞表面和细胞内部的分布状况。
4℃处理细胞后观察，发现Texas红标记的EtxB呈小斑点状遍布细胞表面(图3)，这表明EtxB已经和GM1结合但未观察到帽化现象。还看到大部分FITC标记的LMP1以斑点状分布在细胞表面。更加重要的是，当同时检测EtxB和LMP1时，可看到EtxB和LMP1在细胞表面的共区域化现象。
在37℃条件下，可注意到EtxB的帽化趋向细胞的一极，并能诱导LMP1产生相似的现象，即发生共帽化(图4)。不过，还不能观察EtxB和LMP1在细胞内的分布情况。这主要是因为(1)只有少量的EtxB和LMP1发生内化；(2)内化进入细胞的EtxB和LMP1被迅速降解；(3)对于相对小的CLC(平均大小10-20μ)，很难得到理想的薄的“光学切片”(最小值是1μm)和(4)没有一种较好的计数染色方法来区分细胞内的胞浆和细胞核区室。似乎假设(1)是正确的。
在EtxB处理后在蛋白质印迹中没有发现LMP1降解根据共聚焦显微镜的结果，LMP1和EtxB发生共区域化现象，并且经历共帽化，进一步的研究需要表明LMP1是否确实和EtxB发生了内化。据推测，发生内化后，LMP1进入新型的降解通路并且产生新的降解产物。通常，去除LMP1蛋白或者其它跨膜蛋白需要特殊的蛋白水解酶，这些酶在分开蛋白跨膜结构域的细胞质反向环产生缺口。如果发生上述作用，当用SDS-PAGE凝胶电泳检测全细胞裂解液时能够看到全长LMP1的量下降。确实，在这一过程中的早期片断产物仍然含有完整的羧基末端，其可以被CS1-4抗LMP1抗体识别。为了改进条带的分辨率可以使用梯度胶进行电泳，尤其是当LMP1片断降解成更小的片断的时候。在细胞裂解物制备过程中，需格外小心，可以通过将样本置于冰上和添加蛋白酶抑制剂的办法尽量减少内源性蛋白酶的作用。在转移后，用免疫印迹Ponceau S染色法对相同上样量的细胞裂解物进行检测。在一些实验中，在蛋白质印迹中利用和EBV无关的蛋白EBNA作为内部对照，图5所示的是用4-12％的微型凝胶得到的标准结果。只在LCL细胞的裂解物中清楚地检测到LMP1全长蛋白，在EBV阴性对照细胞条带中未检出该蛋白。虽然增加了EtxB的处理时间，但是在EB4条带中LMP1全长蛋白没有明显减少。同样也没有检测到LMP1的片断。
尽管微型凝胶能够提供高质量的印迹结果，不过每条泳道的蛋白上样量有限。因此，改用标准凝胶，这种凝胶基本上可以通过增加每条泳道的裂解物上样量改善了检测的灵敏度，与此类似，使用梯度凝胶(12-20％)来改善条带的分辨率。
这一次，很容易又检测到了LMP1全长蛋白(图6)，尽管延长了EtxB的孵育时间，仍然没有检测到完整LMP1的显著减少，同时也没有看到任何降解条带。不过出现了另外的问题，即这组免疫印迹的背景信号很强，很难分辩可能产生的任何小片断。
到目前为止，用共聚焦显微镜和蛋白质印记还没有成功的检测到EtxB作用后LMP1产生的内化和降解。这可能源于以下几点原因(1)假说是错误的，从来就没有内吞和降解现象发生，(2)目前所用的方法的敏感度不足以检测到内化和降解的微量LMP1，(3)EtxB处理后蛋白酶马上降解了C末端，造成抗LMP1抗体(CS1-4)的抗体结合位点缺失或者(4)LMP1的更新率很快，用目前的检测手段很难检测到细胞内部的总LMP1量的微小改变。
通过51Cr释放分析检测的LMP2特异性CTL对EtxB处理的靶细胞的增强杀伤效果细胞毒T细胞(CTL)能够识别递呈在细胞表面的HLA I类相关分子，甚至当这些抗原的递呈数量是痕量状态时，也有这种识别功能。如果加入的EtxB确实能够诱导LMP1和2改变抗原加工过程，导致原先被保护的表位被更有效的递呈，那么当用CTL细胞系对LMP1或2激活的EtxB处理的靶细胞进行细胞毒分析时，就能够提供一种检测EtxB改变这些潜在膜蛋白抗原递呈效果的极其敏感和特异的手段。
已经鉴定了一些HLA I类限制性LMP2抗原表位，已经产生了针对LMP2及其抗原表位的CD8+细胞系(Rickinson)。相反，目前仅仅鉴定出了一个LMP1的抗原表位(Khanna)。鉴于这个原因，在铬释放分析中采用LMP2特异的T细胞系作处理EtxB处理的自体同源性靶细胞。
在这些实验中使用了2种CTL细胞系WT poly T和DA c64。用自体同源性LCL细胞作为靶细胞，将这些细胞分成3组(1)单独用EtxB处理，(2)在用EtxB处理前，进行CLG肽处理和(3)在加入EtxB之前，用载有LMP2A基因的牛痘病毒进行转染处理。
从表2可以看出单独添加EtxB处理LCL细胞后，DA c64克隆的CTL反应增加了4倍，相同处理后，多克隆WT poly T细胞系的反应始终保持在显著增加2倍的水平。与上述结果相似的是，与只使用vacLMP2处理的靶细胞相比，针对先前曾经被带有LMP2(vacLMP2)的痘苗病毒处理过的EtxB处理的靶细胞的活性增高。图7和图8很清楚地体现在EtxB作用后，LMP2特异的CTL反应得到增强。
不过，用EtxB处理肽脉冲的(peptide-pulsed)靶细胞没有提高细胞毒性。一种可能的解释认为用于脉冲的肽的数量在细胞表面已经饱和了可用的结合位点，从而实现了最佳识别和最大的CTL反应。
用EtxB处理EBV感染细胞的这组结果是第一次给出证据表明EtxB能够增强LMP2的产生和递呈，刺激CTL细胞增强对这种蛋白的反应。
表2
表2-靶细胞在WT poly T和DA c64作用下特异性裂解百分数。用EtxB处理后增加了DA c64针对LCL细胞和vacLMP2转染的LCL细胞的活性。虽然增强效果有些下降，但是WT poly T组也得到了相似的结果。尽管用EtxB进行了处理，事先CLG肽脉冲处理的LCL细胞没有产生更强的CTL杀伤敏感性。
EtxB被广泛用于提高外源性抗原的细胞内转运，其或者被用作疫苗佐剂，或者被用作融合蛋白(最近)，这一系列实验第一次表明其对于递呈到细胞表面上的内源性蛋白具有类似的影响。
该假说的基础是EtxB只能作用于位于它的受体GM1所处区域的膜蛋白。位于EBV转化的淋巴海蕾细胞系上的EBV潜在膜蛋白满足这样的苛刻条件。
实验表明EtxB能够改变细胞表面的LMP1分布。更重要的是，在LMP2的情况下，似乎改变了抗原加工路径进而引发CTL反应的急剧增强。
尽管仍然只是初步的实验结果，但是该结果表明EtxB可用于提高CTL识别和杀伤表达有LMP2靶细胞和可能地，LMP1靶细胞的能力。因此，该蛋白在表现出潜伏模式II的EBV相关肿瘤的免疫治疗方面具有重要作用，尤其是鼻咽癌和Hodgkin疾病。
(B)EtxB及其突变体前面已经介绍了无毒性重组EtxB。在本实验中还使用了分别被命名为G33D和H57A的2种EtxB的突变体蛋白。G33D在33位用Gly替代了Asp以阻止其与GM1的结合，而H57A能够和GM1结合，但是由于用His取代了57位的Ala，H57A不具有免疫调节活性。EtxB和上述的突变体均由伯明翰大学的T.R.Hirst教授惠赠。
W6/32和DA6.231上清收集W6.32的培养上清，将其用于全部I类HLA的封闭抗体母液，从DA6.231得到的上清类似地被用作抗II类HLA封闭抗体母液。
肽用标准9-芴基甲基氧羰基(FMOC)化学(布里斯托尔大学)制备得到与EBV潜伏抗原的抗原表位一致的肽，并且按已知浓度将其溶解在DMSO中。
多克隆细胞毒CD8+T细胞系外周血单核细胞(PBMCs)来自健康血清阳性捐赠者。用磁式细胞分选仪(MACS，Miltenyi Biotec)选择得到阳性CD8+细胞，将其留出。在37℃条件下，剩余的PBMC细胞接受50μM已知的肽的脉冲处理1小时。洗涤3次之后和CD8+细胞合并在一起，按照1×106细胞/ml的接种量在完全RPMI培养基中培养合并的细胞，该培养基中含有25ng/ml IL-7，在第3天时加入10U/ml的IL-2。之后，每周更换培养液2次，所用培养液含有25ng/ml IL-7和10U/ml IL-2。在第12天时，磁力分选CD8+并且进行计数。剩余细胞在培养基中进行50-100μM肽的脉冲处理，处理1小时后，用50μg/ml丝裂霉素C于37℃条件下再处理1小时。洗涤上述细胞3次后将其以响应物∶刺激物为2∶1的比例加入到CD8+细胞中。随后用细胞毒性分析检测这些培养物，并且每周用丝裂霉素C处理的LCL细胞重新刺激1次。
细胞毒性分析自体同源LCL细胞来自上述PBMC细胞相同的供体，该细胞在实验中被用作靶细胞。这些细胞(1)单独使用，或者(2)用10μg/ml EtxB或者其一种突变体处理4小时或者处理过夜。用70-100μCi的放射性铬标记靶细胞90分钟。在某些靶细胞中，在最后的60分钟内加入终浓度为5μM的特异性肽或者DMSO溶剂。每个标准铬释放分析要求洗涤细胞并且和效应物共同孵育4小时。当实验需要抑制I类HLA抗原递呈时，要在添加效应细胞之前，将标记的靶细胞和W6/32或DA6.231上清按照1∶10的比例在室温孵育1小时。
实施例B1ExtB处理LCL细胞，能够增强LMP1和LMP2-特异性CTL细胞的识别和杀伤能力，不能增加EBNA3A-特异性CTL细胞的识别杀伤能力从供体DW(HLA-A0201，A23，B7，B49，C7)得到了2种肽的特异性多克隆CTL细胞系。一种指向HLA-A2限制性LMP1表位YLLEMLWRL(YLL)，另外一种指向HLA-A2.01限制性LMP2表位CLGGLLTMV(CLG)。用一系列的肽对这些细胞系进行了检测，发现这些细胞系具有良好的特异性(图9和10)。
图9和10。图9和图10所示的CLG-特异性和YLL-特异性DW CTL细胞系分别被用于指向自体同源LCL靶细胞，这些靶细胞或者单独使用，或者用各种已知的I类抗原或当量体积的DMAO溶剂进行脉冲处理。LLD代表EBNA3C抗原表位LLDFVRFMGV，其属于HLA-A0201限制性的，而PYL则是相应于HLA-A2301限制性的LMP2抗原表位PYLFWLAAI。目前已经清楚地证实2种CTL细胞系对制备其所使用的肽都具有良好的特异性。即YLL和HLA-A2 LMP1限制性抗原表位肽YLLEMLWRL一致，CLG具有氨基酸序列CLGGLLTMV，该肽是一种已知的HLA-A0201限制性LMP2表位。
这2种细胞系都能够识别和裂解被EtxB处理的自体同源LCL细胞(图11和图12)。2种细胞的杀伤水平都明显高于未经处理的背景CLC细胞杀伤水平。在4小时后，EtxB表现出迅速发动、维持以及提高对CTL的识别和杀伤靶细胞效果，甚至在过夜孵育后还能维持在相近水平。
EBNA3A是另外一种EBV潜在抗原，这种抗原只在核内表达，不在细胞膜上表达。一种来自另一种供体OKW(HLA-A11，A24，B40，C4，C7)的CTL细胞系对RYSIFFDY(RYS)有特异性，RYSIFFDY(RYS)是HLA-A24限制性EBNA3A抗原表位。与LMP1和LMP2特异的CTL细胞不同，用EtxB处理LCL细胞系后不能增加EBNA3A特异性CTL细胞对靶细胞的杀伤能力。(图13)。这种情况支持了下面的假说EtxB仅仅能够改变位于脂双层的结合蛋白的抗原加工过程和递呈通路。
图11、12和13。在图11中，CLG-特异的DW CTL对EtxB处理的LCL靶细胞的靶向作用显著高于未经处理的LCL细胞。这不是EtxB处理增加了细胞的渗透性的结果，因为在所有靶组(没有列出数据)任意计数和最大计数的绝对数量和比例在很大程度上都基本相当。当用YLL特异的DW CTL细胞时得到了相似的效果(图12)。在2个实验中，用EtxB处理靶细胞4小时或者孵育过夜后，细胞毒性杀伤能力都得到了相似的提高。这表明EtxB对LMP1和LMP2的作用迅速而且能够得到维持。对照组实验与此相似。在类似的实验种还使用具有RYSIFFDY(RYS)特异性的对照CTL细胞系，RYSIFFDY(RYS)是HLA-24限制性EBNA3A抗原表位。不过，用EtxB处理LCL细胞后细胞毒性杀伤能力没有提高(图13)。这表明EtxB仅仅能够影响所发现的膜结合型抗原的加工和递呈过程。
实施例B2CTL对EtxB处理的LCL细胞的杀伤能力的提高是通过I类HLA介导的为了确定在EtxB处理后的CTL杀伤能力的提高，是否是通过I类HLA抗原介导的，将EtxB处理的LCL细胞和含有全部I类HLA抗体的W6/32上清共同孵育。这可以防止在CD8+CTL细胞表面的T细胞受体(TCR)和在LCL靶细胞上的I类HLA抗原的相互作用。
图14和图15。W6/32是一种全部I类HLA的封闭抗体，将该抗体在EtxB处理后或者肽脉冲处理后使用。结果表明I类HLA封闭抗体能够有效阻断肽脉冲处理的靶细胞的裂解作用，而使用抗II类HLA抗体DA6.231时，细胞裂解不受影响。经过EtxB处理的靶细胞组得到相似结果。这表明EtxB对LMP1和LMP2作用是通过I类HLA抗原递呈通路介导的。
如图14和15所示，在与W6/32抗体孵育后，YLL和CLG特异性DW CTL细胞对EtxB处理靶细胞的杀伤水平显著下降。在用相关肽脉冲处理的靶细胞中看到了类似的而且预料得到的下降。当使用DA6.231抗II类抗体处理时，EtxB的效果没有显著改变。
因此，EtxB处理后导致的CTL细胞的杀伤能力增强是因为该处理增加了LMP1和LMP2I类表位的产生，随后该表位与I类HLA抗原分子形成复合物后被递呈到LCL靶细胞的表面。
实施例B3EtxB对LMP1和LMP2的影响需要GM1结合，单并不依赖于其免疫调节活性已知EtxB具有多种免疫调节活性，例如上调B细胞的CD25和MHCII类抗原、以及通过NFκB依赖的和链激酶3(caspase3)依赖的信号通路诱导鼠科动物CD8+T细胞的凋亡。
图16和17。G33D是一种不能发生结合的EtxB突变体，用G33D处理靶细胞后不会被CTL细胞识别和杀伤，这表明EtxB对LMP1和LMP2的作用需要和神经节苷脂受体GM1的结合。也可以使用第二种突变体H57A，该突变体与GM1结合但不具有显著的免疫调节活性，如诱导依赖于NFκB和链激酶3的鼠科动物CD8+T细胞的凋亡。在这里，CTL对LMP1和LMP2的杀伤效果的增强效果没有被抑制，这表明在增强杀伤效果作用中EtxB介导的信号没有发挥作用。
从图16和17中可以看到，当用没有结合活性的突变体G33D处理后，CTL的杀伤能力没有得到提高，这清楚的表明EtxB结合到GM1对于其对LMP1和LMP2的影响是重要的。但是，用能够结合GM1但是免疫调节活性缺失的突变体H57A处理时，CTL细胞的杀伤能力提高与用EtxB处理的作用相当。因此，看起来EtxB对LMP1和LMP2加工的影响以及随后对产生免疫原性肽的影响不依赖于它的免疫活性。
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权利要求
1.一种治疗制剂，其包含一种选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)B亚基和弧菌霍乱毒素(CtxB)B亚基的蛋白毒素B亚基，和一种细胞表面表达的病毒抗原。
2.根据权利要求1的治疗制剂，其中所述的蛋白毒素B亚基和细胞表面表达的病毒抗原是连接的。
3.根据权利要求1的治疗制剂，其中所述的蛋白毒素B亚基和细胞表面表达的病毒抗原是偶联的。
4.根据权利要求1的治疗制剂，其包含一种所述蛋白毒素的B亚基和所述细胞表面表达的病毒抗原的融合蛋白。
5.根据权利要求1-4任何一项中的治疗制剂，其中所述的细胞表面表达的抗原是EB病毒潜在膜蛋白。
6.根据权利要求5的治疗制剂，其中的细胞表面表达的抗原是EB病毒LMP1。
7.根据权利要求5的治疗制剂，其中的细胞表面表达的抗原是EB病毒LMP2。
8.根据权利要求1-7任何一项中的治疗制剂，其中的蛋白毒素B亚基是EtxB。
9.一种融合蛋白，其包含一种选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)B亚基和弧菌霍乱毒素(CtxB)B亚基的蛋白毒素B亚基，和一种细胞表面表达的病毒抗原。
10.根据权利要求9的融和蛋白，其中所述的细胞表面表达的抗原是EB病毒潜在膜蛋白。
11.根据权利要求10的融和蛋白，其中所述的细胞表面表达的病毒抗原是EB病毒LMP1。
12.根据权利要求10的融和蛋白，其中所述的细胞表面表达病毒抗原是EB病毒LMP2。
13.根据权利要求9-12任何一项中的融和蛋白，其中的蛋白毒素B亚基是EtxB。
14.一种融合蛋白，该蛋白包含与大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)或霍乱弧菌毒素(CtxB)的B亚基同源的第一蛋白，并含有与细胞表面表达的病毒抗原同源的第二蛋白，所述的第一同源蛋白能够结合到GM1受体而且所述的第二同源蛋白能够内化进入细胞并在那里改变抗原加工路径。
15.根据权利要求14的融和蛋白，其中所述的第二同源蛋白和EB病毒LMP1同源。
16.根据权利要求14的融和蛋白，其中所述的第二同源蛋白和EB病毒LMP2同源。
17.一种组合物在药物生产中的应用，所述的组合物包含一种选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)B亚基和弧菌霍乱毒素(CtxB)B亚基的蛋白毒素B亚基和一种EB病毒潜在膜蛋白，所述的药物用于治疗包括人体在内的患有EB病毒相关疾病的动物体。
18.根据权利要求17的应用，其中的EB病毒潜在膜蛋白是LMP1。
19.根据权利要求17的应用，其中的EB病毒潜在膜蛋白是LMP2。
20.一种组合物在药物生产中的应用，所述的组合物包含一种选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)B亚基和弧菌霍乱毒素(CtxB)B亚基的蛋白毒素B亚基和一种EB病毒潜在膜蛋白，所述的药物用于治疗包括人体在内的动物体中的瘤形成。
21.根据权利要求20的应用，其中的EB病毒潜在膜蛋白是LMP1。
22.根据权利要求20的应用，其中的EB病毒潜在膜蛋白是LMP2。
23.一种治疗患有EB相关疾病的、包括人体在内的动物体的方法，该方法包括给予所述的包括人体在内的动物体有效量的、权利要求5-7任何一项中所述的治疗制剂。
24.一种治疗患瘤的、包括人体在内的动物体的方法，该方法包括给予所述的包括人体在内的动物体有效量的、权利要求5-7任何一项中所述的治疗制剂。
25.选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)B亚基和弧菌霍乱毒素(CtxB)B亚基的蛋白毒素B亚基在改变病毒和肿瘤抗原的抗原加工和呈递中的应用。
26.选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)B亚基和弧菌霍乱毒素(CtxB)B亚基的蛋白毒素B亚基在药物生产中的应用，所述的药物用于在包括人体在内的感染了EB病毒的动物体中，治疗与EB病毒相关的疾病或病。
27.选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)B亚基和弧菌霍乱毒素(CtxB)B亚基的蛋白毒素B亚基在药物生产中的应用，所述的药物用于在包括人体在内的动物体中治疗瘤形成。
28.一种治疗患有EB相关疾病的、包括人体在内的动物体的方法，该方法包括给予所述的包括人体在内的动物体有效量的、选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)B亚基和弧菌霍乱毒素(CtxB)B亚基的蛋白毒素B亚基。
29.一种治疗患瘤的、包括人体在内的动物体的方法，该方法包括给予所述的包括人体在内的动物体有效量的、选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)B亚基和弧菌霍乱毒素(CtxB)B亚基的蛋白毒素B亚基。
全文摘要
本发明涉及蛋白毒素的B亚基，该B亚基选自大肠杆菌热不稳定肠毒素(EtxB)的B亚基和霍乱弧菌毒素(CtxB)的B亚基，本发明涉及的蛋白毒素B亚基对在细胞表面表达病毒和肿瘤抗原的细胞有治疗效果。特别是，该蛋白毒素可用于治疗患有EB病毒(Epstein－Barr virus)感染疾病或者肿瘤疾病的动物(包括人)的。另外，该治疗制剂可以含有细胞表面表达抗原，如EB病毒潜在膜蛋白。
文档编号C07K19/00GK1561232SQ01822038
公开日2005年1月5日 申请日期2001年12月11日 优先权日2000年12月11日
发明者安德鲁·约翰·摩根, 安德鲁·道格拉斯·威尔逊, 王贡伟 申请人:布里斯托尔大学