专利名称：用细胞凋亡诱导方法治疗疾病的制作方法
技术领域：
本发明涉及到以过度细胞增殖和活化为特征的疾病的治疗和预防。本发明独到之处在于提供了若干制剂和方法，用于抑制多种不同种类之细胞的活化和/或者增殖。本发明提供的这些制剂和方法，优先用来抑制间质衍生性细胞的活化和/或者增殖(包括但不仅限于肝脏星形细胞)，也用于抑制那些具有异常生长特征的细胞(如肿瘤细胞)。本发明还提供了一些制剂和方法，特另优先用于阻断或者消除纤维变性。另外，本发明也提供了制剂和方法来诱导纤维变性。本发明还进一步为癌症的治疗和预防提供了方法和制剂。
背景技术：
细胞的异常增殖是多种不同病理过程的一种标志。在特定条件下，细胞生长的失控与某些纤维变性性疾病相关(如肝纤维变性)，也与其他多种疾病及包括癌症在内的异常细胞增生性病理条件相关。
以慢性肝炎为例，这是一种至少长达六月未见好转的炎性肝病。慢性丙肝是慢性肝炎的一种类型。有待进一步查证的是，慢性丙肝可能发展成为肝硬化和广泛性肝坏死。尽管慢性丙肝常与I型胶原沉积有关，从而导致肝纤维变性，但其纤维生成机理尚未查明。确实，目前对于与I型胶原过度产生相关的肝纤维生成导致的疾病尚无确定的治疗方法[参见文献如Maher and McGuire，J.Clin.Invest.861641-48(1990)；Chojkier“Pathogenesisof hepatic fibrosis”.In Extracellular Matrix，Marcel Dekker Inc.，New York，NY，pp541-57(1993)]。尽管如此，目前还是已查明多种核糖体蛋白的S-6激酶对于包括诸如肝脏星形细胞在内的多种细胞的生存是至关重要的，而肝脏星形细胞正是通过其过量生成纤维组织从而导致了肝硬化的发生。但尽管在纤维化病变(如纤维性变化)方面投入了大量的资金和研究努力，目前仍然需要先进的制剂和方法，以便用来有效地抑制包括癌症细胞在内的异常细胞的活化和/或者增生。
发明内容
本发明的主要目的在于为以过度细胞增殖和活化为特征的疾病的治疗和预防提供一种新的先进的制剂和方法，以便用来有效地抑制包括癌症细胞在内的异常细胞的活化和增生。
本发明提供了一种增进细胞凋亡过程的方法，该方法具备以下几点a)前提条件为i)至少一个细胞(拟或一个细胞群体)；同时ii)一种包含一种或多种四肽序列的多肽，而这些四肽序列则选自(1)KAVD(赖氨酸-丙氨酸-缬氨酸-天冬氨酸，以下同)和(2)KKPA(赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-丙氨酸，以下同)；b)用这些多肽制剂处理细胞由此促进这种细胞的凋亡。该方法运用中也可采用同类的氨基酸。例如KAVD(该序列获自典型的小鼠和人类C/EBPβ序列)四肽和KKPA(该四肽序列获自典型性大鼠C/EBPβ序列)四肽中的丙氨酸似可被其他任何一种除酪氨酸，苏氨酸和绦氨酸之外的氨基酸所置换。依照此种技艺，则KAVD或KKPA四肽中的丙氨酸似可优先用精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，色氨酸，或者缬氨酸所置换。更优先的情况下，上述KAVD和KKPA中的丙氨酸应由除酪、苏、绦、胱、亮、谷和天冬氨酸之外的任何一种氨基酸所置换。虽然本发明并不限于针对某一特定细胞类型，但具体来说，本发明针对的细胞选定为这样一组细胞，其中包括肝细胞，肺细胞，肾细胞，皮肤细胞，肌肉细胞，心脏细胞，胶质细胞，眼睛细胞，血管细胞，神经细胞，上皮细胞，内皮细胞，以及间质细胞。在上述细胞中，优先涉及的是癌症细胞，在癌症细胞中则优先优先涉及到转移性癌细胞。另外，本发明所涉及的上述细胞，是指某一主体的离体细胞或者在体细胞。
某些情况下，上述多肽序列中一个或多个氨基酸将被修饰或被某种人工合成的氨基酸，或其他在功能上相似的分子所替换(例如，为了增强其在体内的稳定性所作的修饰或替换，等…)。有时也提供小分子类似物，其功能与上述四肽相同或相似。在某些场合，这些分子用高效筛选方法加以鉴定。但在另外一些场合，这些小分子则通过合理的设计产生(例如，在一个或多个氨基酸上进行相似电荷、构型等化学基因的替换)。
此外，本发明也同时提供了一种降低细胞凋亡的方法，该方法由以下几方面组成a)前提条件是i)至少一种细胞；和ii)一种含有一种或多种四肽序列的多肽制剂，这些四肽分子选自(1)KEVD(赖-丙-缬-天冬氨酸)和(2)K-phosphoT-VD(赖-磷酸苏-缬-天冬氨酸)，(3)KKPD(赖-赖-脯-天冬氨酸)；及b)用这些多肽制剂处理细胞由此使这些被处理细胞的凋亡过程得以降低。
本发明进一步提供了降低某种组织中癌症发生的方法，其组成是a)前提条件是i)有一种组织；和ii)有一种多肽制剂，该制剂含有一种或多种四肽分子，这些四肽分子具有如下序列(1)KAVD(赖-丙-缬-天冬氨酸)和(2)KKPA(赖-赖-脯-丙氨酸)；和b)用这些多肽制剂去处理所针对的组织，由此使该组织中的癌症细胞减少。虽然本发明并不局限于一特定研究对象，但具体来讲，这里所涉及的组织是源于某种哺乳动物。优先涉及的哺乳动物主体是人类。某种情况下，本发明涉及的主体的组织中被怀疑有或已证实有癌症细胞。这里涉及的组织具体来讲，选自如下一系列组织，其中包括肝组织，脑组织，肺组织，肾组织，乳房组织，前列腺组织，宫颈组织，直肠组织，胰腺组织，胃组织，卵巢组织，食管组织，口腔组织，舌组织，鼻组织，皮肤组织，肌肉组织，牙床组织，心脏组织，支气管组织，软骨组织，骨组织，睾丸组织，内膜组织，子宫组织，膀胱组织，骨髓组织，淋巴组织，脾脏组织，胸腺组织，甲状腺组织，神经组织，胆囊组织，眼组织，和滑液组织。
本发明同时也提供了一种降低组织纤维变性的方法，其组成是a)假定i)针对一种组织；ii)提供一种多肽制剂，该制剂含有一种或多种四肽分子，这些四肽分子选自(1)KAVD；(2)KKPA；和b)用这种多肽制剂处理所针对的组织，从而使被处理组织中的纤维变性得以降低。这里所涉及的组织具体来讲是指一种哺乳动物组织，优先指一种人体组织。更具体来讲，这里涉及的主体是指已经存在或被怀疑存在纤维变性的组织。再进一步需要具体说明的是，本发明所涉及的纤维变性是选择性地涉及如下一系列纤维变性，例如肝纤维变性，肺纤维变性(例如肺气肿)，肾纤维变性(例如肾小球肾炎)，和眼球纤维变性。在涉及肝脏纤维变性时，更优先涉及的是指与下述具体情况相关的肝纤维变性例如肝移植的排斥，丙型肝炎感染，乙型肝炎感染，酒精中毒，肝中毒，遗传性血色病，叶啉症，和肝硬化。另一种情形是，这种纤维变性也与另一类疾病相关，这一类疾病包括有脑神经胶质增生，阿尔茨海默病，肝病，脑损伤，神经创伤，神经变性，心肌梗塞，动脉硬化，纤维化皮肤病，纤维化肺病。
本发明也提供了一种降低组织中细胞凋亡的方法，该方法包括以下几点a)假定有i)一种组织；ii)和一种多肽制剂，该制剂含有一种或多种四肽分子，这些四肽分子选自(1)(1)KEVD，(2)KphosphoTVD，(3)KKPD，和(4)KKPphosphos；b)用这种多肽制剂去处理所涉及的组织，从而降低该组织的细胞凋亡。这里，优先涉及的是一种哺乳动物组织，而在哺乳动物组织中又优先涉及人体组织。当涉及到这些组织时，其组织中已存在或怀疑存在细胞凋亡过程。而进一步涉及细胞凋亡时，则是指与创伤，烧伤，损伤，环境毒素或局部缺血相关的凋亡。另外，细胞凋亡也与某一组织中一种疾病相关，这类组织包括肺，肾(如肾小球肾炎)，和眼组织(如色素性视网膜炎)，另一种情况是，细胞凋亡也与一种肝病相关，这种肝病包括一组病症，其中包括肝移植的排斥，丙型肝炎感染，乙型肝炎感染，酒精中毒，肝中毒，遗传性血色病，叶啉症。这种细胞凋亡也与另一组疾病相关，这一组疾病包括脑胶质炎，阿尔茨海默病，肝病，脑损伤，神经创伤(如脊柱创伤)，神经萎缩，心肌梗塞，动脉硬化，纤维变性性肝病和纤维变性肺病及帕金森病。
本发明也提供了一种多肽制剂，其组成是一种或多种四肽分子，这些四肽分子选自下列氨基酸序列的四肽分子(1)KEVD(这种四肽分子获自典型的小鼠和人类C/EBPβ序列)，(2)KphosphoTVD(获自典型的小鼠和人类C/EBPβ序列)，(3)KKPD(获自典型性大鼠C/EBPβ序列)，以及(4)KKPphosphos(获自典型性大鼠C/EBPβ序列)，这里所讲的序列至少与前半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶Procaspase1和Procaspase8中的一种结合，而这种结合则降低Procaspase的活化。而这里涉及的多肽多数情况下含有20个氨基酸。
本发明进一步提供了一种多肽制剂，这种的组成成分中含有序列编码3(SEQ IDNO3)，这相应于鼠科动物C/EBPβ系列中217位上苏氨酸(野生型为SEQ ID NO2)变突成为丙氨酸(SEQ ID NO3)。本发明提供的多肽也含有SEQ ID NO4，相应于序列中217位从苏氨酸(野生型为SEQ ID NO2)到谷氨酸的突变。本发明提供的多肽也含有SEQ IDNO14，这相应于修饰过的大鼠CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)含有从序列中105位的绦氨酸(野生型，编号为SEQ ID NO13)突变而来的丙氨酸(SEQ ID NO14)。本发明的多肽也含有序列编码15，即天冬氨酸，是从大鼠C/EBPβ序列中105位上的绦氨酸(野生型，编号为SEQ ID NO13)。本发明提供的多肽也含有如下一种或多种序列，其中包括SEQ IDNO7，10，20和24，分别代表了从人类C/EBPβ系列中的266位的苏氨酸(野生型，编号为SEQ ID NO6，9，19，23)突变而来的丙氨酸(SEQ ID NO7，10，20，24)。另外，本发明的多肽也含有一种或多种氨基酸序列，其中有SEQ ID NO8，SEQ ID NO11，SEQ IDNO21，SEQ ID NO25，分别代表了从人类C/EBPβ中266位上的苏氨酸(野生型，编号为SEQ ID NO6，9，19，23)突变而来的谷氨酸(SEQ ID NO8，11，21，25)。
本发明提供的方法和制剂也适用于抑制细胞的活化和/或增生。这些方法和制剂可优先适用于抑制肝脏星形细胞的活化和/或增生。本发明特别优先提供了一种方法，借此可采用含有217位点突变(从苏氨酸(Thr)变为丙氨酸(Ala))的C/EBPβ序列。另外，内源性磷酸酶与半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶Caspase1和Caspase8相联从而导致这两种酶的活化过程受抑。但是，当肽链经历了突变从而在其217位点上出现丙氨酸后，该肽链就能与野生型肽链竞争，从而促使Caspase活化，并导致细胞凋亡。
本发明提供了来自不同物种的经过修饰改变的C/EBPβ肽类制剂。某些情况下，鼠科动物C/EBPβ肽类在其217位上优先产生突变。这时候，鼠科野生型C/EBPβ上217位点的苏氨酸(SEQ ID NO2)有时被丙氨酸(SEQ ID NO3)置换，但有时也会被置换成谷氨酸(SEQ ID NO4)。而大鼠C/EBPβ肽链上发生的突变则常见于105号氨基酸位点上的绦氨酸(SEQ ID NO10)有时会被置换成丙氨酸(SEQ ID NO11)，有时则被置换成天冬氨酸(SEQ ID NO12)。而人类C/EBPβ肽链上的突变常优先发生在其266号氨基酸位点上。当人类野生型C/EBPβ肽链上266位点发生突变时，该位点上的苏氨酸(编号分别为SEQ IDNO6，SEQ ID NO9，SEQ ID NO19，和SEQ ID NO23)有时被丙氨酸(SEQ ID NO7，SEQID NO10，SEQ ID NO20，和SEQ ID NO24)置换，但也可能被置换成谷氨酸(SEQ IDNO8，11，21，25)。
本发明也注意到发生在其他物种的C/EBPβ肽链上的突变。对这些修饰过的C/EBPβ肽链的唯一要求是这些肽链的修饰改变要能诱导或防止细胞凋亡发生在那些感兴趣的细胞，包括癌细胞，和组织中。而特别值得关注的是，细胞凋亡的诱发往往导致减少(即缩小)，消除和/或防止感兴趣细胞或组织的纤维变性。更进一步值得注意的是，这种细胞凋亡的诱发常能导致癌细胞的减少和/或消除，和/或减少或防止癌细胞转移。而另一个值得关注的则是，改变后的C/EBPβ肽链也可用于诱发纤维变性(例如促进创伤愈合)。
在某些特定的场合，本发明提供了经过改造的CCAAT/增强子结合蛋白，而该蛋白能诱导产生细胞凋亡。这些CCAAT/增强子结合蛋白优先选自一组经改造过的人类CCAAT/增强子结合蛋白，以及经改造过的小鼠CCAAT/增强子结合蛋白。而更常见的情况是，这些结合蛋白的特定氨基酸序列中往往选择了下一组氨基酸编码，其中包括SEQ ID NO3，4，7，8，11，20，21，24和25。
本发明也提供了诱导细胞凋亡的方法，即通过多个步骤来将至少有一个经过修饰的CCAAT/增强子结合蛋白运用到至少一种细胞中。这里，较为优先涉及的细胞是一种间质细胞。进一步涉及的细胞则是选自这样一组细胞，包括肝，肺，肾，皮肤，肌肉，心脏，神经胶质，眼和血管等脏器组织的细胞。本发明的某些特别的优先选择范围是，通过上述方法的实施，可以防止纤维变性。而另一种优先选择权是，上述诱导细胞凋亡的方法已被用来诱导肿瘤细胞的凋亡。
本发明提供的诱导细胞凋亡的方法，是在某些条件下，将前述CCAAT/增强子结合蛋白用来处理某一实验主体，由此该主体的内源性磷酸化肽链分子可至少抑制主体的一种caspase。在某些优选的选择范围内，该方法的实施可导致相关主体内被选择细胞的凋亡。本发明的某些特别优先选择范围是，上述方法的实施将导致相关主体内的肿瘤细胞的凋亡。
本发明进一步提供了诱导细胞的方法，该方法的组成是至少采用被修饰过的CCAAT/增强子结合蛋白的某一部分，并将其施用于至少一种细胞，而这里涉及的被修饰过的CCAAT/增强子结合蛋白则选自一组被修饰过的小鼠、大鼠和人类的CCAAT/增强子结合蛋白。在更优先的应用场合，经修饰过的小鼠CCAAT/增强子结合蛋白序列上的突变位点是第217位氨基酸，而此217位点的突变氨基酸则选自由丙氨酸和谷氨酸组成的一组氨基酸。另一个优先的具体应用实施例是，经修饰过的小鼠CCAAT/增强子结合蛋白含有的某些氨基酸序列其编码为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。另外，经修饰过的人类CCAAT/增强子结合蛋白含有的一个氨基酸突变位点是在其序列的第266位，这里，266位点上的氨基酸是选自丙氨酸和谷氨酸组成的一组氨基酸。而经修饰过的人类CCAAT/增强子结合蛋白含有的某些氨基酸序列的编码为SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，和SEQ ID NO11。然而经修饰过的大鼠CCAAT/增强子结合蛋白含有的突变位点在其序列的第105位，在此105位上的氨基酸是选自丙氨酸和天冬氨酸组成的一组氨基酸，其序列编码为SEQ ID NO14和SEQ IDNO15。更优先选择的具体实例是，本发明涉及的细胞凋亡至少在一种细胞中诱导产生，而这种细胞只是选自下列一组细胞中的一种，这组细胞包括肝，心脏，肺，肾，眼，神经，肌肉，上皮，内皮，间质，和皮肤等脏器组织的细胞。其他更优先选择的具体实例是包括任何一种类型癌细胞也可被诱导产生细胞凋亡。较优先选择的应用实例是，上述细胞都存在于某一主体中 。进一步优先选用的实例是，这种主体是指一种哺乳动物。而在哺乳动物中又特别优先指定某一人体。而这里所涉及的人体是指患有纤维变性相关性疾病的人，而这里的纤维变性相关性疾病是指如下的一组疾病，包括肝病，脑损伤，心肌梗塞，动脉硬化，眼球纤维变性，纤维变性性皮肤病，及纤维变性性肺病。更进一步的具体范例是，上述凋亡诱导方法已用于诱导肿瘤细胞的凋亡。
本发明也提供了诱导纤维变性的方法，该方法包括至少采用一种被修饰过的CCAAT/增强子结合蛋白的一部分，将其作用于至少一种组织，这里所说的被修饰过的CCAAT/增强子结合蛋白是指一组修饰过的CCAAT/增强子结合蛋白中的一种，而这些结合蛋白则源自于小鼠、大鼠和人类。在某些优先选择的实例实施中，在使用上述CCAAT/增强子结合蛋白之前，至少有一种被选用的组织显示其愈伤过程已受到损害。而在某些应用实例中，由于采用本方法诱导纤维变性，则可使至少一种组织的愈伤过程得到改善。在特别优先选择的应用实例中，上述经修饰过的CCAAT/增强子结合蛋白其氨基酸序列编码表明是SEQ ID NO4。
本发明亦提供了抑制肿瘤细胞增生的方法。在某些优先选择的应用实例中，本发明的方法已用于那些带有对化疗和/或放疗耐受细胞的主体或病人身上。在某些条件下，采用突变的C/EBPβ肽类分子可对特定的肿瘤细胞的凋亡过程产生诱导作用，从而成功地治疗和/或预防肿瘤生长。本发明认为通过诱导肿瘤细胞凋亡将可达到控制肿瘤生长和预防或抑制肿瘤转移。
定义为有助于对本发明的理解，将对下列术语定义如下本文采用的术语“间质”是产生结缔组织，以及产生肌肉，血细胞和血管组织，上皮组织和某些腺体组织的具有起源特征的胚层组织。
本文采用的术语“基因”是指脱氧核糖核苷酸序列，该序列中含有一个结构基因的编码区，同时包括另一些序列分别邻接地位于该基因编码区的5’和3’端，并分别可延长到数千个碱基对，由此该基因对应于全长度信使核糖核酸的长度。位于编码区5’端的序列也可相应出现在信使核糖核酸中，被称为5’一端非翻译序列。而位于基因编码区3’端或下游区的序列当其出现在信使核糖核酸上时则被称为3’端非翻译序列。一个基因的基因组结构或克隆包含有编码序列，称为外显子，而非编码序列则称为“内含子”或称为“间插区”或“间插序列”。内含子一个基因序列中的部分片段，这些片段被转录为不均一核核糖核酸(hnRNA)。内含子有可能含有调节元件如增强子。内含子往往被从核转录物或初级转录物被去除或被“剪切出去”；因而内含子并不出现在信使核糖核酸(Mrna)转录物中。一个基因的基因组结构中除了含有内含子外，也可能包括一些序列，这些序列并不出现RNA转录物中，而却位于这些RNA转录物的相应基因序列的5’和3’端。这些不被转录的序列称为“旁侧”序列或区域(这些旁侧序列位于mRNA转录物上那非翻译序列的5’和3’端)。这里的5’旁侧区有可能包含调节序列例如启动子和增强子，这些调节序列将对基因的转录产生调控或影响。而这里的3’旁侧区域则游客能含有一些序列，这些序列有可能导致转录过程的终止，转录后的裂解和多聚腺苷酸化。
本文所用的术语“编码区”当其被用来表示一结构基因时，是指那些能编码相应的氨基酸的核苷酸序列，这里的氨基酸存在于以mRNA为模版进行蛋白翻译后产生的新生多肽链上。在真核细胞中，前述的编码区的5’端连接有一种核苷酸三联体“ATG”，该三联体编码蛋氨酸起始子，而在编码区的3’端则连接有三种终止密码子(即TAA，TAG，TGA)中的一种。
这里所说的“结构基因”是指一端为RNA或一种蛋白质编码的氨基酸序列。相反，“调节基因”则是另外一种结构基因，这些调节基因编码的产物(如转录因子)则负责调控其他基因的表达。
本文所用的术语“调节元件”是指一种基因元件，该元件对核苷酸序列表达的某些部位具有调控作用。例如，一种启动子就可作为一种调节元件能帮助起动一种可操作性连接的编码区的转录。另外一些调节元件是剪接信号，多聚腺苷酸化信号，终止信号，增强子元件等等。启动子和增强子构成一种短的DNA序列排列，并以此与那些涉及转录过程的细胞内蛋白质产生专一的相互作用[Maniatis ef al，Science 2361237(1987)]。启动子和增强子元件已从不同的真核细胞中分离出来，这包括酵母，昆虫和哺乳动物细胞的基因和病毒基因(类似的调控元件<即启动子>也都在原核细胞中发现)。一种特定启动子和增强子的选择取决于哪种类型的细胞将被用来表达感兴趣的蛋白质。某些真核细胞的启动子和增强子具有广谱宿主类型，而另一些启动子和增强子的功能表现则只能表现只限于某些细胞亚群。[参见综述Voss et al.，Trend Biochem.sci.，11287(1986)；和Maniatis，et al.，Science 2361237(1987)]。例如，SV40(猿猴病毒40)的早期基因增强子在多种哺乳动物细胞类型中有很强活性，同时已在哺乳动物的细胞中广泛用于蛋白质的表达[Dijkema.etal.，EMBO.4761(1985)]。其他关于启动子/增强子元件在广谱哺乳动物细胞中表达活性的范例来自人类延长因子Ia基因[Uetsuki et al.，J.Biol.Chem，2645791(1989)；Kimet al.，Gene 91217(1990)，和Mizushima和Nagata，Nucl.Acids.Res.，185322(1990)]以及劳氏肉瘤病毒的长末端重复单位[Gorman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA796777(1982)]以及人类巨细胞病毒的长末端重复单位[Boshartet al.，Cell41521(1985)]。
“启动子元件”或“启动子”用来表示一段DNA序列，该序列位DNA多聚体中某一基因的5’端(即前端)并为基因转录至mRNA提供了一个起始位点。
“感兴趣的基因”和“感兴趣的核苷酸序列”分别表示任何一种基因或核苷酸，为了某种原因可采用文献记载的常规技术即可对这种基因或序列进行操控并获得理想的结果。
“表达载体”在这里表示一种重组的DNA分子，该DNA分子含有一种理想的编码序列和适宜的核酸序列，这种序列对于能进行人为操控加以连接的编码序列在一特定宿主机体内的表达是必需的。在原核生物中，基因表达所必需的核酸序列包括一种启动子，一种非必需选择的操纵子序列，和一种核糖体结合部位，以及其他可能的序列。而在真核细胞中，已知的为基因表达所必需的核酸序列包括启动子，增强子，以终止信号和多聚腺苷酸化信号。
“修饰”一词表示对一种核酸序列的任何一种结构的改变。核酸结构上的改变包括核酸链上共价键和非共价键的改变。这些变化可表现为突变，误配，链断裂，和核酸序列之间，及核酸与其他分子之间的共价和非共价相互作用(这里的核酸序列包括未修饰和/或已被修饰的核酸序列)。核酸序列之间及核酸序列与其他分子之间的共价作用可对一个核苷酸的碱基带来变化(如形成一种胸腺嘧啶乙二醇)，另外，双链DNA序列之间也可产生共价交叉连接，例如通过紫外线和顺帕的作用可导致这种情况发生。另外，共价相互作用也可发生在核酸序列与其他分子之间，例如可通过紫外线的作用将两条核酸序列共价结合到补骨脂素分子上。核酸序列与另一种分子之间的非共价相互作用包括核酸序列与一种非核酸的分子的非共价相互作用，和核酸序列与另一种非多肽的分子之间的非共价相互作用。核酸序列与非核酸和非多肽的分子之间的非共价相互作用表现在双链DNA片段与溴乙锭或补骨脂素之间的非共价相互作用。本发明认为那些改变功能特征的修饰作用也常常会改变这些功能分子的表现形式。
“等位基因系列”在本文中用来表示基因的野生型序列。“等位基因系列的修饰”则表示某一基因的两种以上的核酸序列，而这两种以上的核酸序列中，每一种序列相对于其野生型基因的核酸序列来讲，都至少存在着一种修饰特征。
“突变”在此表示缺失、插入或替换。“缺失”一词定义为由丢失一个或者多个核苷酸后导致的核酸序列变化。“插入”或“添加”则表示在一条核酸序列中增加了一个或更多的核苷酸。“替换”则表示野生型核酸序列的一个或者多个核苷酸分别被置换成不同的核苷酸。例如胸腺嘧啶被置换成胞嘧啶，腺嘌吟，鸟嘌吟或尿嘧啶。或者一种核酸被修饰过的核酸所取代，例如胸腺嘧啶被胸腺嘧啶乙二醇所置换。
“误配”一词表示两条核酸链之间未按照碱基配对原则进行的非共价相互作用，因而这两条链各自都结合到了错误的核酸序列上。由此出现了部分互补的序列，如5’-AGT-3’和5’-AAT-3’之间，出现了G-A误配。
“核酸”和“未修饰核酸”在此表示四种脱氧核糖核酸碱基中的一种(即鸟嘌吟，腺嘌吟，胞嘧啶和胸腺嘧啶)。“修饰核酸”则表示相对于未修饰核酸，其结构已发生改变的核酸。而这种修饰的实例有可能包括碱基的置换性共价修饰，如氨基和环氮的烷化，及双键的饱和。
“修饰性细胞”是指该细胞的基因组序列中至少含有一种修饰。
“核酸序列-修饰剂”是指那些能使一种核酸序列产生至少一种修饰过程的试剂。這包括但不仅限于化学物[例如N-乙基-N-硝基脲(ENU)，甲基亞硝基脲(MNU)，前卡巴丁鹽酸(PRC)，三乙烯蜜胺(TEM)，丙烯酰胺單體(AA)，苯酸氮芥(CHL)，左旋苯丙氨酸氮芥(MLP)，環磷酰胺(CPP)，二乙基硫酸(DES)，乙基甲烷磺酸酯(EMS)，甲基甲烷磺酸酯(MMS)，6-硫基嘌呤(6MP)，絲裂霉素-c(MMC)，前長巴丁(PRC)，N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，重水(3H2O)，和尿烷(UR)]，和电磁辐射(例如，X-线辐射，γ辐射，和紫外线辐射)。
“野生型”一词当用来说明基因时，是指自然条件存在的基因。该基因在一个群体中的出现频率最高，因此被确定为基因的“正常”或“野生型”结构。与此相反，“修饰过的”或“突变的”则表示基因或基因产物在其序列和/或功能特性上发生了改变(即形状改变)，这种改变是相对于野生型基因或其基因产物而言。已注意到存在着自然条件下发生的突变，已有事实证实了这一点。本发明在某些优先选择的应用实例中证实，经修饰的基因产物确实能诱导产生细胞凋亡或纤维变性。因此在更进一步优选的具体使用中，本发明提供的经修饰的C/EBPβ可适宜于诱导纤维变性组织产生细胞凋亡，由此，对纤维变性的不利后果产生了预防，减轻和消除作用。进一步的实例是，经修饰的C/EBPβ也可用于诱导纤维变性，由此，那些以来于纤维变性的过程(如愈伤过程)得到了促进。
“β-增强子结合蛋白(C/EBPβ)的变异型”在本文中用来定义一种与C/EBPβ野生型序列相比，其氨基酸序列中有一或多个氨基酸出现了差异的C/EBPβ。C/EBPβ的变异型也包括“修饰性C/EBPβ”的蛋白质和多肽。在某些具体条件下，变异性多肽(即修饰性多肽)也许会有保守性变化，即在这种变异中，某些替补氨基酸也具有相似的结构或化学特性(如亮氨酸与异亮氨酸相置换)。更少发生的情况是，一种变异性(即修饰性)多肽具有“非保守性”变化(如甘氨酸与色氨酸之间的互换)。类似的次要变异包括氨基酸的缺失或插入(即添加)，或两者同时存在。可通过已知的计算机程序帮助决定哪些和多少氨基酸残基可被替换、插入或丢失而不丧失其原有的生物和免疫活性，如DNAstar软件。在某些特别优先的场合，野生型小鼠C/EBPβ的127位点上的苏氨酸可被一种丙氨酸或谷氨酸替换。在更进一步的具体实施中，大鼠野生型C/EBPβ的第105位点的绦氨酸可被一种丙氨酸或天冬氨酸所替换。而更进一步，则可用丙氨酸或谷氨酸来替换人类野生型C/EBPβ第266位点上的苏氨酸。
“瘤”和“肿瘤”是指与对照组织相比具有生长速度快特征的组织。瘤有可能是良性的，但不限于此，例如，瘤包括血管瘤，神经胶炙瘤，畸胞瘤等。
瘤也可能转变成恶性的，如一种癌瘤，肉瘤，神經胶質因細胞瘤，星形細胞瘤，神经母细胞瘤，視網膜因細胞瘤，等等。
惡性瘤”和“恶变肿瘤”是指一种至少含有一种癌细胞的瘤。“癌细胞”是指经历了早、中、晚期等多步瘤形成发展的细胞。已用显微镜图象描述了这种新生物发展的早、中、晚期特征。癌细胞在这三个发展期均普遍存在异常染色體組型，包括移位，倒置，缺失，异染色体，单体，和染色体增多。癌细胞包括“增生殖細胞”即处于恶变发展早期的细胞，“發育不良细胞”即处于瘤形成发展中期的细胞，而瘤形成细胞则是指处于廇形成发展的晚期细胞。瘤形成细胞具有典型的侵入性，即这些细胞既可侵入临近组织，也可以原位脱落，然后随着血液和淋巴转移到别的部位，并在新的部位开始形成一个或多个次级癌症，这被称为“转移”。因此，“癌”在这里表示一种恶变的瘤，这种恶变的瘤可能是转移性的，也可能是非转移性的。
本发明并不指望只限于针对某一种特定类型的癌症或癌细胞。用本发明提供的方法可以去治疗和鉴定的恶性瘤，包括一大类癌，例如肺癌，乳癌，前列腺癌，宫颈癌，胰腺癌，直肠癌，卵巢癌，胃癌，食管癌，口腔癌，舌癌，牙床癌，皮肤癌(如黑色素瘤，基质细胞癌，卡波氏肉瘤等)，肌肉癌，心脏癌症，肝癌，支气管癌，软骨癌，骨癌，睾丸癌，肾癌，内膜癌，子宫癌，膀胱癌，骨髓癌，淋巴瘤，脾脏癌，胸腺癌，甲状腺癌，脑癌，神经细胞癌，間皮瘤，胆囊癌，眼部癌(如角膜癌，眼色素層癌，脈絡膜癌，斑癌，玻璃體液癌等)关节癌(例如滑液癌)，成胶質細胞癌，淋巴癌和白血病，肉瘤(例如骨肉瘤和卡波氏肉瘤)是恶性瘤的另一种类型。
“怀疑有”一词用来针对某一研究主体的临床或病理状况(如癌症，纤维变性等)时，是指一个病人或研究对象被诊断为带有某种临床或病理症状，这些病人或主体在一次或多次诊断试验中均被出有阳性反应，从而被怀疑有某些特定的临床或病理症状，而这些病症的出现可能涉及某些原因(如暴露于某些环境化学因子，行为方式，遗传倾向，等)。
“對癌症易感的”是指一主体或病人具有一种或多种致癌危险因子，近期接受了癌症治疗，或曾被诊断出癌症，现在处于緩解期。
“癌症切除手术后”是表示用手术将病人之癌组织切除后一段时期。
“癌症复发”，是指病人正经历癌症的复发，或由于癌症引起的疾病的复发。这种复发即可是同类型癌症的复发(即涉及到前先前類型的癌細胞)，以及次級或進一步衍生的癌症，涉及到不同類型的癌细胞。
“生物制劑”是指一種在診斷和成像方面具有某些用途的試劑，且該試劑可作用於一種細胞，器官或機體，這包括但不限於藥物(如藥劑)去導致這些细胞，器官或機體的功能產生變化。
“様本”用在這裡具有廣泛的含義，它可用来表示一種用於治療的製劑，也可表示某種來源的標本或培養物。生物様本有可能取自動物(包括人類)也包括組織(如活檢様本)，液體，固體，組織和氣體。生物様本也包括血產品，如血漿，血清等等。但本發明應用的様本但不仅限于这里的范例)。
“化疗剂”在这里表示抑制瘤形成细胞病理微生物细胞生长，或降低其存活率，或抑制病毒扩增(这并仅限于复制、组装或细胞感染)的制剂。本发明定义的化合物包括天然产品的纯化品，也包括人工合成和半合成化合物。因此，本发明提供的化合物并不仅限于某一特定制作方法或某一特定来源。
“化合物”表示任何一种化学实体、药剂、药物，及能用来治疗或预防某种疾病和机体功能失调的物质。化合物同时包括已知的和有潜在治疗作用的化合物。一种化合物是否具有治疗作用可通过本发明提供的方法来加以选定。一种已知的治疗性化合物”表示一种治疗性化合物对疾病的治疗作用已被证实(例如已通过动物实验或过去人体中运用的经验)。换言之，一种已知的治疗性化合物并不仅限于在治疗癌症时有效。
“试验化合物”是指任何一种化合物实体，制剂，药物，及能用来治疗和预防某种疾病和机体功能失调后的物质。试验化合物同时包含已知的和具有潜在治疗作用的化合物。一种试验化合物是否具有治疗作用可经由本发明提供的方法来筛选和确定。一种“已知的治疗性化合物”是表示一种治疗性化合物的治疗和预防作用已被证明是有效的(例如已通过动物实验或先前在人体中使用的经验)。换言之，一种已知的治疗性化合物并不仅限于能有效于地治疗纤维变性。
当一种化合物有可能通过任何一种理想的途径(如口，静脉，皮下，肌肉等)来施用于一种哺乳动物，以及当这种化合物或其活性代谢物出现在哺乳动物的血液中时，这种化合物应是以一种适合施用于哺乳动物的形态存在。将一种化合物施用于怀孕的雌性哺乳动物类时，有可能导致该化合物被传递到妊娠个体的胎儿体内。
本文所用的一种XXX，包含了一种特定的多聚核苷酸序列的制剂被用来广义地表示任何一种含有特定多聚核苷酸序列的制剂。这种制剂有可能含有一种水溶剂。含有编码人类，小鼠和或大鼠C/EBPβ或其部分片段的多聚核苷酸序列有可能被用来作为一种包含有杂交针的制剂。在这种应用场合，含有C/EBPβ一编码序列的多聚核昔酸将典型地溶于一种含有盐类(如氯化钠Nacl)，去污剂(如十二烷基硫酸钠)和其它化合物(如登哈特溶液，干燥奶粉，鲑鱼精子DNA等)。
本文所用“药物学制剂”是表示任何一种适合用来治疗和预防某一研究主体的疾病的制剂或化合物。本文认为这种制剂包括能有效减轻或消除疾病征兆和症状的药物。本发明并非只限于针对任何一种特定的剂量或施用策略。本发明认为该“药学制剂”可采用各种不同的使用方法，包括，但不限于这些药物处理方案，即在使用过程中，一种合并使用的药学制剂将通过各个不同的药物载体(如各自独立的药性、药丸、药液等)。
本文所用术语“有效治疗剂量“是指治疗剂能抑制瘤细胞生长，或降低其存活时所需的剂量。
本文所用“亚治疗剂量“是指在不期待完全破坏细胞时所使用的一种药剂浓度或剂量。
本文用“抗增生”一词来表示一种治疗剂可对异常细胞的生长产生抑制或阻止的作用，但并必要将其杀死(虽然它也可能将其杀死)。
本文用“细胞毒”药物或试剂来表示那些能在治病过程中引起细胞死亡的治疗剂。在某些优先的应用领域，细胞毒药物对迅速分裂的细胞特别有效。
“IC50”一词在本文用来表示达到50％细胞毒性的浓度，即半数细胞毒浓度。细胞毒性可采用文献报道方法来加测定。参考文献为Alleg etal，cancer Res，48589-601，1988，或Scudiero efal，Cancer Res，484827，1988，或通过任何一种文献中已知的适宜的方法。在某一具体应用中，细胞毒性的测定是基于观察到线粒体酸活性降低到一半时所用的药物浓度。
“主体”一词在本文中表示任何一种可能任何病症发展的动物，当采用常规技术来确定这些病症的发展时将需要(为了某种理由)应用本发明提供的方法。在某些优先的具体应用中，这种主体可以是任何一种能接受某种药物制剂治疗处理的活动物。优先情况下，这种主体是一种哺乳动物，更优先的场合，哺乳动物包括，但不限于人类和非人类的动物如猿猴類，啮齿类，綿羊類，牛類，反芻類，兔類，猪，山羊類，馬類，犬齒動物，猫科動物，鳥類等优先选择的非人类动物是某些啮齿类动物(如小鼠和大鼠)。因此，本发明提供的化合物有可能被人类健康专业人员和兽医工作人员所采用。
“丙型肝炎”一诩在本文中用来表示丙型肝炎病毒，这是一种单链RNA病毒，它具有含脂的包囊，并被认为是Flavivirus家族的成员之一。这包括了各种形式的丙型肝炎，其中有急性丙肝和各种形式的慢性丙肝(如慢性活动性肝炎和慢性頑固性肝炎)。
“丙肝症状”在本文泛指临床表现，实验室和图象结果，以及在主体身上显示具有丙肝特征的肝脏形态和组织池。临床表现可能包括但并不限于，腹痛，黄疸，肝脾腫大和腹水。实验和图象结果可包括，但不限于，血清转氯酸升高，膽紅素升高，和伽瑪球蛋白水平升高，及在计算机图象，磁共振图象和肝超声波图象中显示的肝脏要大。丙肝的肝形态和组织学档标可包括，但并不限于，在肝组织活检中发现有纤维组织沉积的证据。
“纤维变性或纤维化”一词本文中用来表示一种补偿性或反应性过程导致的纤维组织形成，这种情况发生于继创伤、发炎和/或感染后，正常组织被取代，从面形成疤痕组织的过程中，在某些情况下，纤维性一词也表示正常的平滑肌被纤维化结缔组织所取代。纤维变性过程能发生在任何一种组织中，并能将其作用涉及到局部或更广泛区域。局部纤维变性可能含并梗塞、脓肿、支氣管擴張，和/或其他病理症状。
“细胞凋亡”一词表示细胞死亡。特别是指区别于细胞坏死过程的程序性细胞死亡。在此凋亡过程中，细胞会经历一系列变化，最终导致细胞降解为凋亡体，进而此凋亡体由其他细胞进行经典的吞噬。有文献报道指出，降低凋亡水平会导致细胞存活，并不必需(虽有其可能)促进细胞增生。细胞凋亡的测定可用已知的文献方法进行。例如，通过测定与存在于细胞浆膜的磷酸绿氨酸相结合的V型膜联蛋白的量来鉴定凋亡过程。V型膜联蛋白量的增加是凋亡的一项早期指标(Rudel And Bokoch，前面述及)(见图1中的C组)，这可通过显微镜活体观察(见图1C组)或螢光繳活性细胞分選(FACS)技术观察绿色盈茶青蛋白，这一转染指标和膜联蛋白V之间的消长关系。另外，如本文提及的，也可通过何切斯特(Hoechsf 33342)染色进行细胞核染色来鉴定细胞凋亡。
词组“纤维化症状指标”是用来表示存在于任一组织中的纤维变性及具有的形态学和/或组织学指标。在特别优先的实例中，“肝纤维变性”是指涉及肝纤维变性的形态和/或组织学指标。这些指标包括但不限于，肝活检中发现的纤维化组织沉积证据，和通过苯二酰二醛-加合物(MDA-adducts)升高发现的活化的连续性纤维形成，星形细胞活化，及鳥成髓細胞白血病病毒致癌基因(c-myb和X1(I)型胶元蛋白的RNA在星形蛋白中的增强性表达。
“治疗制剂”在本文中表示这样一种制剂，即其所含之化合物能以一种从药物学观点接受的形式存在，同时又能防止和/或降低纤维变性，这种纤维变性包括但不仅限于肝纤维变性，治疗性制剂的剂型特征将到取决多种因素，这包括治疗剂的施用模式。该治疗剂中有可能含有稀释刘，佐剂和形剂，及其他成分。
“非肠道进行地”在本文中用来表示对治疗主体用药时，药物的施用是通过除胃肠道或肺之外的途经进行的。常用的非肠道用药途经包括但不限于靜脉内，肌肉内、和皮下组织。
“治疗剂量”和“有效剂量”，及类似术语是用来表示这样一种剂量，即用此剂量时，一种化合物或配制物能成功地防止纤维变性的症状发生，和/或减轻其症状。一种治疗制剂的有效剂量可能由多种因素决定，这些因素包括主体的年龄、免疫状态、种族和性别，和纤维化的严重程度及其他与生物学变异性相关的因子。
“非人类动物中一种可用于遗传工程操作的基因组”是本发明通过对非人类动物生殖系基因组进实验操作特别制造的，这些遗传工程性非人类动物也许可通过不同的方法产生，包运用一种“转基因”技术即使核酸(通常是DNA)通过如同本文述及的人为干涉的方法将其导入一种非人类动物胚胎的靶细胞和/或者整俣进非人类动物之体细胞和/或生殖系细胞的染色体。含有一种转基因的非人类动物称为“转基因动物”。转基因动物就是那些其基因组织被采用转基因技术加以改变的动物。
“转基因”是表示将一种外源基因置入了一种生物体。这是通过将此外源基因导入一种新的受精卵或早期胚胎后获得的。“外源基因”表示任何一咱通过实验操作被导入某一种动物的基因组的核酸(例如基因序列)这也包括那些在动物中发现瑟自然条件下的基因相比，存在位点发生了变化的基因序列。
“非人类哺乳动物表达的实变型C/EBPβ蛋白”和本文中用来表示一种在非人类哺乳动物来表达的与野生型相比产生了变异的C/EBPβ蛋白。所谓“丧失产生功能性C/EBPβ能力”的哺乳动物是指其C/EBPβ产生量处于检查不出水平上的哺乳动物(即C/EBPβ的产生量来超过所用检测方法的背景水平)。功能性C/EBPβ蛋白是这样一种C/EBPβ，其功能特征与野生型C/EBPβ相同，分子量也相同。人类C/EBPβ的功能性活性片段能以某种方式在体外和/或体内表现出与其全长C/EBPβ相同的功能。“功能上的活性”也包括与C/EBPβ蛋白相关的正常活性。
“改变”“改型”和“修饰”等词用来描述一种生化，生物或临床现象(如细胞凋亡细胞存活，细胞增殖，癌变，纤维变性，前半胱氨酰基天冬氨酸特异性激酶活性和活化及类似现象的改变)时，是表示该现象所处水平的质变(即增加或减少)。典型的细胞凋亡，存活，增殖，癌变，纤维变性，酶原活性及活化水平的测定可通过已知的文献方法及本文提供的方法。
“增加”，“上升”和“诱导”及其语文上相等的词汇，当用来描述一咱生化，生物或临床现象(如描述细胞凋亡，存活，增殖，癌变，纤维变性，前半胱氨酰基天冬氨酸特异性激酶活性和活化及相似现象的增加)时，是表示这此现象的原有水平发生了质的变化。而且更倾向于表示一种被任何一种被认可的统计分析方法认为有统计学意义的数量水平上的上升。在优先的应用场合，样本中出现了一种增强现象(如细胞凋亡，存活，增殖，癌变，纤维变性，前半胱氨酰基天冬氨酸特异性激酶活性和/或其活化的增强)是旨这些现象的数量上增加相对对照样本的相同现象来，至少高出50％，或10％，最好能高出50％或75％，甚至至少高出90％。
“降低”，“阻止”“减少”“抑制”及其在语法上的同义词当用来表示一种生化，生物或临床现象(如细胞凋亡，存活，增殖，癌变，纤维化，酶原活性，酶原活化及相似现象的减少)时，是指一种现象原有水平的定性(即主观上的)减少或降低，同时又倾向于表示该现象原有水平的数量上(即客观上的)减少或降低，这种量上的减少具有任何一种统计分析方法所认为的统计学意义。在某些特定的应用场合描述某一样本中，一种降低了的现象(如细胞凋亡，存活，增殖，癌变，纤维变性，前述酶原活性和/或其活化水平的降低)即是指相较于其他样本，最好是相较于对照样本来讲，这些现象在原有水平上所发生的数量上的变化，至少降低了5％或10％，甚至降低或减少了50％至70％，直到超过了90％。这种水平降低的现象并不必需某一现象完全缺失(即削除或排除)，虽然有此可能。本发胆并不要求也不限于涉及现象的完全削除。
“未降低”和“允许”当来手相术对任一现象的影响时，是表示该现象所处水平有可能上升或未生生改变。相反“未升高”则表示该现象所处水平可能降低或未发生变化。
例如本文所说的“减少”，是指纤维变性症状或其他症状在程度上有所减轻。通常这种程度的降低要通过客观指标来显示。例如，将用药前后的肝活检样本加以比较，即可指出肝纤维变性程度的降低。另外，症状的减轻也可通过主观指标来表示，发腹痛的减轻。
“肽”，“肽序列”“氨基酸序列”，“多肽”和“多肽序列”在本文中交换使用，以此来表示由至少两个氨基酸或其相似物通过肽鍵或其似鍵共价结合的产物。本文优先选择的肽类物质含有4到3000个氨基酸，进一步优造4至3000个氨基酸，然而更进一步优先4至500个氨基酸，接下来更优先4-100个氨基酸，4-50，4-25，4-20，4-10，直至4个氨基酸长度的肽类。肽类包括氨酸，多聚氨基酸或其相似物。肽类也包括常说的通常含有2个或20个左右的肽类。肽类也常用来表示含有20个左右到50个左右氨基酸的肽。肽类也包括从大约50至3000个左右的氨基酸的肽。构成肽的氨基酸可是左旊氨基酸也可是右旊氨基酸。一种肽，多肽或蛋白质，可能是人工合成的，重组的，或自然发生的。一种合成的肽是在体外用人工方法生成的(例如不是在体内合成的)。
“细胞增殖“在这里用来表示细胞在经历细胞分裂对所表现的生理学和形态学方面的进展性变化，细胞周期普通认为可分为“间期”，“前期”“中期”“晚期”，和“末期”。另外，也把细胞周期命名为“M(分裂期)，“S”(合成期)”，“GO”“GI(间隙期1)”，和“GZ(间隙期2)”。另外，该细胞周期也包括上述各期之间的过渡期。细胞增殖的水平可通过已知文献方法来确定。例如，细胞可与澳化脱氧尿嘧啶(Brdu)，这种澳化脱氧尿嘧啶可掺入分裂细胞的DNA，然后可通过免疫组化方法来检测到这种掺入过程。如本文所述，增殖指数可按样本中上皮细胞总数中Brdu-阳性小泡的百分率来计算(参见图3)。另外，哺乳类上皮细胞 的增殖水平通过用针对增殖细胞核抗原的抗体对组织片染色来确定。
当“结合到、、、、上”，“与、、、相联”，“与、、、相互作用”，用来描述本发明的某一多肽或其他多肽(如蛋氨酸特异的绿氨酸激酶酶原1和8)时，是表示两种多肽之间通过非共价銉进行的某种相互作用。本文说明的方法可用来测定一种多肽和上述的酶原之间的结合，如图3.C组所示，上述酶原1和8与C/EBPβ和C/EBPB-PTHR217的相联在C/EBPβ小鼠用四氯化碳(CCl4)处理时有所增加。
“特异性结合”，“结合的特异性”及其语法上的同等词汇当用来描述本文的多肽和第一种多肽(如上述酶原1和8)时，是表示本发明的多肽优先性地。上述第一种多肽的相互结合作用，这是相对于本发明的多肽与除上述第一种多肽以外的多肽相互结合而言。特异性结合是相对的，它并不要求绝对的特异性结合，换言之，“特异性结合”并不要求本发明的多肽，在与不同于第一种多肽的第二种多肽之间相互结合的条件下也要与第一种多肽相互结合。相反，当本发明的多肽与上述第一种多肽的相互结合水平来更高时(即至少高出10％，最好至少高出20％或更进一步高出50％，以至高出75％，直至高出90％)。本发明的多肽与上第一种多肽的“特异性结合”提示这种结合是依赖于存在于本发明多肽和/或上述第一种多肽上的独特结构；换言之，上述第一种多肽可以识别和结合到本发明之多肽的独特结构上，而不是普通的多肽或基酸上。例如，假设本发明多肽对存在于上述第一种多肽上的“A”结构是特异的，那么另一种含有这种A型结构(或自由的未标记的A型结构)的多肽序列在加入需要有“A”型结构参与的反应时，这种多肽将降低其“A”型结构与本发明多太的结合量。
“活化的”一词用来上述酶原时，是指该酶原自身裂解活性的增强。上述酶原活性的测定可由本发明的方法来进行。例如，在图3D组中，戥细胞裂解液中的上述酶源1和8的活性有所增加，这种星形细胞裂解液来自用CCL4处理的C/EBPβ-/-和C/EBPβ-ALA217小鼠，而不是来自C/EBPβ-/-小鼠“磷酸爱体部位”和“磷酸受体域”和“磷酸爱体氨基酸”用来表示一种氨基酸(如苏氨酸绿氨乙酸等)这种氨基酸位于一种序列中可以在一种磷酸激酶的酶活性作用下被磷酸化。
当“不能被磷酸化的”一用来描述一种肽序列中的一种氨基酸时，是指这种氨基酸不可能被磷酸激酶的酶活性催化产生磷酸化。、“细胞”，“至少一种细胞”和“细胞群体”是表示两个以上的细胞。
在本说明书及随附的专利权要求中，单数形式的“a””an”和“the”包括多数参考物，除非本文有其他明确的说明。
本文中“Or”一词当用来表达“A”or B”时，即用A和B来表示一种制剂，疾病，产品等时，是表示一种，或另一种，或同时两种。
关于本发明的简要说明本发明总的来讲是涉及到对那些具有过度细胞增殖和/或活化特征的疾病的治疗和预防。特别要指出的是，本发明提供的制剂和方法可用本抑制多种不同细胞和/或增生。在某些优先的应用场合，本发明提供的制剂和方法用来抑制间质衍生性细胞(包括但不限于肝脏星形细胞)及具有异常生长特征细胞的活化和/或增生。在某些特别优先针对的应用场合，本发明提供的制剂和方法用来抑制或消除纤维变性。在加一些优先适用的场合，本制剂和方法用于诱导纤维变性。进一步具体的应用场合是，可将本发明的制剂和方法用来治疗和预防癌症。
前述CCAAT/增强子结合蛋白β(简称C/EBPβ)(Descombes efal，GenesDev.，41541-1551(1990)；和Akira ef al，EMBO J.，91897-1906(1990)可传递直肠癌细胞中由d-转化生长因子(TGFX)活化的由氧化應急反應和核抗体蛋白S-6激酶(RSK)导致的细胞增生效应(Chinery ef al.，Nat.med.，31233-1241(1997))，另外，在小鼠的初级细胞中也有相同情(Buck ef al.，mol.cell.，41087-1092(1999)).但C/EBPβ(LAP，NF-1L6)与细胞增生之间的关连机制还不清楚。然而，对这种机制的理解对于应用本发明并不是必需的。
ERK/MAPK信号传递途径的活化通过若干机制来促进细胞增生，包括促进核酸合成，基因表达，蛋白合成和细胞生长(Whitmarsh and Davis，J，MoL.，74589-607(2000))。MAPK对细胞生长的这些作用中，多数是由P90RSK介导的(Nebrda and Gavin，Science)RSK核粉核蛋白S-6激酶。
C/EBPβCCAAT/增强子结合蛋白β2861309-1310(1999))。RSK对促细胞凋亡蛋白(Pro-apoptotic Protein)Bcl-XL/Bcl-2相關性致死啟動子(BAD)有磷酸化和失活作用(Bonni ef al.，Science 2861358-1362(1999))；同时可通过環磷酸腺苷應答元件結合蛋白(CREB)的磷酸化和活化而对抗-细胞凋亡基因B淋巴细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的转录起增量调节作用(Bonnef al.，见上述)；也可通过组蛋白H3的磷酸化而诱导染色质的重建或重塑从而促进基因表达(Sassone-corsi ef al.，Science 285886891(1999))。
在应答上皮生长因子的作用时，上述細胞外調節涙酶/促細胞分裂激活蛋白激酶(ERK/MAPK)的连续放大作用对嘌呤核酸的全程含成起调节作用，而这需要通过活化的甲氨酰磷酸合成酶II来进行(Graves ef al.，Nafure403328-332(2000)).其它调整细胞生存和细胞周期的机制(Whitmarsh and Davis，J，Mol.med.，403255-256(1996))还包括a＞通过转录因子的磷酸化而使基因转录过程活化，(Whitmarsh andDavis，J.Mol.med.，74589607(1996))；Bhaff and Ferrell，Science 2861362-1365(1999))，组蛋白H3和高速泳动族14(HMG-14)的磷酸化也可活化转录过程(Sassenl-corsief al，前述Thomson ef al.，EMBO J.，174779-4793(1999))；b＞通过超始因子4E(elF-4E)的磷酸化来促进蛋白翻译(Pyronnef ef al.，EMBOJ.，18270-279(1999))；C＞通过增加细胞周期蛋白D1的表达，来促进DNA复制(Lavoie efal.，J.BIOL.Chem.，27120608-20616(1996)).RSK当其被磷酸化ERK/MARK活化后，将在ERK/MAPK信号途经调节细胞存活和细胞周期的过程中起到必不可少的作用(Bonni ef al.，前述；BHAFF AND Ferrell，前述；Gross ef al，Science 2861365-1367(1999))和Sassone-corsi af al.，前述)。因此，本发明的形成过程囊，曾对经由RSK介导的C/EBPβ对细胞存活作用产生兴趣。
在本发明产生过程中采用了小鼠肝脏的原代星形细胞，这是因为这些细胞对纤维组织的过量生产(Friedman，ef al.，Proc.Nafl，Acad.Sci.USA 828681-8685(1985)；andAnkoma-Sey，and Friedman，in Sfrain and Diehl(eds)，Liver Growth andRepair，Chapman & Hall，London，Pages 512-537(1998))是肝脏损害后发展为肝硬化过程中的一个关键步骤。(Chojkier，in Strain and Diehl(eds)Liver Growth and Repair，前述，af pages 430-450).另外，如同正常肝细胞一样，这些细胞可以保持静止状态(Leeefal.，J，clin，Invesf.，962461-2468(1995)；and Ankoma-sey，and Friedman前述)，但当将这些细胞培养在EHS(Mafregel)基质上时，它们又可在氧化應急反應的诱导下，由I型胶原或TGFa的作用下迅速活化和增生(L朋肝功。，前述；and Friedrhan ef al.，J，Brd.Chem.26410756-10762)。它们同是地能调整C/EBPβ对细胞生长的作用(Chinery efal.，前述；and Back efal.，(1999)，前述)。类似的情况是，星形细胞的活化也需缺氧压力的刺激，后者见于以下两种情况一是用CCL4引起实验性肝脏损伤(Houglum ef al.，J.clin.Invesf，962269-2267(1995)是由酒精，遗传性血友病，Porphyria和病毒性肝炎导致人类肝病(Chojkidr，前述)。但在本发明产生之前，并不了解依赖于肝星形细胞活化的生存需要由RSK时C/EBPβ(如小鼠C/EBPβ；(m)C/EBPβ)217位苏氨酸的磷酸化。如本文详述的一样，肝毒性CCL4诱导了RSK的活化，C/EBPβ上Thr217的磷酸化和正常小鼠中星形细胞的增生，但可引起C/EBPβ-/-和C/EBPβ-Ala217(一种阴性的不可被磷酸化的显性实变)转基因小鼠中这种细胞的凋亡。换言之，在CCL4的作用下诱导肝脏内产生缺氧压力，随之将导致细胞凋亡，但这不发生在C/EBPβ+/+的小鼠，仅见于C/EBPβ-/-或C/EBPβ-Ala217(一种不可能被磷酸化的实变)转基因鼠。进而发现，C/EBPβ-PThr217和与其磷酸化类似物C/EBPβ-Glu217，而不是C/EBPβ-Ala217，可在体内外与Procaspases1和8相缔合，从而抑制其活性。本发明形成苏氨酸过程中得到的数据提示C/EBPβ上Thr217的磷酸化产生了一种功能性XEXDCaspase底物/抑制物盒(Kphospho-T217VD).而它可与C/EBPβ-Glu217相似(KE217VD)。与此观察结果一致的是，C/EBPβ-/-和C/EBPβ-Ala217星形细胞可在细胞通生KE217VD四肽或C/EBPβ-Blu217的作用下免于细胞凋亡，对此本文将有更进一步详述。
本发明产生过程中所得之结果提示存在一种新的C/EBPβ机制，用以说明RSK对细胞生存下游过程的影响和对Procaspases1和8活化过程的防止作用(Thornberry andLazebnik，Science 2811312-1316(1998))。这些Caspases能活化下游效应及Procaspases(Earnshaw ef al.，Ann.Rev，BIOCHEM.68383-424(1999))。在星形细胞中的生理性相关信号途径，如CCL4对于小鼠和培养中的I型胶原(Friedman efal.，J.Biol.chem..，m26410756-10762(1989)；和Rudolph ef al.，Science 2871253-1258(2000))。将导致RSK的活化和内源性C/EBPβ上Thr217的磷酸化。C/EBPβ-PThr217，但不是非磷酸化的C/EBPβ，可缔合于Procaspases1和8(如同在受疫萤光和共免疫沉淀测出和体外直接与重组蛋白缔合一样)从而阻断细胞凋亡的连续放大过程，并让细胞得以生存。从而，目前的资料初步证明通过ERK/MAPK/RSK途经导致的转录因子的磷酸化将促进其与Procaspases结合，从而防止其活化。尽管C/EBPβ上Thr217的磷酸化可能造成一种功能性的XEXD caspase底物/抑制物箱(Thornberry etd.)J.Biol.Chem，27217907-17911(1997)；and Blanchard et al.，J.Mol.Biol.，3029-16(2000)解释了C/EBPβ的抗一细胞凋亡作用，但其确切机制的阐明仍需进行结构分析。但对其的理解并非应用本发明所必需。
C/EBPB-PThr217对Procaspases1和8活化过程的抑制需要在C/EBPβ的表达被诱导产生的条件下进行，例如正常星形细胞的活化或者由肝毒性CCL4处理小鼠后产生，或者由I型胶原基质在细胞培养中诱导产生。另外，当星形细胞来自C/EBPβ小鼠时，细胞调亡能诱导产生。
这些实验提示上述发现并非C/EBPβ过度表达的不和逻辑的结果。转基因鼠中C/EBPβ-Ala217的表达也能对暴露于生长刺激(CCl4对小鼠，胶原对培养细胞)下的星形细胞诱导产生细胞调亡相反，相似于C/EBPβ-Glu217的磷酸化突变体可使细胞避免由MEKKI，IKBα或RSK阴性显性突变或用蛋白体抑制剂Loctacgstin处理细胞诱导的细胞调亡过程(Chenet al.，Nature 374386-388(1995b)；Nakajima et al.，Cell 86465-474(1996)，Leeet al.，88213-222(1997)).C/EBPβ-Glu217在星形细胞中的表达也能防止FAS-诱导的细胞凋亡，该凋亡过程是活化的Procaspase8所介导(Ashkenazi and Dixit，Science2811305-1208(1998))，但不能防止Procaspase9活化过程介导的清除血清所诱导的细胞凋亡(Joza et al.，Nature 410549-554(2001))。这些结果揭示C/EBPβ-PThr217对细胞凋亡有选择性的影响。C/EBPβ的活化和而聚体区域并不为它对procaspases1和8的结合或抑制所必需。此外，在用星形细胞进行初步实验中，采用了一种含有C/EBPβ结合域的报告基因(Descombes et al.，前述，和Houglum et al.，J.Clm.Invest.，94808-814(1994))，但并未发现在野生型C/EBPβ和其Ala219磷酸化突变体两者之间转录的活化方面有何差别。
C/EBPβ-Glu217(KE217VD)与C/EBPβ-PThr217相似，因而肯定了当前流行的看法即Caspase的抑制物/底物四肽需要有某种结构。这种四肽需要一种天冬氨酸残基(D)位于其P1位点(Thornberry and Lazebnik，见前述)，这种天冬氨酸也出现在C/EBPβ第219位点即氨基酸D219(Cao et al.，Gene，Develop.，5 1538-1552(1991))。用一种位点扫描底物文库，已发现对Caspase8的结合来写最理想的序列是I/L/V(即异亮/赖/缬氨酸)(P4位点)EXD，尽管I，V，W，T，P和D(异，缬，色，苏，脯和天冬氨酸)也可被P4位点所接受，这是基于细胞凋亡连续过程的下游裂解位点而言(Thornberry et al.，见前述)。这些发现最近已通过对Caspase8的晶体图象的研究得到確認(Blanchard et al.，Supra)。虽然III族Caspases(包括caspase 8)更倾向小的疏水残基位于P4位点，然而热力学和晶体图象方面的研究还是表明只有DEVD这种特异II族抑制物，它在该位点的酶发生相互作用，而且它的抑制作用几乎与特异性III族抑制物異亮-沓-苏-天冬氨酸(IETD)相同(Blanchard et al.，前述)。C/EBPβ上的K216与D的疏水性相似(Boyle，et al.，Meth.Enzymel.，201110-149(1991))。此外，Blanchard等人认为Caspase8的S3是与四肽的P3(不是P4)发生相互作用的位点，也是其特异性的重要决定因素，因此最初对于Caspases的分类需要修改，特别的对于Caspase8来说要重新划分(Blanchard等人，见前述)。正如本发明观察到的那样，不仅C/EBPβ-9Thr217具有选择性作用特征，而且白喉毒素A片段(CrmA)也能选择性地抑制Procaspases1和8，而不是Procaspases3，6和7(Zhou et al.，J.Biol.Chem.，2727797-7800(1997))但其文献报告认为CrmA也能抑制Caspases 4，5，9和10(Garcia-Calvo et al.，J.Biol.Chem.，27332608-32613(1998))。另外，杆狀病毒(baculovirus)P35是对Procaspases1，3，6，8和10来说是一种潜在的但选择性相对较弱的抑制物(Anelrade et al.，Immun.，8451-460(1998))。本发明进一步的实验已表明C/EBPβ中K-Plospho-T217VD(或KE217VD序能有效地与ProcaspSES1和8结合从而阻断后者的活性。
本发明得到如下实验的强力支持，包括用C/EBPβ~细胞，Ala217阴性显性突变和Glu217阳性显性突变细胞，及C/EBPβ-Ala217转基因小鼠等研究对象所做的实验。C/EBPβ-Ala217突变与RSK结合后表现为一种阴性显性突变，这表现在经Ccl4和I型胶原分别处理后的细胞培养中和哺乳动物星形细胞增生之后。人工合成的AC-KA217VD-CHO肽促进星形细胞调亡，相似于C/EBPβ-Ala217和C/EBPβ216-256-Ala217的显性细胞突变效应。这些效应源于RSK的抑制和/或Procaspases1和8活化过程的增进，同时又促使其自身裂解。但对这种机制的理解并不为应用本发明所必需。
尽管γC/EBPβ具有一种自然发生的在217位点发生Ala和Thr之间的互换，但它也可在其105位点发生一种Ser和Ala之间的互换(Buck et al.，(1999)，见前述)。也曾观察到内源性γC/EBPβ的Ser105被磷酸化(即RSK的大鼠磷酸受体同源物)。γC/EBPβ-Asp105的阳性显性突变体的表达可有效避免RSK阴性显性突变体或用蛋白体抑制物处理所诱导的细胞调亡。PKCα或MAPK信号传递途径的活化导致了γC/EBPβ上Ser105的磷酸化(Trautwein et al.，Nature 364544-547(1993)；and Buck et al.，(1999)见上述)。另外，从γC/EBPβ-Asp105转基因小鼠分离得到的星形细胞对耐受lactocystin对细胞调亡的诱导。如同对C/EBPβ的描述，含有P-ser 105或其磷酸化类似物的γC/EBPβ均能与大鼠星形细胞结合。这些数据指出，尽管C/EBPβ或γC/EBPβ可在不同的氨基酸残基上发生磷酸化，但两种类型的磷酸化蛋白质均能有效避免由Caspase8介导的细胞调亡过程。
相反，不能被磷酸化的γC/EBPβ-Asp105突变体行为表现象是一种阴性显性(对照于C/EBPβ-Ala217突变体)，能诱导小黍和大鼠星形细胞发生调亡。γC/EBPβ-Pser105序列的类似物KKPD105在其P1位点含有不可缺少的D，和P2位点上有高度优先的P一样，作为粒酶B(granzyme B)的底物/抑制物XX-脯-天冬氨酸(XXPD)，就如采用人工合成的底物文库所决定一样(Harris et al.，J.Biol.Chem.，27327364-27373(1998))。起始物Caspases，Caspase8和granzyme B，分享了作为底物/抑制物的Procaspase3的IETD四肽序列(Thornberry，et al 1997，前述；Harris et al.，前述)，由此指出Caspases8也可能识别相关的XXPDA底物。这已被本发明的实验数据所证实。AC-KKPD105-CHO(γC/EBPβ)四肽片段能显著抑制C/EBPβ~小鼠星形细胞的调亡。
本发明产生过程中获得的数据涉及到间质细胞活化所导致的疾病，间质细胞导致一种过度的组织修复机制(如脑神经胶质纤维增生，肝硬化，肺和肾纤维变性)。在此叙述的结果指出C/EBPβRSK磷酸受体可被磷酸化的四肽片段适合用于治疗，由于它们对多种细胞在其活化后有诱导细胞调亡的作用。确实也观察到，C/EBPβ-Ala217转基因小鼠能耐受长期施用CCl4对肝纤维变性(包括肝硬化)的诱导作用。另外，由于IL-I被提示涉及急性神經變性病理发生过程(Rothwell et al.，J.Clin.Invest.，1002648-2652(1997))，因此，对Caspase1活化过程和它对IL-I前体的处理过程的抑制被认为能減輕与纤维变性和/或细胞调亡相关的疾病。
图1该图提供的数据表明肝脏星形细胞的存活需要基C/EBPβ中第217位上的苏氨酸被磷酸化。A组提供了一种磷酸化肽图谱，分别表示在培养第四天时，静止和活化的初级星形细胞体内标记的内原性C/EBPβ，这些星形细胞是从小鼠的EHS或I型交原基质中分离所得。箭头所示是活化细胞的肽序列中其第217位上含有磷酸化的苏氨酸。该结果指出I型胶原能诱导C/EBPβ第217位的苏氨酸的磷酸化。B组提供了体外标记的C/EBPβ的磷酸化肽图潽。活化的P90RSK对C/EBPβ产生磷酸化作用，但不是体外条件下的C/EBPβ-LA217(箭头所示)。C组提供的结果表示转染后的I型胶原对细胞培养的影响。如图所示，对I型胶原实施转染试剂包括鼠肉瘤病毒(MSV)-C/FBPB反意(AS)，MSV-C/EBPβ有意義(s)成MSV-C/EBP B-Ala217，同时加上巨細胞病毒绿色荧光蛋白(CMV-GFP)，以及核糖體S6激酶的90個氨基酸肽鏈片段(P90RSK)(每种试剂1Mg).转染后4小时开始测定膜聯蛋白-V-磷酸乙醇胺(annexin-v-PE)对浆膜的结合，测定值以annexin-V-PE(阳性)(红色)在转染细胞(绿色)中的百分比来表示(其中C/EBPβAS和C/EBPβ-Ala217转染后百分比的变化P值小于0.05)。D组中，细胞转染方法与A组相同，但所用的载体表达MEKKI，IkBa，或PQORSK的显性阳性突变，或用蛋白体抑制物勤克托塞斯汀Lactocystin(10pm)处理的细胞(实柱)和与MSV-C/EBPβ-Glu217(各1Kg)共转染的细胞(实白柱)见图示。Annexin-V-PE的结合按A组中速度的方法测定(其中C/EBPβ-Gla217的P值小于0.05)。E组提供的结果测定，细胞转染方法与C组同，但转染试剂为一种显性阳性的P90RSK，先用FS7相關表面抗原(FAS)(100n/h 6hour)处理细胞或在无血清培液先培养6小时(实柱)，以及与MSV-C/EBPβ-Gla217(各1μg)共转染的细胞，见图示。死亡细胞用HOECHSF 33342进行核染来测定(在RSK实变后的C/EBPβ-Gla217组和FAS处理组中，P值小于0.05)。
图2该图提供的结果表示，来自C/EBPβ-Gla和C/EBP B-Gla217转基因鼠的肝脏星形细胞，其细胞凋亡增加。A组结果涉及从C/EBPβ，C/EPPβ和C/EBPβ-Gla217小鼠中分离并培养在一种I型胶原基质中的初级星形细胞。培养6小时后对annexin-V-PE的结合进行测定(C/EBPβ和C/EBPβ-Ala217两组的P值小于0.05)。B组表示对上述(A组)细胞进行HOECHSF 33342核染的结果。此外，来自C/EBPβ-Ala217小鼠的细胞分别用以下试剂进行处理Caspase8的细胞通透性抑制剂(IETD)(1.05nM)或用MSV-C/EBPβ，C/EBPβ-Ala217，C/EBP B-Ala210，或RSK(各1Mg)，参见图示(其中C/EBPβ，C/EBPβ-Ala217，C/EBPβ217+RSK+C/EBPβ-Ala210组的P值小于0.05)。C组提供的数据则为，上述A和B组中对初级星期细胞进行annexin-V结合和线粒体传感器及Hoechst 33342核染测定提供了典型范例。如图所示，来自C/EBPβ-Ala217小鼠的星形细胞显示了增强的annexin-V-PE结合特性，线粒体传感器的测定值也发生改变，同时丧失了细胞核的完整性。箭头标示了凋亡细胞。
图3该图提供的结果表明C/EBPβ-Thr217与蛋氨酸特异性纷氨酸激酶1和8相关联。A组结果用来表示，通过采用共聚焦显微镜和神经胶的纤维酸性蛋白(GFAF)，可展示来自C/EBPβ-Ala217面不是C/EBPβ+/4R小鼠经CCL4处理12小时后，其肝脏星形细胞中Caspase3的活化。GFAβ共聚点和活化的Caspase3由箭头所示。星号指示C/EBPβ+/+小鼠中状小管腔。当GFAP抗体被去除后才能观察到背景染色(红色)。矿物油不能引起变化。B组数据表示PGORSK与C/EBPβ的关联大在增加。这些结果显示，通过对C/EBPβ+/+，C/EBPβ-Ala217，和C/EBP+/+(对照组)蛋白不解液(500Kg)的免疫沉淀，并对RSK作进一步的免疫印证实验，样本的描述A组。用CCL处理C/EBPβ+/+和C/EBPβ-Ala217小鼠，可导致从这些小鼠中分离的星形急匆匆RSK关联性升高。用CCL4处理C/EBPβ+/+和C/EBPβ-Ala217小鼠，可使C/EBPβ-PThr217与RSK的关联性和活化的RSK-磷氨酸380(PSer380)(在RSK免疫沉淀实验中)的关联性增加。C组结果表示，用CCL4处理C/EBPβ+/4小鼠，可增加前述激酶克1和8与C/EBPβ和C/EBPβ-PThr217的关联性(表现在C/EBPβ的免疫沉淀中)相互交换的免疫沉淀也证实了这些关联性。D组结果则表示当星形细胞是来自经CCL4处理的C/EBPβ-/-和C/EBPβ-Ala217小鼠，而不是C/EBPβ+/+小鼠时，其上述激酶活性得到增强。Caspase活性通过每一小时点上5×10 6个细胞释放出的生色底物来测定。测定值表示为平均值士Caspase1和Capase8活性的三管变异范围的一半，实验小鼠经CCL4处理(未处理小鼠的基础值用作校正)。
图4该图提供的数据显示C/EBPβ-PThr217与Pro-Caspases1和8结合并抑制后者的活化。A组提供了C/EBPβ肽类的图示说明。图中表示了活化域(虚线杆)，DNA结合域(实线杆)，二聚体域(格子杆)。B组表示星形细胞转染后的结果，转染剂为指定的粒联园CMV-GFP(各0.3Mg)，转染后培养于I型胶原基质(C/EBPβ-216-256-Ala217和RSK实变组的P值＜0.05)。C组结果显示在活化的星形细胞中检测到C/EBPβ和PROCASPASE8，星形细胞分离自C/EBPβ+/+小鼠，检测时采用了共聚焦显微镜和特异抗体(抗体购自Santscro Bio-techontegg).对照组为C/EBPβ-/-星形细胞，该细胞为C/EBPβ阳性，Procaspase8阳性，并可被诱发细胞凋亡，D组提供了免疫印迹结果，实验中用表达C/EBPβ+LA(血凝蛋白)肽链的MSV载体(0.3Mg)转染的星形细胞。表达的肽链用抗-HA粒体进行免疫沉淀。仅在表达野生型C/EBPβ的细胞中，可用特异性抗体测出C/EBPβ-PThr217.免疫印迹结果显示，Procaspases1和8与C/EBPβ-PThr217和C/EBPβ-Glu217的关联高于它们与C/EBPβ-Ala217之间的关联，RSK则与所有的C/EBPβ肽链有关联。但在表达C/EBPβAS的细胞中，无论C/EBPβ还是Procaspases1和8均不能通过针对C/EBPβ的免疫沉淀测出。反过来针对Pro-caspases和RSK进行免疫沉淀证实了上述关联性。
图5该图结果显示C/EBPβ-Glu217直接与Procases1和8结合。A组提供了一种免疫印迹结果，实验中将纯化的重组C/EBPβ-GLU217和C/EBPβ-216-253-Glu217与纯化的重组Procaspases1(0.6mg)和8(0.12mg)合并进行免疫沉淀，用光密度计测出，Procaspases1和8的量比C/EBPβ-HA-Ala217和C/EBPβ216-253-HA-Ala217高出7-12倍。B组提供的结果表示，纯化的C/EBPβ-HA-Glu217和C/EBPβ216-219-PThr217和-Glu217合成四肽可在体外抑制Pracaspases1和8的自身活化。酶活性的测定在C/EBPβ肽(200Mg)存在2小时或缺失(对照组)的情况下进行。采用了一种Procaspases1(1V)(来表示)和8(0.2Mg)的活性测定法。测定值表示为平均值士双管变异组的半数。C组为细胞培养后的测定结果，细胞培养是在I型胶原基质上时行。并分别加入不同的试剂处理细胞4小时，其中有具细胞通透性的经纯化贴人工合成的N-乙酰，C-醛基C/EBPβ四肽(10μM)or指定的重组C/EBPβ-HA肽，然后将这些肽类分别与Chariot试剂(Activemotif)混合后再用其处理细胞，对照细胞并行培养，但在处理中不含上述肽类(所有含有Ala217的肽类试剂处理，其P值均小于0.05)图6该图结果显示大鼠星形细胞内源性C/EBPβ的磷酸化发生在Ber105上。A组提供了培养四天后静止的和活化的肝脏星形细胞的磷酸图薄，培养方法如图1所示。这些结果显示I型胶原可诱导大鼠C/EBPβ上Ser105的磷酸化。箭头所指为活化细胞中含有磷酸-绿氨酸105的肽类。B组提供了体外标记的生组C/EBPβ的磷酸肽图谱。活化的P90RSK可在体对重组的C/EBPβ产生磷酸化作用，但对Ser105被Alu105置换后的得组C/EBPβ无此作用(见箭头所示)。
图7该图资料显示大鼠C/EBPβ第105位上的绿氨酸被磷酸化后可防止星形细胞凋亡。A组提供了小鼠星形细胞转染后的实验结果，转染方法见前述(见图2)，采用了实变的P90RSK或Lactacystin)10mm)(封闭杆)来处理细胞，或与CMV-rC/EBPβ-Asp105一起共染细胞(各1Mg)(开放杆)，见图示。Annexin-V-PE的结合用图2所述方法进行测定。B组提拱了星形细胞中anmexin-V-PE的测定结果，星形细胞来自C/EBPβ+/+(闭环)和Lactacysfin(0-30mm)处理的rC/EBPβ-Asp105转基因小鼠中，P值小于0.05)。C组提供了rC/EBPβ-HA构建特(0.3Mg)转染大鼠星形细胞的结果。对已表达的肽类采用抗-HA抗体来进行免疫沉淀。采用特异抗体后，rC/EBPβ-pser105仅能在表达野生型C/EBPβ的细胞中测出。针对Procaspases1和8的免疫印迹显示它们与C/EBPβ-Pser105和rC/EBPβ-ASP105的缔合高于C/EBPβ-Ala105肽的缔合。交互免疫沉淀的结果也证实了这些缔合关系。D组提供了星形细胞的实验结果，星形细胞分离自C/EBPβ-/-小鼠，细胞在培养中采用指定的具细胞通透性的纯化的人工合成的N-乙酸-C-乙醛C/EBPβ四肽(10MM)与Chariof试剂共同处理4小时。对照细胞在培养中不含肽类(两种多肽的P值均小于0.05)。E组提供了AC-KE217VD-CHO和AC-KKPD105-CHO(200mm)的实验结果，这些结果指出这些四肽能抑制体外的Caspase8的自行活化。酶活性的测定中采用范例中述及的化色基质。Caspase8活性的基础值为4.7U(100％)测定值表示为平均值士对管变异值的半数。
图8该图提供的核酸序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)为野生型小鼠C/EBPβ所具有。
图9该图提供了经修饰的小鼠C/EBPβ的氨基酸序列，由此可看出，苏氨酸出现在野生型鼠C/EBPβ的217位点(SEQ ID NO2)，它可被丙氨酸置换(SEQ ID NO3)，图中提供的另一种修饰C/EBPB序列显示，野生型C/EBPβ第217位点上苏氨酸(SEQ ID NO2)可被容氨酸(SEQ ID NO4)所置换。
图10该图提供了人类野生型C/EBPβ的核酸(SEQ ID NO5)和氨基酸序列(SEQ IDNO6)，这与Genbank的序列(进入编号M83667)相符。
图11该图提供了人类修饰修C/EBPβ的氨基酸序列，在此序列中，野生型C/EBPβ第266位上的苏氨酸(SEQ ID NO6)遇可被容氨酸(SEQ ID NO7)所置换。
图12该图提供了两种经改变修饰的人类C/EBPβ的氨基酸序列(SEQ ID NO9)，在此序列中，修饰性C/EBPβ第266位上的苏氨酸(SEQ ID NO9)被替换为丙氨酸(SEQ IDNO10)也可被替换为谷氨酸(SEQ ID NO11)。
图13该图提供了人类野生型C/EBPβ的核酸序列(SEQ ID NO18)和氨基酸序列(SEQ ID NO 19)，该序列与Genbank进入编码X52560里的序列相一致。
图14该图提供了一种经修饰的人类C/EBPβ的氨基酸序列，在此，野生型C/EBPβ第266位上的苏氨酸(SEQ ID NO19)被置换为丙氨酸(SEQ ID NO20)，同样，也可被置换为氨酸(SEQ ID NO21)。
图15该图提供了人类野生型C/EBPβ的核酸序列(SEQ ID NO22)和氨基酸序列(SEA ID NO23)，该序列与Genbank进入编号NM005194上的序列相符。
图16该图提供了人类修饰的C/EBPβ的氨基酸序列，该序列中C/EBPβ每266位上的苏氨酸(SEQ ID NO23)被置换为丙氨酸(SEQ ID NO24)，同样，该苏氨酸(SEQ IDNO23)已置换成谷氨酸(SEQ ID NO25)。
图17该图提供了大鼠C/EBPβ的核酸序列(SEQ ID NO12)和氨基酸序列(SEA IDNO13)。
图18该图提供了大鼠经修饰的C/EBPβ的氨基酸序列，在此序列中，野生型C/EBPβ第105位上绿氨酸(SEQ ID NO13)被置换成丙氨酸(SEQ ID NO14)，该绿氨酸(SEQ IDNO13)也可被置换成天冬氨酸(SEQ ID NO15)。
具体实施例方式
关于本发明实施的详细说明本发明总的来讲是涉及到具有过度细胞增生和/或活化特征的治疗和预防。本发明的独特之处是提供了抑制多种不同种类细胞活化和/或增生的制剂和方法。在某些优先选择的应用范围内，本发明提供的制剂和方法用于抑制间质衍生细胞(包括但不限于肝脏星形细胞)以及具有异常生长特征的细胞的活化和/或增生。在某些特别优先选择的应用领域，本发明提供的制剂和方法用来抑制或消除纤维变性，在另一种相反的优先场合，本发明提供的制剂和方法用来诱发纤维变性。进一步还可用本发明提供的制剂合格方法来治疗和预防癌症。
A.C/EBPβ肽链上Thr217的磷酸化过程为星形细胞生存所必需。
为测试I型胶原基质是否能诱导C/EBPβ的磷酸化，将小鼠肝脏的初级星形细胞用32P-正磷酸标记12小时，并如例5所述，置于EHS基質胶[EHS(Matrigel)](静止细胞)或I型胶原(活化的细胞)进行培养。C/EBPβ经免疫沉淀后得到的磷酸肽图谱显示I型胶原基质诱导产生了一种位点特异的磷酸化过程，包括内源性C/EBPβ上的Thr217，一种p90RSK磷酸体域(Buck et al.，(1999)，前述)和是一种尚未确认的磷酸受体部位(见图1中的A和B组)。C/EBPβ的磷酸化在小鼠的静止期星形细胞培养于一种EHS基质中时是不易被测到的(见图1A组)。
其次，C/EBPβ的功能与其Thr217的磷酸化之间相关性已被查明。活化的小鼠肝脏初级星形细胞已用野生型(有意义)或反意(cmtisense)C/EBPβ表达载体来转染。星形细胞当其表达C/EBPβ反意，而不是顺意RNA时(Buck et al.，EMBO J.，13851-860(1994))，缺乏可以测出的C/EBPβ蛋白质，而且不能增生，因为测不出增生细胞核抗原的表达(Bravo et al.，326515-517(1987)；Buck et al.，(1994)，上述；和Buck etal.，(1999)，上述)。但这些细胞显示出升高了的V型膜联蛋白与浆膜上磷酸绦氨酸的结合，这是一种细胞凋亡的早期指标(Rudel and Bokoch，上述)(见图1中的C组)。
为了确定小鼠C/EBPβ上的Thr217的磷酸化(即C/EBPβ-PThr217)是否为细胞生存所必需，将小鼠星形细胞用结合有无磷酸化可能性的C/EBPβ-Ala217突变体的MSV表达载体进行了转染。转染细胞的鉴定，如例2中所述，采用三波道荧光显微镜观察共转染的CMV-GFP(绿色荧光蛋白质)来进行。发现表达C/EBPβ-Ala217突变体的细胞(Buck et al.，(1999)，前述)不能增生，但开始进入凋亡过程，这是采用动态显微镜方法(见图1中C组)和同细胞分类分析(FACS)检测转染指标绿色荧光蛋白和V型-膜联蛋白后确定的结果。死亡细胞的确认通过Hoechst 33342的核染来进行。共表达的RSK不能挽救细胞免于C/EBPβ-Ala217诱导的凋亡过程(图1C组)。
相反，通过阻断具有抗凋亡活性的NFKB的活化(Beg and Baltimore，Science274782-784(1996)；和Wang et al，Science 274748-787(1996))或阻断RSK的活性(Buck et al.，(1999)，前述；Bonni et al.，前述；Bhatt and Ferrel，前述；Gron etal.，前述；和Sasson-Corsi et al.，前述)诱导的细胞凋亡可通过磷酸化类似物C/EBPβ-GLu217突变体的作用而得以免除(Buck et al.，(1999)，前述)(见图1D组)細胞分裂激活性激酶/胞外調節激酶[MEK激酶1(MEKK1)]对細胞核因子KappaB(NFKB)的活化是通过NFKB抑制因子(IKB)激酶α和β的磷酸化，进而导致IKB的磷酸化来进行(Lee et.al.，Cell 88213-222(1997))，这要经历一个通过泛蛋白-蛋白酶体途径的快速蛋白质水解过程(Chen et al.，Genes Der.，91597(1995a))。因此，为诱导星形细胞的凋亡，对其作了如下处理，包括用含有MEKK1 IKBα和RSK阴性显性突变的表达载体进行转染，或用Lactacystin(一种蛋白酶体抑制物)来进行处理。在每种情况下，星形细胞的凋亡过程均受到C/EBPβ-GLu217突变体的部分抑制(图1D组)，由此指出，在活化的NFKB或RSK缺失的条件下，C/EBPβ-PThr217的磷酸化过程可增进细胞存活。此外，C/EBPβ-GLu217的表达，可防止RSK突变体或FS7相關表面抗原配體(FAS Ligand)诱导的细胞凋亡，但不能防止血清清除所导致的细胞凋亡(图1E组)表示这种防止作用对Caspase活化途径具有某种选择性。
B.用Ccl4处理来自C/EBPβ+/+和C/EBPβ-Ala217转基因小鼠的肝脏星形细胞可使该细胞表现出升高的细胞凋亡。
为查明小鼠C/EBPβ及其Thr217的磷酸化的相关功能特性，分析了分离自小鼠的肝脏初级星形细胞的生存情况，这里所用小鼠经过了针对C/EBPβ的靶向清楚处理(Buck et al.，前述)。C/EBPβ+细胞可在I型胶原上迅速产生细胞凋亡，但C/EBPβ+/+细胞无此现象，用动态显微镜观察annexin-v的结合特征可查明这一点(图2中A组)。为研究C/EBPβ-PThr217对星形细胞生存的作用，建立了一种能带有能表达一种不能被磷酸化的C/EBPβ-Ala217阴性显性突变体转基因的小鼠。尽管C/EBPβ-Ala217转基因小鼠发育正常，但其肝脏星形细胞总是难以在I型胶原的激活作用下得以生存(图2)。来自C/EBPβ-Ala217转基因小鼠的星形细胞其凋亡表型已通过线粒体传感器测定方法来证实(Green and Reed，Science 2811309-1312(1998))，这表明其线粒体膜通透性发生变化(图2中C组)，并且也可以通过其核固缩染色方式来加以证实(图2中B和C组)。C/EBPβ-Ala217星形细胞的凋亡过程可通过一种细胞通透性Caspase8的抑制物(IERD)来阻断或通过C/EBPβ-Glu217的表达来阻断(图2中B组)。
此外，本发明还确认了肝星形细胞的活化是否含由CCl4所刺激引起，而CCl4是一种肝毒素，它能诱导肝氧化應急反應和和纖維(Houglum et al.，前述；and Chojkier，前述)。肝星形细胞能在C/EBPβ+H小鼠的肝脏中被诱导增生，这仅需单独一次剂量的Ccl4处理即可发生。相反，在C/EBPβ-1-和C/EBPβ-Ala217转基因小鼠的肝脏中，只有在活化的效应子Caspases存在的条件下，Ccl4才能诱导星形细胞的凋亡(见图3)。因为活化的pqoRSK能使C/EBPβ上的Thr217在體外磷酸化(Buck et al.，(1999)，前述)，因而RSK是否与这些动物中的C/EBPβ相结合得到了确认。
C.CCl4处理能诱导正常小鼠肝星形细胞都RSK和C/EBPβ-Thr217的活化并诱导其与Procaspases1和8的结合。
因为活化性的p90RSK能在体外将C/EBPβ上的Thr217磷酸化(图1B组)(Buck etal.，(1999)，前述)，所以对RSK是否能与C/EBPβ相结合的结论进行了分析。结果指出星形细胞中RSK与C/EBPβ的结合确实有所升高，但这种星形细胞来自Ccl4处理的C/EBPβ+/+小鼠和C/EBPβ-Ala217转基因小鼠(图3中B组)。相反地，当RSK被特异抗体免疫沉淀后，可见到共沉淀的C/EBPβ的水平也较高，这种现象始终存在于Ccl4处理的C/EBPβ+/+小鼠和C/EBPβ-Ala217转基因小鼠(图3中B组)。如同用针对RSK-Pser380的特异抗体所证实的那样(图3中B组)，Ccl4能增强RSK的表达和活性。在C/EBPβ+/+小鼠中，CCl4也能诱导内源性C/EBPβ上的Thr217产生磷酸化，用一种新产生的针对这磷酸化epitope的经亲和层析纯化的特异抗体检测到这种磷酸化情况(图3B组)。这些发现指出RSK对C/EBPβ上Thr217的磷酸化的肝星形细胞生存所必需的。
由于假定C/EBPβ的Thr217磷酸受体含有一种KT217VD序列(相同于人类的C/EBP)其磷酸化依赖于RSK，且又在功能上被C/EBPβ-GLu217序列KE217VD(Buck et al，(1999)，前述)，所模仿，而后者又相似于一种XEXD箱形体，即已发现存在于Caspases的抑制物和底物箱形体，因而采用实验来確認C/EBPβ-PThr217是否与Procaspases相关。实验结果表明Procaspases1和8(图3C组)，存在于经Ccl4处理后的C/EBPβ+/+小鼠之星形细胞的C/EBPβ免疫沉淀物中(含有C/EBPβ-PThr217)但此沉淀不含Procaspases3，7或9(未显示数据)。来自C/EBPβ+/+小鼠的Procaspases1和8水平在Ccl4处理后上升，在其免疫沉淀物中含有C/EBPβ(图3C组)。Ccl4处理后C/EBPβ-Ala217转基因小鼠的细胞中，C/EBPβ与Procaspases1和8的结合处于基线水平(图3中C组)，与此相同的是用矿物油载体处理作为对照的C/EBPβ+/+小鼠细胞。另外caspases1和8的酶活性(图3中D组)及小于物Caspase3的酶活性(图3中A组)在Ccl4处理C/EBPβ+或C/EBPβ-Ala217小鼠中无此反应。这些结果提示C/EBPβ上Thr217的磷酸化及二种功能性的XEXD箱形体(或与磷酸化类似的C/EBPβ-GLu217突变体的表达)的产生，对于C/EBPβ与Procaspases1和8的结合是需要的。这些数据也提示C/EBPβ的磷酸化有可能Procaspases1和8的加工和活化，因为Procaspases1和8的优先的底物即不是K-Phospko-T217VD也不是KE217VD(Wilson et al.，Nature 370270-275(1994)；Margolin et al.，J.Biol.Chem.，2727223-7228(1997)；Earnshaw et al.，Ann.Rev.Biochem.，68384-424(1999))，C/EBPβ的裂解似乎也不是通过Caspase1或8(来显示数据)。此外，C/EBPβ-Ala217细胞可通过RSK和含有XEXD箱形体的关键性P1厌冬氨酸残基突变体的表达而免于凋亡(Thornberry and Lazebnik，前述)(见图2中B组)。
D.缺失活化域和二聚体域的C/EBPβ-PThr217也能充分允许星形细胞在I型胶原上的存活。
已发现缺失二聚体域但仍含有Thr217或GLu217的C/EBPβ1-253片段的表达能兼容细胞生存(Descombes et al.，(1990)，前述)(图4A组)，但不能活化Ala217存在的情况。C/EBPβ1-215缺失DNA结合域和二聚体域及KT217VD的磷酸受体(图4A组)均不对细胞生产产生影响。相反C/EBPβ216-253 Ala217，而不是C/EBPβ216-253 GLu217，片段中缺失活化域和二聚体域时(图4A组)，就可能诱导对照组细胞产生凋亡，即使在野生型RSK表达情况下也是如此(图4中B组)，此外，C/EBPβ216-253 GLu217的表达也能使细胞免于水解灭活的RSK突变体(RSKN’C’)诱导的凋亡过程(Nakajima，et al.，Cell 86465-474(1996))(图4B组)。与先前的报告(Mao et al.，J.Biol.Chem.，27323621-23624(1998)；and Ritter et al.，J.Cell Biol.，79358-364(2000))相符，Procaspases1和8主要在活化的星形细胞之细胞浆中测出，这与C/EBPβ处于相同的部位(图4C组)。对星形细胞C/EBPβ-HA和C/EBPβ216-253-HA的免疫沉淀结果显示，与磷酸化类似物Glu217能高效地与Procaspases1和8一起被共同沉淀出来(图4D组)用针对Procaspases1和8的抗体来进行交换免疫沉淀，也得到相似的结果。因此，无论是C/EBPβ片段上的活化域还是二聚体域，对于星形细胞的生存来说，都表示必需的。
E.C/EBPβ-PThr217肽链与Procaspases1和8结合并抑制其活化进一步澄清了体外条件下重组caspases1和8的自身活化对纯化的重组C/EBPβ肽链的影响。与上述体内实验的结果相一致，C/EBPβ-HA-GLu217和C/EBPβ216-253-HA-GLu217肽链与caspases1和8的结合，相对于C/EBPβ-HA-Ala217，效率高达7-12倍(图5A组)。而且发现，重组的C/EBPβ-GLu217，分成的四肽分子AC-K-磷酸-T217VD-CHO和AC-KEE217VD-CHO可直接抑制重组caspases1和8的自身活化(图5B组)。细胞通透性阴性显性突变体肽段AC-KA217VD-CHO能重复性地诱导细胞产生凋亡，其程度与C/EBPβ-Ala217和C/EBPβ216-253Ala217(图5C组)诱导的程度相当(图5C组)。相反，野生型和Gul217 C/EBPβ肽片段不诱导细胞凋亡(图5C组)。
F.大鼠C/EBPβ-Pser105，即小鼠C/EBPβ-PThr217的功能上的同源物，能在体内外与Procaspases1和8结合并抑制其后者的活化尽管C/EBPβ-PThr217的磷酸受体在进化过程中是高度保守的，大鼠(r)C/EBPβ在进化过程还是出现了双重变化，即缺失了Thr217磷酸受体，但出现了补偿性的Ser105RSK磷酸受体(Descombes，et al.，前述)。C/EBPβ-PThr217或rC/EBPβ-Pser105分别出现在小鼠和大鼠细胞中，这对于TGFγ诱导产生肝细胞增生来说的关键性的(Buck et al.，(1999)，前述)。I型胶原在增生的大鼠肝星形细胞中可诱导内源性C/EBPβ上105位点绦氨酸或其他位点的磷酸化。但是，在培养于EHS基质上的静止期大鼠星形细胞中，E/EBPβ-的磷酸化的微弱的(图6A组)。I型胶原诱导的磷酸肽与前述的Pser105肽，一种P90RSK磷酸受体(trautwein et al.，Nature 364544-547(1993)；Buck et al.，(1999)，前述)一样，具有相同的移动特性。对γC/EBPβ的磷酸多肽进行胰酶水解分析的结果表明，P90RSK能C/EBPβ105位点绦氨酸及其他部位进行磷酸化作用；但γC/EBPβ-Ala105突变体的磷酸化不产生这种磷酸多太(图6B组)，提示这种多肽片段含有Ser105。如下所述，采用针对这种变位抗原的特异性抗体证实了内源性γC/EBPβ片段上的磷酸花存在于Ser105。
另外进行的实验用来验证γC/EBPβ-Pser105是否能挽救细胞免于凋亡。通过表达阴性显性RSK突变体来诱导星形细胞产生凋亡(Nakajima et al.，前述)或通过lactacystin处理细胞以便导致凋亡。结果发现，磷酸化类似物γC/EBPβ-Asp105的表达可使小鼠(图7A组)和大鼠(数据未显示)星形细胞免于凋亡。无磷酸化可能性的γC/EBPβ-Ala105突变体，如同γC/EBPβ-Ala217，诱导了星形细胞的凋亡，因为该突变体也不具备RSK磷酸受体位点。这些结果指出，γC/EBPβ-Pser105(或其磷酸化类似物γC/EBPβ-Asp105)能够阻断细胞凋亡途径，其效率与C/EBPβ-PThr217(或其磷酸化类似物C/EBPβ-Glu217)相同(图1)。
由于γC/EBPβ-Asp105突变体在避免细胞产生凋亡的行为上与一种γC/EBPβ-Asp105的磷酸化类似物相同(图7A组)，因此发展了一种表达γC/EBPβ-Asp105的转基因小鼠。尽γC/EBPβ-Asp105转基因小鼠发育正常，但其星形细胞能耐受lactacytin对细胞凋亡的诱导(图7B组)。Lactacytin处理能诱导C/EBPβ+/+星形细胞的凋亡显著和快速读增加(图7B组)。γC/EBPβ-HA和γC/EBPβ92-142-HA显示P-SER105和磷酸化类似物Asp105，相对于无磷酸化可能的Ala105(图7C组)，能更高效率地与大鼠星形细胞的Procaspases1和8共同被免疫沉淀出(图7C组)。γC/EBPβ-Asp105并不与活化的caspases1和8结合(未显示数据)。与rC/EBPβ-Pser105和γC/EBPβ-Asp105对细胞生存的作用相同，对刚从C/EBPβ+小鼠中分离出星形细胞用含有γC/EBPβ(AC-KE217VD-CHO)或γC/EBPβCAC-KKPD105-CHO)的磷酸化类似域的细胞通透性四肽分子加以处理，可十这些细胞免于I型胶原活化所导致的凋亡(图7D组)。此外还证实，人工合成四肽AC-KKPD-CHO，与AC-KE217VD-CHO相同，均能抑制重组caspases8在体外的自身活化(图7E组)。
本发明形成过程中获得的结果还指明，本发明为细胞生存提供了一种新的方法。然而，理解其相关机制并不的本发明方法运用时所必需的。无论如何，已知通过信号传递途径来使RSK活化就会导致C/EBPβ上的Thr217被磷酸化。而C/EBPβ-PThr217能与起动子Procaspases1和8进而抑制其加工过程，即一种凋亡连续反应过程的阻断作用，从而允许活化基础上的星形细胞得以生存。这被相信是首次证实一种转录因子的磷酸化是通过ERK/MAPK/RSK途径实现的，同时这种磷酸化能凭借与Procaspases的缔合来防止其活化。本发明不能被限于任何一种特定的机制，伴随假性XEXD箱形物的产生而进行的C/EBPβ序列中Thr217的磷酸化(Thornberry et al.，(1997)，前述；和Blanchard et al.，前述)为这种新提出的转录因子的抗一凋亡现象提供了最为恰当的解释。
尽管C/EBPβ-Thr217相联于起动子Procaspases1和8(借此抑制其加工和活化过程)，但不结合于效应物Procaspases3，7或9(Earnshaw et al.，前述；Thornberry andLazebnik，前述；and Askkenazi and Dixit.，前述)，但却能有效地阻断凋亡的连续进程，正如在C/EBPβ+/+的肝脏星形细胞中发现缺失活化的caspases3所指出的那样，但一种含有无磷酸化可能的C/EBPβ-Ala217阴性显性突变体的转基因小鼠中无此现象。另外，磷酸化类似物C/EBPβ-GLu217突变体能活化的星形细胞免于下列因子诱导的细胞凋亡，如MEKKI，IKBαRSK阴性显性突变体的表达，或通过用蛋白酶体抑制物lactacystin对细胞进行处理(Chen et al.，Nature 374386-388(1995b)；Lee et al(1997)，前述；andNakajima et al.，前述)。此外还认为，含有KE217VD的C/EBPβ-GLu217和相关多肽将被发现用于挽救凋亡的细胞，以便在某些条件下预防和/或处理细胞例如神经或肝细胞，以便使细胞损伤被防止或被减轻。已有这样的看法，即不同的病人，如那些患有神经伤创，神经细胞(degeneration)和急性肝损伤的病人将因为应用这些多肽分子而受益。
对于与Procaspases1和8的缔合及进行抑制其加工过程来说，C/EBPβ上的活化域或者二聚体域均不是必不可少的。更为重要的是，小鼠Thr217磷酸受体本质的相同于牛和人类的C/EBPβ(Akira et al.，前述；Cao et al.，前述；和Yamaoka et al.，前述)。C/EBPβ-PThr217也与C/EBPβ-C/EBPβ-Glu217(KE217VD)(Buck et al.，(1999)前述)因而进一步证实当前关于caspases抑制性四肽存在结构需求的认识。这些四肽分子需要P1部位存在天冬氨酸(D)残基(Thornberry and Lazabnik，(1998)，这种残基也出现在C/EBPβ氨基酸序列的219位上即D219(Cao et al；，前述，and Back et al.，(1999)，前述)。
运用一种位点扫描底物文库方法，Thornberry和其同事(Thornberry et al.，J.Biol.Chem.，(1997))已证明尽管对于caspases8来说理想的序列是I/L/V(P4位点)EXD，I，V，W，T，P和D也都可被P4位点所接受，这是基于凋亡连续进程的下游裂解位点而言。这些发现最近已采用结晶学方法加以证实(Blanchard et al.，前述)。
A丙，B天冬+天冬酰氨，C半胱，D天冬，E谷，F苯丙，G甘，H组，I异亮，K赖，L亮，M蛋，N天冬酰氨，P脯，Q谷氨酰，R精，S绦，T苏，V缬，W色，X萤嘌呤aminoacid.Z谷+谷氨酰FACS荧光激活性细胞分选C/EBPβ.CCAAT/增强子结合蛋白βXEXDEVDTVDMAPK促细胞分裂激活性细胞激酶Caspase蛋氨酸特异的绦氨酸激酶
Procaspase蛋氨酸特异的绦氨酸激酶酶原Pro-apoptosisAnti-apoprosisRSKHE核糖体S6激酶CrmA白喉毒素A片段Tandem串联免疫吸附沉淀RIA放免测定XA FactorEntero kinane肠激酶Vaccinia Viruses牛痘病毒Herpes virus疱疹III组caspases(包括caspase8)对P4位点小疏水残基有缔合倾向性，例如在这些研究中所用的D(Blanchard et al.，前述)其对C/EBPβ的K216具有相似的疏水性(Boyle etal.，Meth.Enzymol.，201110-149)(1991))。此外，这些作者还认为caspase8的S3亚区能与四肽的P3(而不是与P4)位相互作用，这对于决定其特异性的至关重要的，而且还认为对caspase的早期分类需要作修改，尤其是对caspase的分类((Blanchard et al.，前述)需加修改。同样地，C/EBPβ-PThr217的选择性作用也在此表明，相对于Procaspases3，6和7，CrmA能选择性地抑制Procaspase1和8(抑制常数分别为0.01和0.95nM)(Zhou et al.，Immunity 8451-460(1998))。但另一些研究者建议CrmA也能抑制caspase4，5，9和10(Garcia-Calro et al.，J.Biol.Chem.，27332608-32618(1998))。此外，对于Procaspases1，3，6，8和10来说，Baculovirus P35也是一种强力抑制物(Ki＝0.1nm)，虽其选择性较差(Andrade et al.，Immunity 8451-460(1998))。进一步还发现，能有效抑制Procaspases1和8(Ki＝17和12nm)(Earnshawet al.，前述)的DEVD-CHO，也是caspases8的强力抑制物，其效力与经典抑制物IETD相当(Blanchard et al.，前述)。
本发明形成过程中还提供了进一步的实验数据来支持本发明，并在此加以讨论。
正如在此指出的一样，C/EBPβ中的Kphospho-T217VD(或KE217VD)能有效缔合Procaspases1和8并抑制其活化。肝星形细胞的活化已通过用肝毒素Ccl4处理动物而被诱导产生，或通过将这些细进行实验，用Ala217阴性显想和Glu217阳性显性突变体及包括新的C/EBPβ-Ala217转基因小鼠进行的实验均强有力地支持了本发明。
然而，大鼠C/EBPβ中含有一种双突变(小鼠之Thr217-raf之Ala217和小鼠Ala105→大鼠之Ser105)由此产生了一种细胞生长所需的补偿性Ser105磷酸受体(Buck etal.，(1999)，前述)。因此，进一步用实验来求证大鼠的C/EBPβ-Pser105是否在细胞存活中起到了与小鼠C/EBPβ-PThr217相似的作用。大鼠C/EBPβ-Asp105的磷酸化类似物的表达(Trautwein et al.，前述；和Buck et al.，(1999)，前述)足以使活化的显形细胞免于水解灭活的阴性显性突变体RSK载体表达诱导的细胞第五(Nakajima et al.，前述；和Buck et al.，(1999)，前述)，或来用一种蛋白酶体抑制剂来处理所导致的细胞凋亡。蛋白激酶Cα(PKCα)的活化(Trautwein et al.，前述)或促细胞分裂激活性蛋白激酶(MAPK)(Nebreda and Gavin，前述；和Whitmarsh and Davis，(2000)前述)倍号途径的活化，均有可能导致rC/EBPβ上Ser105的磷酸化(Trautwein et al.，前述；和Bucket al.，(1999)，前述)。已经发现大鼠C/EBPβ-Ala015突变体的行为类似阴性显性突变体，也能诱导小鼠的肝活化星形细胞产生凋亡。
本发明涉及到如像肝硬化这样的人类疾病，得到在肝星形细胞进行实验的支持。此外还认为，本发明将可治疗与组织修复过程相关的疾病，即由于涉及其他间质细胞活化而导致的疾病(包括但不限于脑，肝和肾细胞)。例如，正考虑将本发明用于治疗像肝纤维变性(emphysema)，大脑胶质纤维变性(如阿尔茨海默病)和肾纤维变性(肾小球肾炎)这类疾病。但这并不指本发明的应用仅限于此。进一步考虑的，通过磷酸化产生一种假性XEXD箱形体；是存在于进化过程中的一种非常普通的生物学机制。这一点得到如下观察结果的支持，即在包含大约350,000个蛋白质的数据库中，发现潜在性假性XEXD箱形体对苏氨酸的磷酸化(Phosph-TVD，EVD的类似物)位点超过22,000个而对绦氨酸的磷酸化(Evphospho-S，类似于EVD)则超过了27,000个位点。因此，假如这些蛋白质序列中只发生1％的体内磷酸化，那也可能在大约500个蛋白质中产生假性XEXD箱形体。
G.本发明的典型多肽，核酸序列编码它们和宿主细胞。
本文报告可通过磷酸化来产生牙子功能性XEXD Caspase抑制性箱形体，这或许是进化中一种普遍的生物学机制。确实也发现在存有大约350,000个蛋白质的数据库中，能产生苏氨酸磷酸化(Phospho-TVD，类似于EVD)的部位已被鉴定为多于22,000个，而绦氨酸的磷酸化部位(EV-Phospho-S，类似于EVD)则超出27,000个。假如这大约35,000个蛋白质序列中只有1％在体被磷酸化，则将有可能在大约500个蛋白质中产生功能性XEXD Caspase抑制性箱形体。但，正如这里指出的那样，对这里所涉及的机制的理解并不为应用本发明所必需。
正如在此详细讨论的那样，本发明的一个具体实体是一种多肽序列或其片段，其本身能编码C/EBPβ或其融合蛋白或其功能相似物，也可能被一种重组DNA分子编码并被用来指导适宜的宿主细胞表达产生C/EBPβ。由于遗传密码固有的退化特性，因而其他编码基本相同或功能上相同的氨基酸序列的DNA序列有可能产生并被用来克隆和表达C/EBPβ。
如同将被文献记载技术所理解的那样，也许更优越的是通过加工非自然发生的编码子来产生C/EBPβ的核酸序列。例如，被某一特定的原核或真核宿主细胞优先选择的密码子能被选来增加蛋白质表达速度，或用来产生一种重组RNA转录物，该转录物具有某种理想的特点，如半衰期长于那些自然产生序列的转录物。
本发明的核苷酸序列能通过文献中普遍知道的方法来进行设计和建造，以便为多种不同理由而对C/EBPβ-编码序列加以改变，这包括但并不限于改变基因产物的克隆，加工和/或表达。DNA片段的随和移动和基因片段的聚合酶链反应(PCR)重组及合成的寡核苷酸均可被用来建造核苷酸序列。例如，位点指导的突变形成技术可被用来插入新的限制性片段，改变糖基化方式，改变密码子的倾向性，产生剪切变异体或导入突变，等等。
本发明的另一具体应用是，自然的，修饰的，或重组的编码C/EBPβ核酸序列也可能被用来连接到编码融合蛋白的异源序列上。例如，筛造肽文库以便找出人类C/EBPβ活性的抑制物时，编码一种嵌合体蛋白被市场上可获得的抗体所识别。某种融合蛋白也可被建造成含有一种裂解位点的蛋白，且这种位点位于该C/EBPβ编码序列和相关的异源蛋白序列之间，由此C/EBPβ可被裂解并从异源组分中纯化出来。
本发明的另一具体应用是，编码C/EBPβ的序列也可能被人工合成，运用文献方法来进行整体或部分序列的人工合成(例如，可参见Caruthers et al.，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.，215-223(1998)；和Horn et al.，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.，225-232(1980)。另外，蛋白质本身也可用化学方法来生产，从而合成C/EBPβ的氨酸序列，或其一部分。例如，肽类的合成可应用不同的固相技术(Roberge et al.，Science 269202-204(1995))和自动合成是实现，例如采用市场上提供的自动合成仪。这些合成肽也可以运用过制备性高效液相层析来加以大量纯化，这可参照任何一种文献中适宜的方法来进行。合成多肽的组成可通过氨基酸分析或序列分析来加以核实(例如用埃德曼(Edman)降解法)。另外，C/EBPβ的氨基酸序列或其任何部分均有可能在直接合成和/或合并使用化学方法的过程中被加以改变，即可利用其他蛋白质或其任一部分来产生不同的多肽。
正如本文详述的那样，为了表达具有生物活性的C/EBPβ，编码C/EBPβ或其功能相似物的核苷酸序列被插入适宜的表达载体(即含有为转录和翻译此插入的编码序列所必需的元件的载体)。这些方法包括体外的DNA重组技术，人工合成技术，和体内的遗传性重组。
不同的表达载体/宿主系统可能被用来获得和表达编码C/EBPβ的序列。这里包括但不限于微小有机体如用重组噬菌体、质粒或粘粒(cosmid)DNA表达载体转化的细菌；用酵母菌；用病毒表达系统感染的昆虫细胞系统(如杆狀病毒baculovirus)；病毒表达系统(如花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic病毒，Camv)；烟草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV))转化的植物细胞系统或用细菌表达系统(如Ti或Pbr322质粒)转化的植物细胞系统，或动物细胞系统。适当情况下也考虑采用核制元件或调节序列。
另外，当选用一种宿主细胞系时，要考虑其实是对插入序列之表达具有调整能力，或对于理想的融合蛋白质具有加工能力。对多肽的这种修饰包括但并不包括乙酰化，羧基化，糖基化，磷酸化，脂化和酰基作用。将蛋白质的“前原型”结构裂解的翻译后加工也可能被用来促进正确插入，折叠和/或发挥其功能。文献中已知的不同宿主细胞具有特异的细胞机制和具特征性的机制来产生这种翻译后的加工行为，因而有可能被用来确保一种外源蛋白质能得到正确的修饰和加工。
为了使重组蛋白质能被长期高产率的生产，最好能获得一种稳定的表达。例如，稳定表达C/EBPβ的细胞系有可能被一种表达载体转化。这种载体可能含有病毒起源的复制元件和/或内源表达元件，及一种选择性基因标志，该标志存在于相同或不同的表达载体上。导入表达载体后的细胞有可能在充分培养基中继续生长1-2天，然后再转入选择性培养基中继续生长。采用选择标志的目的的使其能耐受选择条件，同时该标志的存在允许那些能成功表达导入序列的细胞得以生长和恢复。稳定的转化细胞中的抗性克隆株可能用适宜于某一细胞类型的组织培养技术来使其增殖。可用任何数量的选择系统来恢复转化细胞蓄。这些包括但不限于单纯痘疹病毒嘌呤激酶。腺嘌呤磷酸转移酶，和文献中已知的其他不同种类的适宜系统。另外，抗代谢，抗生素或助草剂的抗生性也都可以成为选择的基础。尽管这种标志基因表达与否提示感兴趣基因是否出现，但最终还是要对其是否存在和表达加以核实。例如，假如相关的C/EBPβ编码序列插入到一种标志基因的序列中，重建的细胞中可被鉴定到含有C/EBPβ的编码序列，但却鉴定不出标志基因的功能，另外，一种标志基因也可与C/EBPβ编码序列一起被于接哀序列，由此处一个单一的启动子的控制下。因而在应答诱导和选择作用时，标志基因的表达通常也指示了tandem基因的表达。
另外，含有核酸编码序列同时又表达C/EBPβ的宿主细胞也可用已知文献的不同程序来加以鉴定。这些程序包含但并不限于DNA-DNA，或DNA-RNA杂交和蛋白质生物测定方法，或免疫测定技术，这些均包括膜、液体或以芯片为基础测定技术，以便用于对核酸或蛋白质的检测和/或定性。
有多种方法用于检测和测量人类C/EBPβ的表达，如在本发明中采用的文献方法，利用针对相关蛋白质的特异性多克隆抗体或单克隆抗体。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)和荧光激活的细胞分选(FACS)方法。
文献已知的多种标记和偶联技术也可用来进行不同的核酸和氨基酸测定。多种方法用来产生标记性杂交或PRC探针以便检测与C/EBPβ编码相关的多聚核苷酸序列，这包括寡标记，缺刻翻译，末端标记或运用某种标记核苷酸所进行的PCR扩增。也可采用其他方法，为了获C/EBPβ的某种mRNA探针，可将其编码序列或该序列的一部克隆到某一载体中。文献已知的这种载体可市场上获得，因而可用其来进行体外合成RNA探针，此过程中尚需假如适宜的RNA聚合酶如T7，T3或SP6，以及标记的核苷酸。这些程序可通过多种市售试剂盒来进行。已被采用的适宜报告分子或标记物包括放射核素、酶、荧光素、化学发光素，或成色剂以及底物、共因子、抑制物、磁颗粒等等。
用编码C/EBPβ的核酸序列转让之宿主细胞可以在适宜的条件下培养，该条件应适合在细胞培养中相关蛋白质的表达和回收。重组细胞产生的蛋白质可能分泌或包含在细胞内，这取决于所用的序列和/或载体。如同将被文献所理解的那样，含有编码C/EBPβ多聚核苷酸序列的表达载体也可能被设计为含有信号序列，该序列能指导C/EBPβ的部分片段透过原核或真核细胞膜分泌出来。
也可采用其他重组结构来将C/EBPβ的编码序列与编码一种多肽域的核苷酸序列相连接，由此来提高可溶性蛋白质的纯化。这种促进纯化的区域包括但不限于金属螯合肽，如组一色氨酸组件，该组件可允许在固相金属上的纯化，或蛋白A域，该域有利于固相免疫球蛋白纯化，有包括采用FLAGS延伸/亲合纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，WA产品)时涉及的区域。可裂解的连接序列包括对XA因子或肠激酶Invitrogen，San Diego特异的序列，这些序列位于纯化促进区域和人类C/EBPβ序列之间，这些连接序列的采用可能用来促进纯化。
除了重组产物的生产，C/EBPβ的某些片段也可透过直接的多肽合成来产生，这可采用文献中已熟知的固相技术来进行(参见，如，Merrifield J.Am Chem.Soc.，852149-2154(1963))。也可透过手工或自动化集注来进行蛋白质合成。适宜于相关工程的任何一种市售合成仪有可能成功地进行蛋白质的自动合成。此外，不同的C/EBPβ也可用化学方法分别合成，并透过化学方法将其何必而成相关的全长片段结合分子。
H.治疗正如在此讨论的那样，已考虑过本发明的C/EBPβ肽链将在某些病症的治疗和预防中被采用，这些病症涉及到异常的纤维变性。确实，经修饰的CCAAT/增强子结合蛋白(本文称为修饰的“C/EBPβ”)发现可用于涉及纤维变性的不同场合。其中一个具体的实例是，C/EBPβ可与其他常规的医药制剂并用。合并使用具有不同作用机制的治疗剂被认为可提供一种协同作用，从而降低单一制剂的有效剂量并减轻其副作用。另一具体的应用是，当一种载体表达相关的编号C/EBPβ聚核苷酸的反意序列时，也可能将此载体用于某一病体以便治疗和预防纤维变性。除此之外的另一具体应用是采用这种反意表达载体来促进纤维变性(如愈伤过程)。
许多表达载体衍生前体为反转录病毒，腺病毒，疱疹和牛痘病毒，或不同的细菌质粒，这些衍生的表达载体被用来将核苷酸序列送入靶向器官，组织和细胞群体。除了本文在其他地方提及的方法以后，文献中熟知的成熟的方法也能用来建造可表达C/EBPβ的重组载体。
很多方法可用来将载体导入细胞或组织这些方法可以获得，并可同样适合用于体内及体外。为进行体内外方式的治疗，载体可能需要先、导入来自病人的干细胞并进行克隆化扩增，然后再同源移植回同一病人体内。也可通过转染或质脂体注射的方法来导入载入，为此可采用文献中熟知的方法来进行。
上述任何方法均有可能被用于任一需要这种治疗的主体。例如包括哺乳动物如狗，猫，牛，马，兔，猴，及更优先的人类。名词“施用”(administering)当其涉及到一种多肽时，其含义是指导入一种核酸序列(或导入一种含有相关核酸序列的宿主细胞)而该序列编码和表达相关多肽。
本发明的修饰性C/EBPβ多肽也可用于不同的组织和细胞。也考虑任何一种适宜的施用途径将可用于本发明。因此，在某些具体应用中，本发明的多肽的施用可采用基因治疗方法。选择性多肽传送系统，或任何一种其他适宜的方法，以便于将多肽运送到感兴趣的部位。在某些特别优先的具体应用中，这些多肽被投送进肝星形细胞。在另一些优先的具体应用中，这些多肽的施用不经过肠道，而进一步的具体应用中则经口服或局部用药。
在某些具体应用中，本发明的制剂仅给主体施用单一剂量，而其他情况下对某一主体则施用多次剂量。在优先的应用情况下，本发明选用的施药途径包括皮下注射，口服，静脉滴注，动脉内用药，腹腔注射，结肠给药，阴道内用药，局部用药，肌肉内给药，鼻腔内用药，肺内用药(如吸入，喷入，等)，气管内给药，横穿皮肤给药，表皮给药，结缔组织下给药，眼内用药，眼周用药，眼球後用药，视网膜下用药，脈胳膜外層用药，髓内用药，颅内用药，心室内用药，和鞘内用药。在另外的具体应用中，药物的施用选用了另一组器材，包括机械性贮液器，器械装置，植入物，和贴片。在进一步具体的应用中，制剂选用了下列一组形式中的一种，包括丸剂，胶囊，液体，胶体，粉剂，栓剂，悬浮剂，膏剂，冻凝剂，气体喷雾剂和食物添加剂。此外多肽也可以软膏，洗剂或凝胶(即用于处理皮肤和黏膜区域时)的方式用药。确实，本发明并无意只限于任何一种特定的施用方法，因为任何适合的方法都可用于本发明。在某些具体应用中，期望不同组织的细胞中将会有表达载体并表达感兴趣的基因(即在这些组织中表达感兴趣的多肽)。
在另一些具体应用中，一旦这些多肽掺入进细胞，它们就能与内源性C/EBPβ的野性型蛋白质竞争。并进一步的具体应用中，突变的C/EBPβ肽分子的出现导致了星形细胞的凋亡。而其他具体应用中，肝星形细胞的激活和增生被防止。在特别优先的具体应用中，这种细胞活化和增生的防止导致肝内纤维组织形成的降低和完全停止。在某些实例中，上述方法用于治疗病人的慢性肝病，或治疗怀疑患有慢性肝病的病体(例如，包括但不限于丙肝，乙肝，，酒精中毒，中毒性或遗传性肝病)。进一步还认为，本发明将可能用来预防与肝移植后肝排斥相关的肝纤维变形。进一步的具体应用中，C/EBPβ多肽突变产物的出现也可用于诱导肿瘤细胞凋亡。
本发明的另一种具体应用涉及一种药物制剂的施用，这与一种药物学上雕刻被接受的运载体相关，以达到上述任何一种治疗效果。这种药剂可以包括C/EBPβ，C/EBPβ的抗体，其类似物，其兴奋剂，其拮抗剂，或其抑制剂。该制剂可单独施用，或与至少一种其他制剂合用，如与具有稳定作用的化合物一起使用，这种稳定剂用于任何一种灭菌的，生物相容性的药剂载体，包括但不限于生理盐水，葡萄糖，和水。该制剂可单独用于病人，或者与其他试剂，药物或激素一起用于病人。正如本文指出的那样，应用于本发明的药剂可通过上述任何数量的适宜途径给药。
在上述活性成分之外，这些药剂可含有适当的药物学能接受的运载物，包括赋形剂和辅助剂借此有助于将活性成分加工进制备物中，从而能用作药物制剂，如文献中所知。
口服用药剂可用药典中已知的药学可接受运载体按适合口服的剂量进行配置。这种载体可使药剂配置成片剂，丸剂，糖衣丸剂，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆液，悬浮液，及其类似物，以便病人吞服。口服用途的药物制剂将活性成份与固体赋形剂合用，也可根据需要将混合物研磨，加工颗粒性混合物，如果需要，加入适宜的辅助剂，由此获得药片或糖衣药丸的核心。适宜的赋形剂是碳水化合物或蛋白质填充物，如糖类，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇，或山梨醇；玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，或其他植物淀粉；纤维素，如甲基纤维素，氢氧丙甲基纤维素，或碳氧甲基素钠盐；树胶类包括阿拉伯胶和黄蓍胶；蛋白质如明胶和胶原。如过需要，也可加入分解剂或溶解剂，如交叉连接的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂藻朊酸，或这些化合物的盐类，如藻朊酸钠。
非肠道用药的药剂可能用说溶液来配制，优先采用生理相容性缓冲液来配制，如“Hanks’s”溶液，Ringer’s溶液，或生理性缓冲盐水，水溶性注射用悬浮液，如羧甲基纤维素钠，山梨醇，或葡聚糖。另外，活性成分的悬浮液也可制备成油性注射悬浮液。适当的亲脂溶剂或载体包括脂肪油；如芝麻油或合成的脂肪酸醚，如乙基油酸盐，或甘油酸，或脂质体。根据需要，相关的悬浮液也可含有适当的稳定剂或能提高化合物溶解性的试剂，以便制备高浓度溶液。
为便于局部和鼻腔用药，配方中将采用适宜于可使某些特殊屏障可被通透的穿透剂。这些穿透剂可在药典中查知。
本发明的药剂可用文献中已知的方式来制作(如通过常规的混合，溶解，颗粒化，糖衣制作，水磨，乳化剂，罐装胶囊，装箱，或冻干加工)。
该药剂的供应形式也可作为多种酸的盐类，这些酸包括但不限于盐酸，磺酸，醋酸，乳酸，酒石酸，苹果酸，琥珀酸，等。盐类比其相应的自由基形式更易溶于水性或其他质子溶剂。在其他应用场合，可优先制备一种冻干粉剂，该粉剂含下列物质的任何一种或全部组分1-5mM组氨酸；0.1％-0.2％的蔗糖，和2-7％的甘露糖醇，pH4.5-5.5，用前先结合于缓冲液中。
在药剂准备好后，将其放适当的容器内，并为指定条件的处理作好标记。为了C/EBPβ的应用，这种标记似应包括使用的剂量，频率和方法。
适合用于本发明的药剂包括这样的制剂，即其活性组分包含于能达到某种特定目的有效剂量内。而这种有效剂量的决定可参照文献进行。
对于任何一种化合物来讲，用于治疗的有效剂量的初步估计可通过细胞培养和/或在动物模型在测定。动物模型也可用来决定适宜的浓度范围和给药途径。这方面的资料进一步来决定人类的有效剂量和用药途径。一种有效治疗剂量是指活性成分可以减轻症状或病情时所需的剂量。治疗效率和毒性通过标准的药物学程序即在细胞培养和动物实验中进行(例如，ED50即半数治疗有效剂量)和LD50(半数致死剂量)。治疗和毒性作用之间的剂量比率是治疗指数(therapeutic index，表示为LD50/ED50)。
药剂呈现很高的治疗指数时则可优先采用。细胞培养测定和动物研究结果用来为人类应用配制剂量范围。含有这种剂量的制剂优先地处于循环浓度的范围内，而在此范围内包括ED50和很少的毒性或无毒性。在此范围内的剂量改变取决于所用的剂型，病人的敏感性，及用药途径。
准确的剂量将由开业医生决定，以便依据需要进行这种治疗的病人的相关因素来作出决定。剂量和使用方法要调整到能提供充分的活性分子的水平，或维持在理想的效果。需要考虑的因素包括病情的严重性，病人的总体健康状况，年龄，体重，性别，饮食，时间和用药频度，药物的组成，反应的敏感性，及对治疗耐受/反应。长效药剂可每3-4天，每周，或每两周一次，依据特定配方的半衰期和清除率来决定。
正常剂量也可根据病人情况和用药途径而加以改变。文献中可发现特定剂量和给药方法的指南。文献的技术采用了不同的配方来制备核苷酸制剂，这些配方要多于蛋白质或其抑制剂的制作配方。同样，针对特殊的细胞，条件，部位等情况，也将需要各种特异的多聚核苷酸或多肽的传送方法。
I.诊断在另外的具体应用中，能特异性结合C/EBPβ的抗体将能用于病情或疾病的诊断，这些病症具有纤维变形增加或减少的特征，或在C/EBPβ治疗后用此测定方法来检测病情变化(例如本发明的修饰性C/EBPβ)。
为制备抗体，不同的宿主包括山羊，兔，大鼠，小鼠，人类或其他动物，将被免疫注射具免疫原特性的或其片段或其寡肽。根据宿主的种类，可采用不同的佐剂来增强免疫反应。这些佐剂包括，但不限于福氏佐剂，矿物胶体例如氢氧化铝，和表面活性物质如熔血卵磷脂，多離子(pluronic polyols)，多聚陰離子，肽类，油乳化剂，钥孔滅虫血兰素和二硝基苯酚。用于人类的佐剂中，特别优先采用卡介苗(BCG)和棒狀杆菌體。
针对C/EBPβ的单克隆抗体可用任何一种技术来制备，这些技术通过连续的细胞培养来制备抗体分子，包括但不限于杂交瘤技术，人类B细胞杂交瘤技术，及EBV-杂交瘤技术。
此外，也发展了一种制备“嵌合抗体”的技术，是将小鼠和人类的抗体基因拼接在一起，所得的抗体分子具有合适的抗原特异性和生物活性，可用于文献中已知领域。另外，也可采用文献方法来生产C/EBPβ的单链抗体。具有相关特异性但又同时有特定独特型组成的抗体也可通过文献中已知方法的免疫性蛋白文库中链的移动实现的随机组合来产生。也可通过诱导淋巴细胞群体在体内产生抗体，或从重组的免疫球蛋白文库筛选所需抗体，或文献中已知的一组具有高度特异性的结合试剂。
也可产生含有对C/EBPβ有特异结合部位的抗体片段。例如，这种片段包括但不限于F(ab‘)2片段，该片段由胃蛋白酶水解抗体分子后得到，而Fab片段则可通过F(ab‘)2片段上二硫键的还原而产生。另外Fab表达文库也可建造来允许快速和方便地鉴定出单克隆抗体中具有理想特异性的Fab片段，如文献中报告。
不同的免疫测定方法可采用来筛选和鉴定具有理想特异性的抗体。若干操作流程用于竞争性结合或免疫放射测定方法用于已知特异性的多克隆或单克隆抗体。这些免疫测定典型地涉及测定由C/EBPβ与其特异抗体之间形成的复合体。
C/EBPβ的诊断测定包括运用抗体和一种标记物，以此检测细胞或组织中的C/EBPβ。抗体在使用中可以经过修饰或不经修饰，也可能标记中采用共价或非共价键方式与一种报告分子相连接。文献中先知的很多报告分子可被采用，其中已有一些在前面述及。不同方法已在文献中告知，并提供一种检测C/EBPβ表达水平的基础，这些方法包括ELISA，RIA，IFA和FACS。
本发明另一具体应用领域是，C/EBPβ的编码多聚核苷酸可用于诊断目的。可被利用多聚核苷酸包括寡核苷酸序列，反意RNA和DNA分子，和PNAS。多聚核苷酸可被用来检测和定量测定活检组织的基因表达量，在这些组织中，C/EBPβ的表达可能与疾病和/或病情减轻互相关联。诊断测定可能被用来区别C/EBPβ表达的缺失，出现和过度表达，并监测治疗干涉中C/EBPβ水平的调节。
一方面，PCR探针能通过杂交来探测多聚核苷酸系列，包括核组型序列，编码的C/EBPβ或紧密相关的分子，这种杂交技术也可用来鉴定编码C/EBPβ的核酸序列。探针的特异性，根据其是否来自高度特异区域，和杂交的严格程度，或扩增的程度(最大，高，中间，或低)将决定相关探针是否仅能鉴定出自然发生的C/EBPβ及其等位子的编码序列，或其相关序列(例如本发明的修饰性C/EBPβ)。
实验以下范例用来展示本发明的某些优先选择的具体应用实例，并不是用限定本发明的应用范围。
在下面的实验中，将会用到下述缩写词eq(equivalents，相似物，同等物)；mM(毫克分子浓度，millimolar)；μM(微克分子浓度，micromolar)；N(当量浓度，Normal)；mol(克分子，moles)；mmol(毫克分子，millimoles)；μm(微克分子，micromoles)；nmol(毫微克分子，nanomoles)；g(克，grams)；mg(毫克，milligrams)；μg(微克，micrograms)；Kg(公斤，Kilograms)；L(升，Liters)；mL(毫升，milliters)；μL(微升，microliters)；cm(公分或厘米，centimeters)；mm(毫米，millimeters)；μm(微米，micrometer)；nm(毫微米，nanometers)；h和hr(小时，hours)；min(分(钟)，minutes)；S and sec(Seconds)；℃(度，degrees Centigrade)；V/V(体积/体积比，Volume/Volume)；W/V(重量/体积比；Weight/Volume)；μci(微居里，microcuries)；FDA(美国食品药物管理局，United States Food and Drug Adiminstration)；DMEM(Dulbecco’sModified Eagle Medium)；LDL(低密度脂蛋白，Low-density lipoprotein)；DMF(二甲基甲胺N，N-dimethyl-formamide)；α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白，α-smooth muscleactin)；MDA(苯二酰二醛，malondi-aldehyde)；4-HNE(4-羟，4-Hydroxynonenal)；PBS(磷酸缓冲液盐水，phosphate buffered saline)；FBS(小牛血清，Fetal bovineserum)；K2CO3(碳酸钾，Potassium carbonate)；NaHCO3(碳酸氢钠，Sodiumbicarbonate)；MgSO4(硫酸镁，magnesium Sulfate)；MgCl2(二氯化镁，MagnesiumChloride)NaOH(氢氧化钠，Sodium Hydroxide)；FeSO4(硫酸铁，ferroussulfate)SD或S.D.(标准差，standard deviation)；SEM(均值标准误，Standarderror of the mean)；ATCC(美国典型组织培养物总汇，American Type CultureColleetion，Manassas，VA)；精確化學科技公司Accurate Chemical & ScientificCorp.(westbury，NY)精准化学科技公司；Becton Dickinson贝克汤，迪肯森(HuntValley，MD)；Amesham(Arlington Heights，IL)阿莫先姆公司；Charles RiverBreeding Labs(Wilmington，DE)查尔斯河育种实验室；Clonetics(Clonetics Corp，San Diego，CA)克隆技术公司；DuPont(Dupont CO，Wilmington，DE)杜邦公司；Hitachi(Hitachi Scientific Instruments，Meuntain View，CA)岛津科学仪器公司；Hoechst(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)赫彻斯特，圣塔-克鲁兹生物技术公司；Sigma(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)西格马化学公司；Molecular Probes(Eugene，OR)分子探针公司；Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)阿卜斯德特生物技术公司，Vector Laboratories(Burlingame，CA)载体实验室；和Alexis(SanDiego，CA)阿勒克舍斯。
除非另有说明，否则下述实验所用细胞株均从ATCC获得。除非下面另有说明，否则实验结果均表示为三复管的平均值(±SEM)，评估不同实验组之间平均值的差异采用费雪氏精准实验的七检验方法，P值小于0.05时被认为显著性差异。
本发明产生过程中对不同蛋白质数据进行过检索，包括阿特拉斯恢复系统蛋白质数据P1R1，P1R2，P1R3和PATX(http//speedy.mips.biochem.mpg.de/mips/avaible_databases.html)内含347,000个以上的蛋白质数据，包括22,000个以上的TVD和27,000个以上的EVS序列。亲细胞凋亡突变体包括小鼠Ala217，人类Ala266，和大鼠Ala105。
实施例1 细胞培养和转染成年雄性Sprague-Dawley大鼠和成年雄性C/EBPβ+/+和C/EBPβ-/-(Screpantietal，前述；和Bucketal.，(1999)，前述)，C/EBPβ-Ala217和C/EBPβ——Asp105转基因小鼠用来分离肝脏原代星形细胞(Houglumetal.，前述)。肝脏原代星形细胞分离时需要通过浸泡于胶原酶/链霉蛋白酶，然后按文献方法即尼柯豎茲一步密度梯度方法(Single stepdensity Nycodenz gradient，Accurate Chemical & Scientific)来进行纯化。(见Leeet al.，(1995)，前述)。细胞放置于I型胶原机质(Becton Dickinson)或EHS基质(Matrigel，Collaborative Biomedical产品)。细胞培养时加10％胎牛血清/10％小牛血清，然后用脂质转染剂(lipofectamine，GIBCO)来将DNA载体或用Chariot试剂(Activemotif)来将肽类物质(10μm)转染细胞(参见文献Houglum et al.，前述；Morris etal.J.Biol.chem.，27424942-24946(1999))。采用文献方法(见Houglum et al.，前述和Lee etal.，(1995)，前述)产生的转基因小鼠可表达大鼠C/EBPβ-Asp105突变或小鼠C/EBPβ-Ala217突变体，再将此转基因鼠与FVB小鼠回交。新霉素磷酸转移酶基因的出现可用Southern印迹方法测知，并以此对转基因小鼠进行鉴定。内源性表达的转染蛋白也可用针对HA或C/EBPβ的特异抗体来显示(Santa Cruz Biotechnology)。
C/EBPβ1-253表达中，丢失了一种二聚体域(Desconbes et al.，前述；Akira et al.，前述)(图4A组)同时又含有Thr217或Glu217，但不含有Ala217，这种表达并不阻碍细胞生长和存活。缺乏DNA结合域和二聚体域的C/EBPβ1-215和KI217VD磷酸化受体(图4A组)对细胞生存无影响。相反，C/EBPβ216-253Ala217，但不是T217或Glu217，也缺失活化和二体域，但却可促使对照细胞在野生型RSK表达后产生的、细胞凋亡(图4B组)。此外，C/EBPβ-216-253-Glu217是以挽救细胞免于水解灭活的突变型RSK的表达载体(RSKN‘C’)所诱导的细胞凋亡，这种RSK的点突变发生在ATP结合域(Nakajima et al.，前述；和Bucket al.，(1999)前述)(见图4B组)。采用共聚焦显微技术获得了与先前报告一致的结果(Mao et al.，前述，和Ritter et al.，前述)，即Procaspases1和8在活化的星形细胞的核和胞浆中被视察到，它们与C/EBPβ共处相同部位(图4C组)。采用HA的特异抗体来对活化星形细胞中的C/EBPβ-HA或C/EBPβ-216-253-HA进行免疫沉淀，显示磷酸化的Thr217和磷酸化类似物Glu217，两者均能与Procaspases1和8一起被共免疫沉淀出来，且其效率高于无磷酸化可能的Ala217(图4D组)。因此。C/EBPβ的活化和二聚体域(Descombes et al.，前述；和Akira et al.，前述)并不为星形细胞生存所需，也不与Procaspases1和8相缔合。
实施例2 荧光显微镜方法荧光标记物采用三通道(triple-channel)荧光显微镜来观察。荧光色素为異硫氰酸熒光素和德克萨斯红(分子探針molecular probes)。膜联蛋白V(+)细胞的数量通过在体显微镜技术测定(见Rudel和Bokoch，前述)，测定在所有细胞中进行，或在那些表达GFP指示蛋白的细胞中进行，这种GFP或与C/EBPβ蛋白一起共转染，或单独转染。这些测定值表示为在表达转染DNA的细胞中，膜联蛋白V(+)细胞所占的百分比率。每个实验时间点中，至少1000个细胞被分析，其中至少包括100个表达转染DNA的细胞(Buck andChijkier，EMBO J V.，15；1753-1765(1996)；Buck et al.，(1994)，前述；和Buck et al.，(1999)，前述。在某些实验中采用了ApoAlert线粒体传感器测定方法(Clontech)，方法中采用了一种阳离子染料，该染料聚集到健康细胞的线粒体时呈现红色荧光，而在凋亡细胞的胞浆中，因为其线粒体膜功能改变，致使染料仍为单体结构，因而呈现绿色(Green and Reed，前述)。细胞核形态分析采用Hoechst33342(molecular probes)对细胞染色来进行。共聚焦显微镜用来观察星形细胞，同时采用的抗体对C/EBPβ和procaspases8具有特异性(Santa Cruz Biotechnology)。
例如，在一组实验中，研究目的是试图查明ser105的磷酸化是否能使C/EBPβ有能力挽救细胞免于凋亡。活化的小鼠肝脏星形细胞培养于一种工型胶原基质中，结果发现，RSK的阳性显性突变体的表达(Nakajima et al前述)或用Lactacystin(一种蛋白酶体抑制物)来处细胞，均可诱导产生细胞凋亡过程。而磷酸化类似物rC/EBPβAsp105(Trautweinet al.，前述)的转染，同时也转CMV-GFP指导物，发现可使肝星形细胞免于凋亡，用在体荧光显微镜观察膜联蛋白-V-PE掺入结果证实了这一点(图5B组)。与C/EBPβ-Ala217相同，rC/EBPβ-Ala105也能诱导细胞凋亡，例如经激活的小鼠肝脏原代星形细胞，由于没有一个突变体含有一种RSK的磷酸受体域(Buck et al.，(1999)前述)。这些结果提示rC/EBPβ-Pser105(或rC/EBPβ-Asp105)能阻断凋亡途径，与C/EBPβ-PThr217同样有效，至少在述及的实验条件下是如此(图1)。
实施例3 动物程序和试验正如本文所述，想通过研究来确定是否可用CCl4，一种能诱导肝脏氧紧迫和Fibrogenesis(Houglum et al.，前述；和Chojkier，前述)的肝脏毒素，来促进肝星形细胞的活化。如本文所述，采用文献方法来产生了转基因小鼠，使其能表达大鼠的C/EBPβ-Asp105或小鼠的C/EBPβ-Ala217(Houglum et al，(1995)，前述)；Lee et al(1995)前述)，然后将其与FVB小鼠回交。新霉素磷酸转移酶基因的出现将被用来鉴定转基因鼠，方法是Seuthern印迹。
C/EBPβ+/+，C/EBPβ-/-和C/EBPβ-Ala217或C/EBPβ-Asp105转基因小鼠(25克)各自接受单一剂量的CCl4腹腔注射，CCl4溶于矿物油(1∶1，Vol/Vol) (50μl)，或仅为矿物油(25μl)(Buck et al.，(1999)前述)。12小时后，动物被用来进行免疫荧光分析，在共聚焦显微镜下进行(Buck et al(1994)前述)。星形细胞的鉴定采用了针对神经胶质纤维酸性蛋白和波形蛋白的特异抗体(Santa Cruz Biotechnology)。激活的Caspase3也通过其特异抗体来进行观察(Pharmingen)。
通过胶质纤维酸性蛋白和波形蛋白染色(Ankoma-Sey和Friedman，前述)来鉴定的肝星形细胞可在经CCl4单次剂量处理后的C/EBPβ+/+小鼠的肝脏中被诱导增生。相反，在C/EBPβ-/-和C/EBPβ-Ala217转基因小鼠的肝脏中，星形细胞的凋亡可被诱导发生(图3)，这是由于效应物caspase3的产生而被确认的。由于激活的P90RSK能在体外引起C/EBPβ上Thr217的磷酸化，因而有兴趣去查明在这些动物中，RSK是否能与C/EBPβ相缔合，如例4中所述。
实施例4 免疫沉淀和免疫印迹C/EBPβ，Procaspases1和8和RSK的检测需要采用针对C/EBPβ和RSK的特异抗体(Santa Cruz Biotechnology产品)和针对Procaspases1和8的特异抗体(Pharmingen)，将这些抗体作用于细胞和肝脏的溶胞产物进行免疫印迹[Buck etal.，(1994)，前述]，然后通过化学发光(Dupout)方法加以显示。这些结果为采用免拉RSK-5抗血清(J.Blenis友善提供)和抗-RSK R23820(Transduction Laboratories)抗血清所进行的测定所确认。友谊活化的P90RSK能在离体条件下引起C/EBPβ上Thr217的磷酸化[Buck etal.，(1999)，前述]，因而有兴趣确定RSK是否与这些活动物的C/EBPβ相缔合。在这些实验中，采用特异抗体对C/EBPβ进行免疫沉淀，这里，C/EBPβ来自肝脏原代星形细胞，而这些细胞则新鲜分离自CCL4处理的C/EBPβ+/+和C/EBPβ-Ala217小鼠，而免疫沉淀中。其结果指出，来自CCL4处理的C/EBPβ+/+小鼠，而不是C/EBPβ-Ala217小鼠，其星形细胞中的RSK与C/EBPβ之间的缔合升高，如图3所示。RSK的鉴定采用针对P90RSK的特异抗体(Santa Cruz Biotechnology)，该抗体与P70S6激酶无交叉反应。这些结果进一步采用其他两种特异抗体来加以确认，其中一种是抗-RSK-5抗血清(J.Blenis.友善赠与)，而另一种抗-RSK抗体(Transduction Laboratories供应)。当RSK蛋白被特异抗体免疫沉淀出来时，C/EBPβ被发现同时被面目仪沉淀出来，而此被共沉淀的C/EBPβ水平在CCL4处理的C/EBPβ+/+小鼠中始终呈现升高的现象。对照性免疫前血清，抗-β-半乳糖苷酶或纯化的免疫球蛋白G(IgG-产生的免疫沉淀物中，含有检测不出水平的RSK或C/EBPβ，从而确认了上述共免疫沉淀现象的特异性。这些发现强有力建议RSK对C/EBPβ上Thr217的磷酸化对肝星形细胞的生存是必不可少的。
实施例5 C/EBPβ的磷酸化小鼠和大鼠肝脏中分离出来的原代星形细胞在EHS(Matriget；Becto-Dickinson)(静止细胞)或I型胶原基质上(Couaborative Researdch)(激活细胞)培养到第4天，然后用Somci的最后30分钟培液加入20％胎牛血清)，然后参照文献方法作出双相类型图谱(见Trantwein efal，前述；Buck ef al.，(1999)，前述)。
为了观察Rsk在体外产生的磷酸化反应，参照文献方法，检测了SPg经免疫纯化的C/EBPβ，C/EBPβ-AThr217，rC/EBPβ和rC/EBPβ-Ala105。对含有AThr217或Pser105的磷酸多肽的鉴定建议采用公认多肽的移动试验来进行并通过特民抗体的采用来证实，这里采用的特异抗体针对人类的C/EBPβ/赖-绿-赖-丙-赖-赖-磷酸化苏266-缬-天冬-赖-组-绿-天冬氨酸KSKAKK-PhosphoT266VDKHSD(SEQ ID N016)，与小鼠的PThr217同源)和大鼠C/EBPβ(赖-脯-绿-赖-赖-脯-磷酸化绿105-天冬-酷-甘-酷-缬-绿(SEQ ID NO17))。
在实验中，为了查明I型胶原基质是否能诱导C/EBPβ产生磷酸化，小鼠肝脏的原代星形细胞被32P-Orthophosphate标记12小时，并被置于EHS(Matrigel)(静止细胞)或I型胶原(活化细胞)基质上进行培养。免疫沉淀的C/EBPβ的磷酸肽图谱显示，I型胶原基能诱导位点特异的磷酸化，这种磷酸化过程发生于内源C/EBPβ上的THr217，一种P90RSK的磷酸变体域(Buck ef al.，(1999)，前述)。
以及，如图1结果所示，另一个尚未被鉴定的磷酸变体位点。培养于EHS基质的小鼠静止星形细胞中，C/EBPβ的磷酸化过程微弱到可以忽略不计(见图1)。
尽管在进化过程中C/EBPβ-Thr217磷酸受体高度保守，这包括人类C/EBPβ(Cao efal.，前述；Akira ef at.，前述.，和Yamaoko.ef al前述)。大鼠的(r)C/EBPβ还是发生了双实变，缺乏了Thr磷酸化受体(Descompes ef al，前述；和Pali ef al，前述)。C/EBPβ-PTh217或rC/EBPβ-Pser105对于细胞外因子诱导的细胞增殖来说是关键性的(Bucket al.，(1999)前述)。为测试I型胶原基质是否能诱导γC/EBPβ的磷酸化，大鼠肝脏中分离出的原代星形细胞采用32P-orthophos-phate标记12小时，并培养于EHS(Matrigel)(静止细胞)或I型胶原基质上(活化细胞)。免疫沉淀后C/EBPβ的磷酸肽图谱显示I型胶原基质能对内源γC/EBPβ上Ser105，一种p90RSK磷酸域(Buck et al.，(1999)前述)，和另一种尚未鉴定的磷酸受体位点(见图6A组)。培养在EH3基质上的大鼠静止期星形细胞，其γC/EBPβ含量可以忽略(见图6A组)。
另外，也查明C/EBPβ与其Thr217的磷酸化之间的功能相关性采用野生型(有意义)或反意义，的C/EBPβ表达载体对小鼠肝脏活化的星形细胞进行了转染。结果发现，能表达C/EBPβ反义而不是有义RNA(Buck ef al，(1994))的星形细胞未见增殖，在测定增殖细胞核蛋白的表达，也见到相似结果(BRAVO，ef al.，前述；Buck ef al.，(1994)，前述；Buckef al.，(1999)，前述)，但这未增殖细胞的膜联蛋白(annexin-v)与脑浆膜上的磷酸绿氨酸的结合却呈现增多，这种增多是细胞凋亡的一种早期指示(Rudel和Bokoch，前述)见图1C组)。为查明小鼠C/EBPβ上Thr217的磷酸化对于I型胶原，诱导的肝星形细胞时，采用了能表达无磷酸化可能性的C/EBPβ实变体的MSV表达载体。转染细胞的鉴定采用三通道熒光显微镜观察共转染的CMV-GFP(绿色熒光蛋白质)的方法来进行。表达C/EBPβ-LAa217实变体(Buck ef al(1999)，前述)的细胞未见增殖，同时变成凋亡的细胞，这一点通过活体显微镜(见图1C组)和针对转染指示物GFP和膜联蛋白V的细胞分选方法来确定。与此相反，磷酸化类似的C/EBPβ-GLu217实变体可使肝星形细胞免于被诱导产生细胞凋亡(Buckef al.，(1999)，前述)，但这发生在抗凋亡因子NFRB(Beg and Baltimore，前述，和Wang ef al.，前述)或RSK(BUCK ef al.，(1999)，前述，Bonni ef al.，前述，Bhattand Ferrell，.前述，Gross ef al.前述；Sassone-Corsi ef al.，(1999)，前述的缴活被阻断时(见图1D组)。
MEK纩酶1(MEKKI)对NFKB的激活需通过IKB激酶d和β的磷酸化继而使IKB的磷酸化来进行的(Lee ef al.，(1997)，前述)；Nakano ef al.，前述)，这中间通过泛蛋白-蛋白酶体途经经历了迅速的蛋白水解过程(Chen ef al，(1995a)，前述)。因而，对激活的原代星形细胞的转染采用了MEKKI，IKB2和RSK的阴性显性实变体的表达载体，或用能诱导细胞凋亡的Lactacystin(一种蛋白酶体抑制剂)来处理细胞。在各自情况下，由于有C/EBPβ217的表达从而避免了星形细胞凋亡过程的诱生，提示，当缺失激的NFKB或RSK时，C/EBPβ上Thr鼠的磷酸化足以维持肝星形细胞的生存。
为了查明小鼠C/EBPβ的功能相应性，及其Thr217的磷酸化，也对原代星形细胞的生存进行了调查(Screpanti ef al.，前述)，这里的星形细胞分离自C/EBPβ被靶向清除的小鼠，结果发现，只有C/EBPβ-/-小鼠，而不是C/EBPβC/EBPβ+/+小鼠的星形细胞对I型胶原的生长促进作用不敏感而开始凋亡，这是通过活化显微镜膜蛋白结合情竘而确认的(图2A和C组)。为研究C/EBPβ-PThr217对星形细胞生存的作用，发展出一种能表达。
无磷酸化可能的C/EBPβ-Ala217的阴性显性突变体的转基因小鼠。大学这种C/EBPβ-Ala217转基因小鼠虽然发育正常，但从这些动物肝脏中分离出的星形细胞却始终不能在I型胶原激活条件下存活(见图2A和C组)。通过一种线粒体传感器测定，可以测知线粒体膜通透性的增加。由此证实了分离自C/EBPβ-1-和C/EBPβ-Ala217小鼠的星形细胞的凋亡现象(见图2C组)。
实施例6由C/EBPβ-Ala217诱导的间质和癌细胞的凋亡，在这些实验中，C/EBPβ-Ala217被用于两种间质细胞系以测试其诱导细胞凋亡的能力。人类间质细胞系1321-N1(胶质癌细胞；获自Dr.Joan Brown，加州大学圣地牙哥分校)，RD(骨骼肌癌细胞；ATCC(进入号码CCL-136)，合成纤维细胞(98VA3N细胞，获自Dr.Jerry Vanden Berg，退伍军人管理局医学中心，加州圣地牙哥)，ES2(卵巢癌细胞系)，C3A(肝癌细胞系)，和MCF-乳腺癌细胞按文献方法培养于补充有小牛血清的极限必需培养基(见，例如，Buck et al.，EMBOJ.，B151-160(1994))。作为在本发明中被采用的细胞类型，本发明无意仅限于这些特殊的细胞系。确实，与此相似的结果已从采用其他类型的细胞而获得(例如，CCF-STTG1细胞(ATCC进入编号CRL01718))(未显示数据)。
按文献已知方法对细胞进行了共转染，所用的载体能表达指示蛋白GFP和C/EBPβ-Ala217(见Buck et al.，Mol.Cell，41087-1092(1999))。对照细胞只用GFP进行转染。转染后第4小时，细胞被用来测定其膜联蛋白与暴露于胞浆膜上的磷酸绦氨酸的结合特征，即细膜凋亡的一种早期指标，如文献所知，采用活体显微镜和商业上可获得的细胞凋亡检测试剂盒(研究发展系统公司，R & D(1997))。
无磷酸化可能的C/EBPβ-Ala217突变体的表达诱导了这些间质细胞的凋亡，如表2所示如下表1.由C/EBPβ-Ala217导致的间质和癌细胞凋亡
P＜0.01因此，上述数据指出，C/EBPβ-Ala217将被发现可用来作为一种治疗剂，用于治疗包括癌细胞在内的不同组织和细胞类型的纤维变性。
实施例7半胱氨酰天冬氨酸激酶原的激活(Procaspases)和半胱氨酰天冬氨酸激酶(Caspase)和活性。
在这些实验中，纯化的重组和合成的C/EBPβ多肽被用于检测其对纯化的重组Procaspases1和8的活化的抑制能力(Alexis Biochemicals)。
纯化的重组性C/EBPβ多肽，如文献方法进行表达(见Descombes et al.，Supra；andBuck et al.，(1994)，前述)，和纯化的合成的N-乙酰基，C-醛基四肽(200μM)(美国肽类公司)用于测定其对纯化的重组的类Caspases1(Catalogue#201-056)和8(Catalogue#201-0410C005)(Alexis Biochemicals)。Caspase8的序列包括被克隆进一种在其N端含有一个21个氨基酸连接物的表达载体的Ser217到Asp439之间的序列片段。因此，其前区域(前220个氨基酸基本被删除了。该片段在Asp385位点被裂解，同时该激活的Caspase与那些在凋亡细胞中被鉴定出的Caspase基本相同(Stennicke and Salvesen，Meth EnzymoL，32291-100(1997))。Caspase活性的测定通过磷酸一硝基丙氨酸(P-Nitroalanine)比色(Colormetric)底物的释放来进行，对Caspase1(Catalogue#260-026)或8(Catalogue#260-045)的测定均要求在动力测定的直线部分来进行(Thornberry et al.，(1997)，前述；Stennicke and Salvesen，前述)。细胞中Caspases1和8的活性的测定通过使用成色试剂盒(Catalogue#850-2110K和850-221-K)来进行，并参照厂家说明(Alexis)(见Thornberry et al.，(1997)，前述)。Caspase8的抑制物IETD来自加州生化公司(Calbiochem)(Catalogue#218773)。
假定牛和人类的C/EBPβ的磷酸受体含有一种KT217VD序列(Buck et al.，(1999)，前述)，由RSK诱导的磷酸化能在功能上被C/EBPβ-Glu217序列中的KE217VD所模拟(Bucket al.，(1999)，前述)，且后者又相似于一种在Caspase的抑制物/底物中发现的XEXD箱形体，因而通过实验来调查C/EBPβ-PThr217是否与Procaspases相缔合。结果表明，采用特异抗体进行免疫沉淀，可显示C/EBPβ，这种C/EBPβ存在于新鲜分类自C/EBPβ+/+和C/EBPβ-Ala217转基因小鼠的肝脏星形细胞。采用特异抗体了鉴定出起始物Procaspases1和8(见图3D组)但不是效应物Procaspases3，6和7(Thornberry and Lazebnik，前述；Ashkenazi and Dixit，前述；and Earnshaw et al.，前述)，这是在针对C/EBPβ的特异抗体，而不是对照IgG，的免疫沉淀物中鉴定到的，而这种免疫沉淀物来自经Ccl4处理C/EBPβ+/+小鼠后被激活的星形细胞。
在Cel4处理后的C/EBPβ-Ala217小鼠的细胞中，以及在对照矿物油处理后的C/EBPβ+/+小鼠的细胞中，C/EBPβ与Procaspases1和8的缔合仍处于基线水平(图3)。但经Ccl4处理的C/EBPβ-/-或C/EBPβ-Ala217而不是C/EBPβ+/+小鼠，其星形细胞中的起始物caspases1和8(见图3)以及效应物caspases3(见图3)的活性均升高。这些结果说明C/EBPβ序列中Thr217的磷酸化或其磷酸化类似物C/EBPβ-Glu217突变体对于C/EBPβ与Procaspases1和8之间的缔合是需要的，同时提示这种缔合有可能防止Procaspases1和8的加工和活化，因为KPhospho-T217VD或KE217VD均不是caspases1祸的优先性底物(Wilson et al.，前述；Margolin et al.，前述；和Earnshaw et al.，前述)。
为阐明C/EBPβ对于Procaspases1和8活化过程的作用，在体外诱导产生了重组性Procaspases1和8的自身活化过程(Wilson et al.，前述；Margolin et al.，前述；和Earnshaw et al.，前述)。同时也澄清了纯化之重组C/EBPβ多肽对这种加工过程的作用，这种重组多肽的按前述方法产生的(Descombes et al.，前述；和Buck et al.，(1994)前述)。与上述体内实验结果相一致，C/EBPβ-HA-Glu217和C/EBPβ216-253-HA-Glu217多肽，但不是C/EBPβHA-Ala217多肽，可与Procaspases1和8缔合(见图5A组)。重组的C/EBPβ-Glu217和人工合成的多肽段AC-KPhospho-T217VD-CHO和AC-KE217-VD-CHO均对Procaspases1和8的活化过程产生抑制作用(见图5B组)。此外还发现，在活化的肝脏星形细胞中，细胞通透性肽片段AC-KA217VD-CHO对细胞凋亡过程产生诱导作用(见图5C组)。
在上述说明中提及的所有发表文献和专利均已被编进参考文献内。对本发明所述的方法和系统的不同方式的修改和变动也将被认为是在上述文献和专利中显而易见的，因而并未偏离本发明的范围和违反本发明的精神实质。尽管本发明结合了一些特别优先的应用实例来加以叙述，但这些被理解为本发明在申请权利要求时，不应该被不适当地仅限于这些特性的具体实用案例。实际上，贯穿本发明的那叙述方式的不同改变都可明显见于上述文献和专利，因而有意将这些修改和变动均纳入本发明的范围之内。
权利要求
1.一种用来增加细胞凋亡的方法，其特征在于该方法的组成如下a)前提条件i)至少一种细胞；和ii)一种多肽，该多肽由一种或者多种四肽序列构成，在此处所提及的四肽序列中，至少有一种或多种序列是选自一组四肽序列，而这组四肽序列中含有KAVD和KKPA；以及b)将上述多肽施用语这里涉及的细胞从而使这种细胞的细胞凋亡被增加。
2.根据权利要求1所述的一种用来增加细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所提及的四肽序列是KAVD。
3.根据权利要求1所述的一种用来增加细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的四肽序列是KKPA。
4.根据权利要求1所述的一种用来增加细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的细胞是选自下列一组细胞，其中包括肝脏细胞，肺脏细胞，肾脏细胞，皮肤细胞，肌肉细胞，心脏细胞，神经胶质细胞，眼球细胞，血管细胞，神经细胞，上皮细胞，内皮细胞，和间质细胞。
5.根据权利要求1所述的一种用来增加细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的细胞是癌细胞。
6.根据权利要求5所述的一种用来增加细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的癌细胞是转移性的癌细胞。
7.根据权利要求1所述的一种用来增加细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的细胞是体外即离体条件下的细胞。
8.根据权利要求1所述的一种用来增加细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的细胞是指某一主体内的细胞或在体细胞。
9.一种用来降低细胞凋亡的方法，其特征在于其组成如下a)前提条件i)至少一种细胞；和ii)一种有一种或多种四肽序列构成的多肽，在这里所说的四肽序列中，至少有一种或多种四肽序列是从下列一组四肽序列中选出，这组四肽序列中包括KEVD，K-PhosphoT-VD，KKPD，和KKP-PhosphoS；以及b)将上述多肽施用于所说的细胞从而使所说的细胞其细胞凋亡得以降低。
10.根据权利要求9所述的一种用来降低细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的四肽序列是KEVD。
11.根据权利要求9所述的一种用来降低细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的四肽序列是K-PhosphoT-VD。
12.根据权利要求9所述的一种用来降低细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的四肽序列是KKPD。
13.根据权利要求9所述的一种用来降低细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的四肽序列是KKP-PhosphoS。
14.一种用于降低某种组织只癌细胞产生的方法，其特征在于该方法组成如下a)前提条件为i)一种组织；和ii)一种多肽，该多肽由一种或多种四肽序列构成，这里所说的四肽序列中至少一种或多种是选自由KAVD和KKPA组成的一组四肽序列；以及c)将上述多肽施用于所说的组织从而使该组织中的癌细胞数量得以降低。
15.根据权利要求14所述的一种用于降低某种组织只癌细胞产生的方法，其特征在于其中所说的四肽序列是KAVD。
16.根据权利要求14所述的一种用于降低某种组织只癌细胞产生的方法，其特征在于其中所说的四肽序列是KKPA。
17.根据权利要求14所述的一种用于降低某种组织只癌细胞产生的方法，其特征在于其中所说的组织存在于某一种哺乳动物主体中。
18.根据权利要求17所述的一种用于降低某种组织只癌细胞产生的方法，其特征在于其中所说的哺乳动物主体是指人类。
19.根据权利要求14所述的一种用于降低某种组织只癌细胞产生的方法，其特征在于其中所说的主体是其相关组织中被怀疑出现了癌症细胞的主体。
20.根据权利要求14所述的一种用于降低某种组织只癌细胞产生的方法，其特征在于其中所说的主体是指其相关的组织中有癌细胞出现的主体。
21.一种用来降低某种作战的纤维变性(或纤维化)的方法，其特征在于其组成如下a)前提条件为i)某一组织；和ii)某一多肽，该多肽由一种或多种不同的四肽序列构成，这里所说的四肽序列中，至少一种或多种是选自由KAVD和KKPA组成的一组四肽序列；和b)将上述多肽施用于上述组织由此使该组织中的纤维变性得以降低。
22.根据权利要求21所述的一种用来降低某种作战的纤维变性(或纤维化)的方法，其特征在于其中所说的四肽序列是指KAVD。
23.根据权利要求21所述一种的用来降低某种作战的纤维变性(或纤维化)的方法，其特征在于其中所说的四肽序列是指KKPA。
24.根据权利要求21所述的一种用来降低某种作战的纤维变性(或纤维化)的方法，其特征在于其中所说的组织存在于某一种哺乳动物主体。
25.根据权利要求24所述的一种用来降低某种作战的纤维变性(或纤维化)的方法，其特征在于其中所说的哺乳动物主体是指人类
26.根据权利要求21所述的一种用来降低某种作战的纤维变性(或纤维化)的方法，其特征在于其中所说的主体是指其体内的某种组织中被怀疑有纤维变性产生的主体。
27.根据权利要求26所述的一种用来降低某种作战的纤维变性(或纤维化)的方法，其特征在于其中所说的纤维变性选自如下一组纤维变性，其中包括肝脏纤维变性，肺脏纤维变性，肾脏纤维变性，或眼球纤维变性。
28.根据权利要求27所述的一种用来降低某种作战的纤维变性(或纤维化)的方法，其特征在于其中所说的肝脏纤维变性与肝脏移植排斥相关，也与丙肝感染，乙型感染，肝酒精中毒，肝中毒，遗传性血色素沉淀着症，卟啉症和肝硬化相关。
29.根据权利要求26所述的一种用来降低某种作战的纤维变性(或纤维化)的方法，其特征在于其中所说的纤维变性与一重疾病相关，这种疾病选自下列一族疾病，其中包括脑神经胶质纤维变性，阿尔茨海默病，肝病，脑损伤，神经性创伤，神经纤维变性，心肌梗塞，动脉硬化，纤维化皮肤病变，和纤维化肝脏疾病。
30.一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法，其特征在于其构成如下a)前提条件为i)某一种组织；和ii)某一种多肽；该多肽的构成为一种或多种四肽序列，而这种四肽序列中至少一种或多种是选自由包括KEVD，KPhosphoTVD，KKPD和KKPphosphoS在内的一组四肽序列；和b)将上述多肽施用于上述组织由此使该组织中的细胞凋亡得以降低。
31.根据权利要求30所述的一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的四肽序列是KEVD。
32.根据权利要求30所述的一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的四肽序列是K-PhosphoT-VD。
33.根据权利要求30所述的一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的四肽序列是KKPD。
34.根据权利要求30所述的一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的四肽序列是KKP-phosphoS。
35.根据权利要求30所述的一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的组织存在于某一种哺乳动物主体内。
36.根据权利要求35所述的一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的哺乳动物主体是指人类。
37.根据权利要求30所述的一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的主体其体内的某种组织中存在或被怀疑存在有细胞凋亡的现象。
38.根据权利要求37所述的一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法中，其特征在于其中其所说的细胞凋亡与创伤，烧伤，损伤，环境毒素或局部缺血相关。
39.根据权利要求37所述的一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的细胞凋亡与某一种疾病相关，而这种病症存在于某一组织中，而这种组织选自下列一组组织，其中包括肺组织，肾组织和眼球组织。
40.根据权利要求37所述的一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的细胞凋亡与一种肝病相关，这种肝病选自下列一组肝病，其中包括肝脏移植排斥，丙肝感染，乙肝感染，肝酒精中毒，中毒性肝病，遗传性血色素沉着症和卟啉症。
41.根据权利要求37所述的一种用来降低某一组织中细胞凋亡的方法中，其特征在于其中所说的细胞凋亡与一种疾病相关，这种疾病选自下列一组疾病，其中包括脑疾纤维变性，阿尔茨海默病，肝病。脑损伤，神经性损伤，神经变性，心肌梗塞，动脉硬化，纤维化皮肤病变，和纤维化肝脏疾病。
42.一种多肽，其特征在于该多肽的组成中含有一种或多种四肽序列，该四肽的组成中，至少有一种或多种四肽序列选自由KAVD和KKPA组成的一组四肽序列，这种序列至少能与Procaspases1和8中的一种相结合，而这种结合能使Procaspases被激活。
43.根据权利要求42所述的一种多肽，其特征在于其中所说的四肽序列是KAVD。
44.根据权利要求42所述的一种多肽，其特征在于其中所说的四肽序列是KKPA。
45.一种多肽，其特征在于该多肽的组成中含有一种或多种四肽序列，该四肽的组成中，至少有一种或多种四肽序列选自由KEVD，KPhosphoTVD，KKPD和KKPphosphoS组成的一组四肽序列，而这种序列至少能与Procaspases1和8中的一种相结合，而这种结合可以降低所说的Procaspases的活化。
46.根据权利要求45所述的一种多肽，其特征在于其中所说的四肽序列是KEVD。
47.根据权利要求45所述的一种多肽，其特征在于其中所说的四肽序列是K-PhosphoT-VD。
48.根据权利要求45所述的一种多肽，其特征在于其中所说的四肽序列是KKPD。
49.根据权利要求42所述的一种多肽，其特征在于其中所说的四肽序列是KKP-phosphoS。
全文摘要
本发明总的来讲涉及到对具有细胞过度增生和/或者活化特征之疾病的治疗和预防。本发明特别提供了若干制剂和方法用于抑制包括，但不限于间质衍生性细胞在内的多种细胞的活化和/或者增生。本发明提供的制剂和方法优先用于抑制包括但不限于肝脏星形细胞在内的多种间质衍生性细胞的活化和/或者增生，以及用于抑制具有异常细胞生长特征的细胞(如肿瘤细胞)的活化和/或者增生。本发明提供的制剂和方法更特别优先地用于阻断或者消除纤维变性。此外，本发明提供的制剂和方法也可用于诱导产生纤维变性。本发明提供的制剂和方法也可进一步用于防治癌症。
文档编号C07K14/435GK1678336SQ03808927
公开日2005年10月5日 申请日期2003年2月21日 优先权日2002年2月21日
发明者马里奥·赛基亚, 玛蒂娜·巴克 申请人:加州大学校务委员会