专利名称：筛选放射性分子文库的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选由不同放射性分子组成的文库的非扩增方法，涉及获得的分子文库的产品及涉及所述方法在鉴别能选择性结合一特定组织或特定器官的分子、用于开发新的治疗化合物及医学成像造影剂及筛选药物中的应用。
在新药开发中，通过化学合成获得的或者衍生自生物界(天然物质)的化合物通常在体外测试中进行评价。这些筛选的主要功能是鉴别能与感兴趣的任何治疗性靶位(受体、酶等)高亲和性相互作用的化合物，或者分离相对无活性但将进入优化程序中的化合物。尽管这些筛选使得可以检测数千种非常原始的化合物，但它们中仅有极少一部分会成为动物研究的对象，而动物研究是成功获得用于人体健康的产品的一个必不可免的步骤。在所有这些体外筛选测试中，对于在动物体内测试的物质的结果所必需的参数如代谢稳定性或组织分布及消除性质未被加以考虑，说明这个策略有很大缺陷。更有效地揭示对人体健康有益的物质需要揭示新的筛选方法。
包含一个在体内选择的步骤的筛选方法已有描述。例如，R.PASQUALINI等(Nature，1996，380，364-366)描述了为小鼠注射通过噬菌体展示产生的肽文库；使用这种技术，文章的作者示出在扩增之后可以鉴别与某些器官特异性结合的配体。然而，方法的成功基本上依赖于体内选择的几个噬菌体的再扩增可能性，以获得由体内选择的噬菌体的蛋白质呈递的肽序列。
根据作者的描述，在这个文献中描述的方法应适用于基于噬菌体展示之外的原理的文库，在这种情况中，唯一需要的是在其结合之后鉴别组织中化合物的能力；然而，PASQUALINI等指出为了筛选化学分子，需要存在一个标记以进行扩增步骤，所述标记如一个核酸序列。
R.PASQUALINI等阐述的技术(Nature，1996，如上述)因此可以选择能特异性结合肿瘤的肽，例如，当这类肽与阿霉素偶联时，它们能提高这种药物对肿瘤的效力并且还降低其毒性。这种应用在W.Arap等的文章(Science，1998，279，377-380)中特别加以描述。
在申请人为La Jolla癌症研究基金会的PCT国际申请WO97/10507中，发明人E.RUOSLAHTI和R.PASQUALINI描述了一种获得能自身特异性定向于一种选择的器官或组织的分子的方法，该方法包括如下步骤-将一个噬菌体文库给予一个个体，-收集或回收所选择的器官或组织样品，-扩增噬菌体，及-鉴别能到达所选择的器官或组织的一种分子。
需说明的是所述不同的分子可以与一个标记(tag)如一个支持物连接。
在本PCT国际申请中·术语“文库”是指分子，如有机分子、肽、蛋白质或核酸的集合。
·附着于组成文库的分子的标记可以是一些分子共有的标记或者是特异性标记。本申请中描述的标记特别是塑料小珠(plastic microbeads)、寡核苷酸、噬菌体或分子，如生物素或血凝素。
到达其靶器官的分子的鉴别可例如通过单独的质谱分析或者质谱分析与气相层析分析组合进行，对靶器官也可以进行高效液相层析或者可以使用选择性提取的方法。
例如，需指出的是当所述文库包含一群与可通过PCR鉴别的寡核苷酸组成的特异性标记结合的有机化学分子时，优选从样品中除去基因组DNA以减少“寄生(parasitic)”PCR。
还需要指出的是一般而言足够数目的噬菌体到达靶器官，这有效地使得可以在扩增之后对它们进行鉴别，然后鉴别所述肽序列。
更准确地，实施例涉及筛选携带肽的噬菌体文库及鉴别到达脑、肾或肿瘤的肽。
然而，由E.RUOSLAHTI小组所述的方法基本上限于肽并具有许多缺点。
特别是-肽在噬菌体表面的呈递产生了空间和构象限制，这必然削弱了呈递的肽序列与潜在靶位之间的相互作用。另外，噬菌体在多种组织中扩散的能力较差以及针对这类颗粒的体内清除机制的存在相当大地限制了噬菌体展示方法；-在体内筛选步骤鉴别的是噬菌体。然而，噬菌体的结合不保证具有噬菌体携带的序列的肽将保存该噬菌体的分布性质。如果考虑到噬菌体和单独的肽之间的大小差异，则这种情况是更可能的。因此，实际上尽管通过筛选可以鉴别大量噬菌体，但不保证单个的肽将具有噬菌体的分布性质；-在噬菌体提取之后，它们必须通过细菌的转染而再扩增，这种限制使得在所述方法中加入一个额外的步骤；-由于噬菌体产生许多非特异性相互作用，因此E.RUOSLAHTI小组描述的方法必须包括一些体内选择步骤(通常为3个步骤)；这使得该方法操作起来非常费力而且有缺点，即体内筛选包括使用不同的动物及因此可能产生相当大的偏差的可变性；-这个方法未考虑到所述化合物的代谢和药物动力学(分布和清除)数据，因为体内筛选步骤是在噬菌体上进行的而不是在化合物自身上进行的；-这个方法确定了所选择的噬菌体而不是肽自身的组织分布的选择性，这是由于E.RUOSLAHTI小组使用识别噬菌体的抗体以确定其组织分布所致；没有其它的方式监测肽的组织分布。
因此，考虑到这些缺点，E.RUOSLAHTI小组所述的方法在揭示在人体健康中有益的分子领域中的价值有限。
也已经提议了其它一些方法，它们也使用体内步骤-US专利5,770,455描述了合成一种通过组合化学获得的产物文库的方法。需要说明的是这些方法组成了快速发现新配体的有力工具。
描述了通过组合化学进行合成的一些策略(空间-可寻址策略、断裂珠(split-bead)策略和重组策略)，它们的合成条件不同反应试管的形状、聚合物的类型、物理常数的控制(时间，温度，固相或液相处理，混合物类型及确定文库多个成员的结构的方法)。
在那个文献中提议的标记是特异于每个产物的(“标识符(identifier tag)”)。
因此该方法具有操作费力的缺点。
-PCT国际申请WO99/56789描述了使用通过组合化学获得的文库选择造影剂，更准确地，文库的每个产物都包含一个可检测标记；需要说明的是只在体内鉴别了具有所希望的分布图或所希望的清除图的标记。所述标记必须能不用取样及不需要处死动物而检测；适当的标记特别是发色团、重原子、放射性标记和磁性粒子；然而，分子文库必须含有大量必须能彼此区分的标记。不论这个说明书如何，这个PCT国际申请WO99/56789承认这是一个难以获得的理想情况，特别公认的是文库的不同成员与不同标记的比率理想上应为1∶1，但可以低如10000∶1，所述比率在1∶1-1∶1000、1∶1-1∶200、1∶1-1∶50及1∶1-1∶25之间。在这种情况中，即当文库的不同成员不全具有一个独特的标记时，提议使用一种间接检测标记的技术以鉴别相应于所希望的图谱的文库成员。另外，在那个申请中，推荐优选检测生物液(血液、尿液、脑脊液、胆汁等)中的标记；所述标记优选能被扩增(寡核苷酸、噬菌体)，这意味着如果文库的每个成员均以一种独特的方式标记，则这是最好的。因此这将回到以上揭示的技术及其缺点。在那个申请中，所述技术仅可有效地应用于用扩增独特标记或者通过与受体的特异性结合使用间接检测技术的情况中。
在前述的所有技术中，筛选的化合物与一个标记偶联以进行随后的鉴别，然而，这种标记的存在可以通过空间障碍阻止所筛选的化合物与其靶位相互作用。
因此，申请人提供了一种方法，该方法与现有技术中的方法相比更好地满足了实际需要，尤其是其使如下成为可能-从含有几千个化合物的混合物中选择能定向活动物体的一个组织或器官的分子，通过直接分析所筛选的化合物自身的组织分布来进行，及-鉴别具有特殊性质的分子，所述特殊性质着眼于其在医学成像或者针对治疗目的中的应用。
根据所研究的分子文库，应参考不同分子文库(例如通过组合化学获得的)或者生物分子文库(例如在肽文库的情况中)。
更准确地，本发明的一个方面是一种筛选分子文库的方法，其包括(1)将所述分子文库给予至少一种动物，其中每个分子均是预先标记的，特别是但不仅是在所述分子中存在的一个原子用其放射性同位素置换，(2)处死至少一只所述动物，并使用从中取样的组织或器官的切片，利用适当的成像或放射成像装置分析所施用分子的放射性组织分布；所应用的放射成像装置尤其是根据所检测的放射性原子选择的β-成像仪。例如，可以使用β-成像仪检测所述组织或器官切片上存在的发射β--粒子(3H、14C、32P、35S、125I、99Tc)或者发射β+-粒子(18F)的放射标记产物，(3)选择其中检测到放射性信号的组织或器官的切片，(4)通过适当的技术，如提取和/或层析技术从在步骤(3)中选择的所述组织或器官的切片中分离放射性部分，及(5)通过适当的分析技术，如层析和/或质谱分析使用在步骤(4)中获得的放射性部分鉴定所述分子。
当可以进行变化时，一个变化是步骤(2)包括利用适当的成像装置，在体外使用预先从组织或器官的细胞和切片中提取和选择的生物学样品分析预先给予至少一种动物的分子的放射性的组织分布。这种变化不因此而需要处死动物，因此在适当的条件下还适用于人体。
就本发明的目的而言，术语“动物”根据公认的分类方式包括非人动物和人。
根据本发明的筛选方法的一个优选实施方案，在步骤(2)之前，所述方法包括一个步骤(1’)以分析所给予的分子的放射性组织分布，这通过将至少一只动物进行外部成像，尤其利用具有照相机的适于检测所选择的放射性同位素发射的粒子的性质的检测装置来进行(18F、11C、64Cu、76Br、124I，、13N、15O正电子发射断层照相术，PET；99mTc、123Iγ-照相机)。
用氚放射标记的化合物的文库的体内筛选意味着要处死动物；事实上检测来自氚核的β-电子仅可以使用组织切片进行，因为超出几个μm则这些电子不再可检测；这解释了为什么步骤(1’)仅可针对某些放射性原子进行。
在本发明的方法的步骤(1)中，将放射性分子的每个文库注射入一或多个动物体内，优选腹膜内注射(I.P.)或静脉内注射(I.V.)；然后通过检测在不同器官或组织中的放射性而观测不同分子定向一组织或器官的能力[步骤(1’)和(2)]。检测的模式依赖于进行分子的放射标记所选择的放射性原子的性质，特别依赖于放射性示踪物发射的放射线的性质。进行观测的时间是一个可变参数。
步骤(1’)具有许多优点-其使得可以对活动物进行测试并因此获得药物动力学数据和鉴别配体的数据，所述配体的生物利用度、毒性和代谢性质与其随后的应用相一致；-其因此与仅包含体外步骤的方法相比具有一定的优势，尤其在细胞培养物上；-另外，其使得可以迅速显现给予的分子的分布及可以跟踪其动力学；因此可以计算放射性分子的清除动力学，以便确定直至哪点可以进行观测及确定进行步骤(2)所述组织分析的最佳时间。结果，进行步骤(2)所述分析组织分布的时间根据注射的分子的性质及其在生物体内的寿命而有所不同。因此可以在10分钟至48小时之间观测放射性；-其基于检测由某些放射性原子发射的高能放射线，特别是正电子发射断层照相术(PET)可以获得一种化合物在动物的所有区室中分布的外部成像，所述动物如大鼠或小鼠，或者某些灵长类动物。
本发明包括所述方法的实施-在其不同形式中，步骤(2)包括利用适当的成像装置在体外使用预先从组织或器官的细胞和切片中提取和选择的生物样品分析所给予的分子的放射性的组织分布；及-在其不同形式中，所述方法包括一个步骤(1’)(体内分析)。
在此方面，在人体中，本发明的方法当与一个分子文库一起使用时可用于进行诊断，所述分子文库是利用本发明的方法最初在非人动物体内预先选择的。
根据本发明的方法的优选实施方案，在步骤(2)中，放射性的组织分布是利用具有成像装置的、适于检测所选择的放射性同位素发射的粒子的性质的检测装置来显现的。
基于放射性的检测而分析化合物的组织分布的步骤根据如下条件可以快速选择文库A存在或不存在能在生物体中分布的化合物。
B定向选择性的标准，如果目的是鉴别能定向一特定器官，例如脑的化合物。
C存在高毒性化合物；所述文库然后被清除或者以更分立的混合物形式再合成，以便快速清除所述毒性化合物。
体内选择步骤及更特殊的步骤(1’)，具有双重目的-首先，显著减少随后进行研究的化合物的数目，事实上，所有被生物体快速清除或者快速代谢然后清除的分子随后不再被考虑；-其次，就保留在生物体内的少数化合物而言，获得关于其组织分布的信息及例如仅针对特殊组织，如肿瘤进行集中研究。
步骤(3)-(5)涉及给定组织或器官中存在的放射性化合物的化学鉴别。首先，这些步骤示出观测到的放射性仅是由于在起始文库中存在的分子所致。
更特别地，步骤(4)可以分离含有放射性的多种部分，尤其是在装备了放射性检测仪的装置上使用适当的层析而分离；然后将这些部分进行质谱分析(步骤(5))，以确定所述放射性产物的化学结构。这个步骤(5)因此可以正式鉴别分离的产物是否包含于起始文库中。
另外，(i)使用一个适当的成像装置以更敏感地检测给定组织或器官中放射性化合物的步骤与(ii)分析步骤，尤其是通过质谱分析的步骤组合，与仅使用质谱分析检测和鉴别所述化合物的方法相比显著提高了本发明方法的检测灵敏性。
换句话说，在分析之前，特别是通过质谱分析(步骤3-5)，组合放射性信号的检测(特别是步骤2)显著提高了检测的灵敏性(飞摩(fentomole)(10-15M)/mm2等级)。所使用的放射成像装置特别是一种β-成像仪，根据被检测的放射性原子而选择。例如，Biospace公司的β-成像仪在氚的情况中，可以检测在组织切片上存在的飞摩/mm2等级浓度的发射β-粒子的放射标记的产物；这种放射成像装置可以检测发射β-粒子的、检测阈值略低于氚的检测阈值的多种类型的放射性原子。
根据所述放射性原子，可以限定如下检测阈值(计数/分钟或cpm)3H0.07cpm/mm235S、14C、33P0.01cpm/mm232P0.1cpm/mm2因此，本发明的方法可以鉴别具有两种基本性质的化合物代谢稳定性和组织分布。这些步骤特别可以提取各种组织中存在的化合物，目的是鉴定其化学结构。使用放射性分子的选择是至关重要的，因为放射性的监测组成了一种非常灵敏的手段以在提取或者甚至纯化步骤期间监测感兴趣的化合物的存在情况。
一旦已经进行了多种分离步骤(特别是提取步骤)，所述化合物的化学结构通过质谱分析或者任何其它适当的分析方法，如HPLC进行鉴定。
更准确地，所述放射性分子以混合物形式注射，以能筛选大量的化合物。在给定的时刻，标记的强度依赖于化合物对一特殊位点的亲和性，这是由其药物动力学调节的。因此，所述筛选实验优选在不同时刻进行。这样可以建立药物动力学及评价预想的这些化合物随后的应用。
根据用于检测一个器官或组织中放射性分子的存在情况的观测技术，可以-对活动物进行分析在发射正电子的放射性原子，如氟18或者发射γ-射线的锝99的情况中，使用适于检测这种类型放射线的结合了照相机的检测装置进行；-或者在处死动物后进行检测及使用组织切片进行放射性检测。
在所有情况中，为精确进行分析，要处死至少一只动物。
关于可使用的动物类型无限制。实际上，在药理学中通常使用的所有动物均可以是研究对象。
根据本发明，在步骤(1)之前，所述标记的分子的文库通过如下步骤制备-通过化学或酶促途径合成所述分子的一种混合物(L-或D-肽，假肽，核酸，脂质，有机化合物)(组合合成)，及-用放射性同位素标记所述分子，所述放射性同位素如氚(3H)、碳14(14C)、碘131(131I)、碘125(125I)、磷32(32P)、氟18(18F)、硫35(35S)、锝99(99Tc)或铟113(113In)。
更准确地，在生物聚合物或生物分子(肽、假肽、核苷酸、核苷酸-肽混和的聚合物)的情况中，大量放射性分子的合成是通过组合合成进行的。在肽的情况中，在文献中描述的去卷积方法(重复分级分离(iterative fractionation)以分离混合物的不同分子)便于鉴别感兴趣的分子。通过大量平行固相合成(mass parallelsolid-phase synthesis)获得的非肽分子可以用于本发明的方法中，条件是它们是为了掺入一个放射性原子而被修饰。
由于上述分子是在固相合成的，因此导入放射性原子相对简单。例如在肽的情况中，固相合成产生一种肽，其N末端胺可以是游离的，而这些聚合物的侧链上携带的所有反应官能团仍被保护。这种性质因此可以非常选择性地通过仍与固体支持物结合的聚合物的N末端胺的简单酰化而导入携带放射性原子的基团，尤其使用可商购的众多放射标记的氚衍生物进行，如琥珀酰亚胺丙酸酯或乙酸酐可以酰化胺官能团，产生携带用氚放射性标记的这种胺官能团的化合物。相似的化合物可以通过酰化胺官能团而导入14C。用18F或99mTc对肽的放射性标记可以如例如A.HEPPELER等所述进行(Curr.Med.Chem.，2000，7，971-994)。
这些生物聚合物的合成也可以加以设计以便能在体内筛选步骤之后接受一个特殊的放射性原子。因此，可以合成肽文库，其中所有元件均掺入一个用非放射性碘碘化的酪氨酸，并且其中N末端是用氚标记的。在体内筛选之后，感兴趣的分子可以再合成，但此时在酪氨酸中掺入放射性碘。由于碘化的酪氨酸在筛选步骤期间已经存在，因此最终的放射性分子必须保存所有生物学活性。这个实例可应用于多种类型的生物聚合物，所述生物聚合物中掺入一个携带非放射性原子的合成子，但是一旦进行筛选则可以用其放射性同位素替代。这种策略特别适用于锝99或氟18。
正确放射标记的天然起源的分子也可以使用相同方法筛选。因此可以筛选微生物的提取物，其中所有分子均用不同的放射性同位素(例如3H、14C、32P、35S)放射性标记。当这些微生物在存在放射标记的营养物的条件下培养时，可以获得放射标记的生物量。天然提取物，如毒液(M.TAKEDA et al.，Toxicon，1974，12，633-641；E.KOCHVA et al.，Toxicon，1982，20，3，615-636)可以在给予动物放射性氨基酸以使其掺入在毒液腺中产生的毒素中的条件下，以放射标记的形式获得。可以揭示放射性标记的天然产物的策略以大量生产可用于本发明筛选方法中的放射标记的产物。
有利地，步骤(1)-(5)在步骤(1)中施用量不同的几个动物中同时进行，并且步骤(2)的分子的放射性分布的分析是根据动物而在不同的时间进行。
令人惊奇地，这种方法可以确定由分子文库组成的混合物中含有的一或多个分子与位于器官或组织中的一或多个特异性位点之间的特异性相互作用，而且无需特异性标记，也不需要预先扩增化合物。
本发明的方法特别具有如下优势-其非限于肽序列，可涉及所有类型的分子，特别是通过组合化学获得的分子，尤其是生物聚合物或生物分子，以及非肽分子和天然物质，特别是植物提取物；-放射标记不加以限制，因为文献中描述了关于通过化学或酶促合成获得的多种家族化合物的许多放射标记方法；另外，在天然物质的情况中，根据产生感兴趣的化合物的生物体的类型，可以建立导致产生生物合成的放射性化合物的策略。这种策略基于导入能进入所考虑的生物体的代谢循环的放射性分子。例如M.TAKEDA(见上述)或E.KOCHVA等(也见上述)等所述的放射标记肽的方法所提及的；-通过促进组织侵入，用小分子(与噬菌体相反)的文库进行体内筛选可以更有效地筛选生物体内存在的所有受体。因此使用这种类型的筛选可以更好地开发所述被考虑的文库中含有的分子多样性。从生物体中消除噬菌体的消除现象不再成为重要的限制；-在筛选的不同步骤对化合物的化学鉴别是相同的，这不是如上所述E.RUOSLHATI小组揭示的方法中的情况；-其可以直接观测筛选的化合物的组织分布；-其避免通过空间障碍而阻止所筛选的产物与其靶位相互作用的标记的存在；-其不需要扩增步骤；及-其可以研究所筛选的化合物的代谢和药物动力学(分布和清除)。
令人惊奇地，通过组合合成的产物的文库或集合的放射标记、组合化学、观测动物(根据情况的不同，是非人或人)的放射性的技术及从器官或组织中分离(例如提取)分子以使其通过质谱分析或其它适当的分析方法分析的方法，可以有效地鉴别配体，其生物利用度、毒性和代谢性质将与其随后的体内应用相一致，与现有技术揭示的不同，其中与放射性相比更复杂的标记被认为仅是可以有效检测标记的分子的标记。事实上，如果使用高能类型的及半衰期非常短以不危及动物的寿命的放射性发射物，在活动物中可以观测到一种放射标记的产物。这种类型的示踪物与低能示踪物相比因此非常有利；然而，这些示踪物的短寿命与体外(ex vivo)分析矛盾；在这种情况中，具有长寿命的示踪物，如氚即使它们不能用于动物的外部观测，也证明是非常有利的，尤其因为这种类型的示踪物的处理在安全性方面更相对无限制性。
与在分离的器官或细胞上进行的筛选不同，在细胞培养系统内修饰基因表达的范围内，包含在活动物上进行的一个步骤的筛选保证了配体靶向的受体的功能完整性。最后，与基于应用抗体的靶向方法相比，本发明的方法可以用低分子量的分子进行(平均1000Da)。与抗体相比，这种性质意味着更好的组织侵入并因此更好地开发在组织或器官中选择性表达的受体的所有组成成分。
另外，给出研究的化合物的大小，它们将不诱导对部分宿主的免疫应答。
根据本发明方法的另一个有利的实施方案，步骤(4)所述与所述器官相关的放射性分子的分离是根据如下步骤进行的-除去其中已经检测到放射性的器官，-在适当的缓冲液中研磨所述器官，-离心每种经研磨的材料并回收溶液，-过滤所述溶液，-调节pH，-分级分离并回收放射性部分。
更准确地，在肽的情况中，这个分离步骤可包括在离心经研磨的材料后回收溶液并进行过滤-酸化过滤物，-将所述过滤物经过一个含有与疏水性基团结合的硅石的柱以进行“反相”洗脱技术；根据文库或集合的化合物中正或负电荷的存在情况，可以有利地进行包含离子交换的层析方法，-通过分级分离收集洗脱物，及-选择含有放射物物质的部分，-在真空下浓缩所述放射性部分，-通过能保留分子量高于那些源文库的产物的滤膜进行过滤，-浓缩所述滤物，然后-通过高压层析(HPLC)分析所述样品，使用充填了反相支持物的柱进行；在分离柱的出口使用常规放射性检测仪检测放射性产物的存在。
根据本发明方法的另一个有利的实施方案，在步骤(5)中，通过质谱分析法进行的分析与串联质谱分析(MS/MS)相关。
根据本发明的再一个有利的实施方案，步骤(1)所述的文库分子具有如下通式丙基-3H-NH-Yaa-(R，S)Phe(PO2-CH2)(R，S)Leu-Yaa’-NH2，其中Yaa和Yaa’代表其中存在20个天然氨基酸的位置。
发现这种方法有许多应用，可以提及的特别是-揭示进行医学成像的新的造影剂；因为所筛选的化合物从开始就携带放射性原子，因此选择的分子可直接用于进行医学成像或者可以通过适当的技术加入与体内观测相符的造影剂而修饰。在这方面，含氚分子的文库是特别有利的，其中所有分子均携带氟19原子。一旦已经通过体内筛选进行选择，则可以合成鉴别的分子，此时掺入氟18，由此可以使用所述分子作为造影剂以用于基于通过适当的断层照相装置检测正电子的成像；-适于治疗性应用的化合物的产生；事实上，除了其与活生物体内非常精确的位点结合的能力之外，一些鉴别的分子可以具有特异的生物学活性并因此作为揭示治疗性化合物的基础；-靶向药物或者任何其它感兴趣的分子(通过将药物与一种选择的分子化学偶联而递送至特异性位点)。为将一种感兴趣的物质靶向于特殊的组织或器官，事实上可以预想将这种感兴趣的物质与通过本发明的方法鉴别的分子化学偶联，并因此能将其递送至一个组织空间然后至一个特异性位点；-鉴别在给定的组织或器官内选择性表达的新受体。
本发明的方法可以鉴别在给定的组织或器官中选择性表达的新受体。这种类型的信息和鉴别对揭示新的治疗策略非常重要。在同一步骤中，鉴定选择性配体及其还未鉴别的相关的选择性受体对通过揭示其上结合了特异于这种受体的配体的亲和柱而分离这种受体至关重要。这种相同的配体代表一种起始结构，基于其可以设计其它配体，特别是用于治疗目的。
这种方法因此还可以研究多种病理学。事实上，导致在正常个体内难以或一点也不表达的某些受体过表达的病理学可以通过本发明的方法容易地检测。因此，正常和患病动物之间选择性标记的证实在诊断、治疗、成像及将药物靶向于患病组织或器官方面非常有益。例如，这种方法涉及不用标记动物的正常组织或器官而鉴别能选择性结合原发或继发肿瘤的化合物的能力。
在此方面，应注意用相同的文库注射正常动物应是根据不同之处鉴定特异于一病理的受体表达的手段，及因此出于同样的原因也是揭示特异于所给定病理的标记的手段。
优选地，所述分子或配体的合成是使用本领域已知的技术在固相进行的，例如使用含氚乙酸酐酰化与固体支持物结合的肽的NH2-末端官能团而将一个CT3-CT2-CO基团导入N末端位置。
本发明的一个主题涉及一种进行本发明的所述筛选方法的试剂盒，其特征在于包含-至少一个标记的分子的文库，其中每个分子均预先标记，特别是但不排除用其放射性同位素之一置换所述分子中存在的原子，-检测放射性标记的产物的方法，特别是选自适于检测在器官或组织的切片上检测的放射线的成像装置，-分析检测的放射性标记的产物的手段，如HPLC和/或质谱分析。
本发明的一个主题涉及一种使用一种分子文库鉴别及研究在器官或组织中选择性表达的靶分子(或受体)的方法，所述方法包括(1)为至少一只动物给予所述分子文库，其中每个分子均预先标记，特别是不排除用其放射性同位素之一置换所述分子中存在的一个原子，(2)处死至少一只所述动物并利用上述适当的成像装置分析所给予的分子的放射性的组织分布，通过对动物取样并分析多个组织切片进行，(3)选择其中检测到放射性的组织或器官的切片，(4)从在步骤(3)中选择的组织或器官的切片中分离放射性部分，通过适当的分析技术进行，如提取和/或层析，(5)使用在步骤(4)中获得的放射性部分鉴定所述分子，通过适当的分析技术进行，如层析和/或质谱分析，(6)将在步骤(5)中获得的分子与根据步骤(2)选择并获取的组织或器官样品在一定条件下接触，所述条件是使在步骤(4)中分离的分子与靶分子之间结合并形成一种复合物，及(7)从所述复合物中分离所述靶分子。
一种可能的变化是步骤(2)包括分析所施用的分子的放射性组织分布，利用适当的成像装置在体外使用预先从组织或器官的细胞和切片中提取并选择的生物学样品进行。这种变化因此不需要处死动物。
根据本发明的一个有利的实施方案，在步骤(2)之前，所述方法包括步骤(1’)以分析所施用的分子的放射性组织分布，通过将至少一只动物进行外部成像进行，特别是利用适于检测由选择的放射性同位素发射的离子的性质的检测装置结合照相机而进行(18F、11C、64Cu、76Br、124I、13N、15O正电子发射断层照相术，PET；99mTc、123Iγ-照相机等)。
这个方法的步骤(7)特别使得能更精确地研究已经鉴别的化合物的性质。再次合成、放射性标记并研究通过体内筛选选择的每个分子以例证其组织分布能力，通过用于筛选的相同方法进行。
本发明的一方面是一种将一个感兴趣的分子靶向于特定的组织空间和/或位点的载体，特征在于其包含如上述通过筛选分子文库的方法选择的分子，而且所述位点的组织分布已经使用这种方法鉴别。
本发明的一个主题涉及一种位点特异性组合物，特征在于其包含(i)靶向于所述位点的一种感兴趣的分子，其与特异于所述位点的分子偶联，所述分子的组织分布已经通过上述筛选分子文库的方法鉴别，及(ii)至少一种药物可接受的赋形剂。
本发明的一个主题涉及通过如上述筛选分子文库的方法选择的标记的分子在制备用于医学成像的组合物中的应用。
根据所述应用的有利的实施方案，所述标记的分子与一种适当的造影剂相关联。
本发明的一个主题涉及鉴别一个感兴趣的分子的至少一个靶位(例如受体)的方法，特征在于其包括至少(1)将感兴趣的分子与如上述通过筛选分子文库的方法选择的特异于所述靶位的放射标记的分子偶联，以获得一种放射性标记的缀合物，(2)给予至少一只动物步骤(1)中获得的缀合物，及(3)使用一种生物学样品在体外分析所述生物学样品的至少一个靶位与偶联于所述放射性标记的分子的感兴趣的分子的结合。
本发明的一个主题涉及一种通过竞争在体内筛选未标记的分子的方法，该方法特征在于包括(1)给予至少一只动物一种标记的分子，所述分子的组织分布已经如上述利用筛选分子文库的方法鉴别，(2)第一次分析在步骤(1)中给予的放射性分子的组织分布，通过将至少一只动物进行外部成像，特别是利用适于检测由所选择的放射性同位素发射的粒子的性质的检测装置结合照相机进行，(3)给予未标记分子的文库，(4)第二次分析放射性分子的组织分布，通过将至少一只动物进行外部成像，特别是利用适于检测由选择的放射性同位素发射的粒子的性质的检测装置结合照相机而进行，(5)通过与标记分子的分布的第一次分析相对比确定由至少一种未标记的分子代替标记的分子的药物动力学，及(6)检测改变了标记分子的药物动力学的至少一种未标记的分子，通过适当的分析技术，如层析和/或质谱分析重复分级分离(去卷积方法)和鉴定所述分子。
一种可能的变化是步骤(2)和(4)包括分析所给予的分子的放射性组织分布，利用适当的成像装置在体外使用预先从组织或器官的细胞和切片中提取并选择的生物学样品进行。
本发明的一个主题涉及一种分子文库的化合物，通式为丙基-3H-NH-Yaa-(R，S)Phe(PO2-CH2)(R，S)Leu-Yaa’-NH2，其中Yaa代表Arg，及Yaa’代表Leu，其可以通过如上述筛选分子文库的方法获得。
令人惊奇地，通过本发明的方法选择的通式为丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2的这个化合物特别具有如下性质-其在体内是锌肽酶ACE(血管紧张肽I-转换酶)和NEP(中性内肽酶或脑啡肽酶(neprilysin))的一种强力抑制剂，因此在心血管病变中发现有应用价值；-其可以穿过血脑屏障并因此可具有上述应用价值，特别是当其在如下方法中被标记时(1)在医学成像中，(2)在靶向感兴趣的分子的方法中，通过将这个感兴趣的分子与这个肽在脑部偶联而进行，(3)在筛选在脑特异性表达的分子的方法中。
已经描述了其它具有不同通式的膦肽(phosphinic peptides)(French patent application No.8914978；French patent application No.9105403；French patent application No.9501328；French patentapplication No.9808464)，其中一些(见French专利申请No.9808464)呈现对ACE的抑制活性；然而，令人惊奇地，根据现有技术，表现为ACE和NEP的混和抑制剂的大多数化合物的化学结构在其C末端具有一个游离的羧酸盐基团，其被认为是获得所述抑制剂与这两种肽酶之间强相互作用所必需的基团(Bralet et al.，Tips，2001，22，3，106-109；Weber，The Lancet，2001，358，1525-1532；Fink，Exp.Opin.Ther.Patents，1996，6，11，1147-1164)，化合物丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2不包含这个基团，尽管其有效抑制这种混和活性。
所述肽具有上述应用，主要是-一种药物；-一种靶向感兴趣的分子的载体，尤其在脑部；-在医学成像中的一种位点特异性组合物；-用于鉴别至少一个靶位(例如受体)的方法中；-用于通过竞争直接在体内筛选未标记的分子的方法中。
更准确地本发明的一个主题涉及一种药物，特征在于其包含至少化合物丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2及至少一种药物可接受的载体。
本发明的一个主题涉及靶向载体或者用于靶向转移一种药物的一种载体，特征在于其由化合物丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2组成。
本发明的一个主题涉及如上述化合物(丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2)，其用选自氚(3H)、碳14(14C)、碳11(11C)或磷32(32P)的放射性同位素标记。
本发明的一方面是用于医学成像的一种组合物，特征在于其包含如上述化合物(丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2)及至少一种药物可接受的赋形剂，所述化合物用放射性同位素标记并任选与另一种化合物偶联。
本发明的一个主题涉及如上述标记的化合物在制备用于医学成像的组合物中的应用。
本发明的一个主题涉及如上述鉴别一种感兴趣的分子的至少一个靶位的一种方法，特征在于所述放射标记的分子是放射标记的丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽。
在这种情况中，所述靶位优选位于脑部。
本发明的一个主题涉及在体内通过竞争筛选未标记的分子的一种方法，其中放射标记的分子是放射标记的丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽。
除了上述规定之外，本发明还包含其它规定，其通过参照本发明方法的实施例及如下附图的描述而显现，其中-
图1示出了通式丙基-3H-NH-Yaa-(R，S)Phe(PO2-CH2)(R，S)Leu-Yaa’-NH2的文库质量的理论分布，其中Yaa和Yaa’代表出现20个天然氨基酸的位置，导致400个不同的分子的合成(如果将由于在Phe和Leu残基存在不对称中心所致的非对映异构体计算在内，则合成1600个)；-图2代表通式丙基-3H-NH-Yaa-(R，S)Phe(PO2-CH2)(R，S)Leu-Yaa’-NH2的文库的实验性质谱；-图3代表在膦肽丙基-3H-Phe-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2(选择质量为595的化合物)的片段化期间在MS/MS谱中观测到的化学结构实例；-图4示出了丙基-3H-Phe-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽的MS/MS谱；-图5代表在β-成像仪上制备的小鼠整体矢状切面的放射自显影图，所述小鼠被给予含有相应于通式丙基-3H-NH-Yaa-(R，S)Phe(PO2-CH2)(R，S)Leu-Yaa’-NH2的膦肽的文库的一种溶液，在注射后1小时处死该动物；-图6-8代表在经I.P.注射膦肽的文库之后不同器官(肾、肺和心)提取物的质谱；-图9和10代表当将丙基-3H-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2这一肽进行MS/MS谱时获得的片段；-图11-13示出了在MS/MS片段化实验中从肾、肺和心的提取物中获得的片段化峰值，选择质量为595的产物。这些图表明在这些器官提取物中存在产物丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2；-图14-19示出了相应于纯化形式的丙基-3H-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽(4个非对映异构体，图13)及然后在不同器官(肺、心、肝、肾和脑)提取物中的HPLC谱；-图20示出了从小鼠中制备的多个器官切片的放射自显影图，所述小鼠被给予丙基-3H-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽及在注射所述产物后1小时被处死；及-图21示出在用丙基-3H-NH-Tyr-Phe(PO2-CH2)Leu-Pro-NH2肽注射小鼠后制备的多个器官切片的放射自显影图。所述动物在注射所述产物1小时后被处死；-图22示出了化合物丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2对ACE的抑制作用；-图23示出了化合物丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2对NEP的抑制作用；-图24示出了通式为丙基-NH-Yaa-Phe(PO2-CH2)Leu-Yaa’-NH2的子文库(sublibraries)对ACE的抑制作用(每个文库的浓度为500nM)；-图25示出了通式为丙基-NH-Yaa-Phe(PO2-CH2)Leu-Yaa’-NH2的子文库对NEP的抑制作用(每个文库的浓度为250nM)；-图26示出了通过提取分离所述放射标记的产物的一种方案；-图27、28和29示出了放射标记的化合物丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2(pro-Arg)分别在小鼠的肾、肺和脑中的组织分布，这可以对这个化合物通过组合放射成像装置(Biospace公司的β-成像仪)和质谱分析技术(Electrospray，Quatro，MicroMass)对比膦肽检测的灵敏性。
实施例1用氚放射标记的膦假肽的文库或集合-膦假肽的文库的合成及放射性标记a)文库的放射性标记膦肽的文库的合成基于公布的方案进行(A.Yiotakis et al.，J.Org.Chem.，1996，61，19，6601-6605；J.Jiracek et al.，J.Biol.Chem.，1995，270，37，21701-21706；J.Jiracek et al.，J.Biol.Chem.，1996，271，32，19606-19611；V.DIVE et al.，PNAS，1999，96，4330-4335)。所述文库在固相上使用Rink-酰胺树脂(J.Jiracek et al.，J.Biol.Chem.，1996和V.Dive et al.，PNAS，1999，上述)，利用分裂&组合方案(J.Jiracek et al.，J.Biol.Chem.，1995和J.Jiracek et al.，J.Biol.Chem.，1996，mentioned above)合成。在该合成方案结束时，树脂上的肽的一般结构是Fmoc-NH-Yaa-NH-(R，S)Phe(PO(Oad)-CH2)(R，S)Leu-Yaa’-CONH-R类型。
Yaa和Yaa’代表用20个不同的氨基酸取代的位置，R代表所述树脂。
裂解Fmoc基团以产生一个游离的N末端，使放射性试剂通过酰化N末端官能团而掺入。所述膦肽通过在其游离N末端官能团上掺入N-琥珀酰亚胺-T5丙酸酯而放射标记，N-琥珀酰亚胺-T5丙酸酯是比放射性为97Ci/mmol的一种化合物。将10.3nmol的N-琥珀酰亚胺-T5丙酸酯/16.6μmol膦肽(平均分子量为607，在去保护后相应于10mg终肽)掺入所述肽中，相应于掺入1mCi放射性/文库。
所述酰化反应用过量的冷却的N-琥珀酰亚胺丙酸酯完成。在冲洗树脂后，膦肽通过常规的去保护和裂解方案裂解(J.Jiracek etal.，J.Biol.Chem.，1996和V.Dive et al.，PNAS，1999，上述)。所述裂解溶剂通过连续的蒸发循环而清除。将肽在50μl的DMSO，15μl的1M NaHCO3和50μl的PBS中进行干燥。该溶液的pH用1M NaHCO3溶液调整为7。用PBS将终体积调整为500μl。这个溶液用于经注射施用给动物。该文库的质谱(图2)以及对这个文库进行的多个MS/MS片段化实验示出所有的化合物均具有理论上期望的非常好的表现。
b)获得的文库的鉴定如此获得了用氚放射标记的膦肽文库。根据上述方案合成的文库的通式为丙基-3H-NH-Yaa(R，S)Phe(PO2-CH2)(R，S)Leu-Yaa’-NH2，其中Yaa和Yaa’代表其中出现20个氨基酸的等摩尔混合物的位置。这个文库因此包含400个化合物，如果考虑到这些结构中存在的两个不对称的中心则正式具有1600个。将所述化合物在N末端掺入C3H3-C3H2-COOH类型的含氚丙酸而放射性标记，在所述丙酸的结构中掺入5个氚原子。
图1示出了通式为丙基-NH-Yaa(R，S)Phe(PO2-CH2)(R，S)Leu-Yaa’-NH2的文库质量的理论分布。
相应于该文库中含有的多个膦肽的质量的理论范围(envelope)在这个图中表示。注意这个范围不是连续的，而是由明显的未分辩的峰组成，反映了这个文库的各个产物质量组的分布。
图2示出了通式为丙基-NH-Yaa(R，S)Phe(PO2-CH2)(R，S)Leu-Yaa’-NH2的文库的实验谱(ES-MS＝Electro Spray MassSpectroscopy)。
当将理论范围(图1)与相应于文库的实验谱(图2)比较时，注意到理论数据与实验数据非常吻合。这种一致表明所有膦肽在这个文库中均被非常好地表现。对在MS谱中观测到的峰值进行片段化的MS/MS实验可以示出在这个文库中存在理论上期望的膦肽。
通过质谱分析对膦肽的鉴定发现选择一个CH3-CH2-CO类型的保护性基团在通过质谱分析对分子加以鉴定中是有益的，所述基团与常规用于肽化学中的不同。这个文库中的每个膦肽通过分别在N和C末端位置存在的氨基酸残基的性质加以鉴定。这个文库通过存在成对的肽而鉴定，其具有精确相同的质量和相同的氨基酸含量，只是其序列发生变化，如下例证例如，如下两个肽根据其质量不能区分，其质量是相同的丙基-Asp-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2丙基-Ala-Phe(PO2-CH2)Leu-Asp-NH2对某些膦肽进行MS/MS片段化技术使得可以推断能明白无误地鉴别化合物的化学结构，甚至当至少两种肽的质量相同时也可鉴别。这种性质是由于这种类型膦肽的片段化模式所致，这使得特别可以鉴别N末端位置中残基的性质。
图3示出了当膦肽丙基-Phe-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2被片段化时，在MS/MS谱中观测到的化学结构实例。
图4示出了丙基-Phe-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽的MS/MS谱。
如图3和4所例证，N末端位置中的残基总是以携带丙氧化物基团的实体形式出现(pro-Phe-CO+，图3和4的D峰)。在MS/MS谱中观测到这个实体因此在大多数情况中使得可以确定在所述肽的N末端位置的氨基酸的性质，并因此可以确定C末端位置中残基的性质，获知肽的质量。还系统地观测到另一个种类(pro-Phe-Phe(PO2-CH2)LeuCO+，图3和4的C峰)；所述观测结果确证了在该序列N末端位置的残基的性质(实例中的Phe残基)。
这个文库中存在的膦肽的片段化模式的这些特性来自丙氧化物基团的导入。根据这些特性，还可以鉴别化合物的化学结构，甚至在质量相同的一些膦肽情况中也可以鉴别。
注意当膦肽被片段化时，在MS/MS谱中存在质量为120的峰(图3和4的E峰)。这个峰是一种膦肽的特征，观测到这个峰对检测器官提取物中存在的一种膦肽非常有益。
-将文库注射入动物并观测含氚肽的组织分布a)将获得的文库注射入动物用于该实验的小鼠是雌性Balb/C小鼠。将所述文库的膦肽(10mg，放射性为0.8-1mCi)溶解于含有10％DMSO的PBS溶液中。如果考虑到这个文库中存在400个分子，则每个产物的注射量级为25μg/动物，表示重量为20g的小鼠的注射剂量为1.25mg/kg。在注射单一产物的情况中，所用剂量为20mg/kg，总放射性为100-150μCi。在不同时间进行注射(5分钟，1小时，3小时和24小时)。
b)器官切片的制备在处死动物之后立即取出多个器官或组织，在PBS溶液中冲洗并包埋于冷却至-70℃的庚烷中(庚烷和干冰的低共熔混合物)。在-20℃利用切片机制备冷冻组织切片，厚度为25μm。干燥后，将该切片在β-成像仪中分析。
c)结果*在β-成像仪中分析切片根据上述方案将放射标记的膦肽的文库经腹膜内注射入小鼠中。
在一定时间之后(1小时或15分钟)，处死动物。制备整体切片并在β-成像仪上通过放射自显影进行分析，所述成像仪是能检测氚发射的β-射线的一种装置。这些实验表明在注射所述文库15分钟和1小时后，在多个器官中均观测到放射性；图5示出了在β-成像仪上产生的小鼠整体的矢状面的放射自显影图，该小鼠被施用了含有膦肽文库的一种溶液并在注射后1小时被处死。
除了肝和肾之外，例如在心和肺中也观测到放射性。另外，在所述动物随后被处死的实验中证实在观测期间这个文库不具有引起动物死亡或毒性的任何化合物。因此可以推断在这些实验期间，动物的重要机能被保护。这个方面是非常重要的，因为其保证了鉴别的化合物应与生理学上表达的“受体”相互作用。
-膦肽的提取a)方案在处死动物后迅速取出器官并置于的4℃的PBS溶液中。几分钟后，将该器官移至4℃的含有2ml PBS的Potter匀浆器中，然后用手研磨。将经研磨的材料移至含有15ml PBS的一个离心管中。在4000rpm离心30分钟后，将上面的相与细胞沉淀分离并经0.45μm滤膜过滤。在将滤物酸化后，将其加样于含有5g C18相的药筒(cartridge)中，这个药筒已经预先在含有0.1％TFA的水溶液中冲洗。
洗脱方案如下组成第一次经过含有0.1％TFA的20ml水，然后经过含有50％乙腈和0.1％TFA的30ml水溶液，然后经过含有80％乙腈和0.1％TFA的20ml水溶液。
以2ml部分收集流过C18药筒中的洗脱物。放射性计数使得可以鉴别含有放射标记的膦肽的部分。
将放射性部分在真空下浓缩并将产物置于水中，然后将多个溶液经过滤膜，所述滤膜保留分子量大于5000Da的产物。将由此过滤的溶液在真空下浓缩为100μl体积。
然后将这些样品准备分析，通过高效层析及结合一个检测放射性的系统以观测放射性膦肽，或者通过质谱分析进行分析。
这个步骤揭示起始文库中包含的膦衍生物的存在能分布于某些器官中。为了能够鉴别保留在这些器官中的膦衍生物，使用如上述放射性检测方法测试提取所述膦衍生物的多个方案，以监测提取程序的步骤中所述文库的化合物的存在情况。使用分级分离方案使得可以通过HPLC结合放射性检测方法及通过质谱分析来分析这些提取物。质谱分析的优化应用，尤其所述方法的灵敏性，是基于进行分析的样品的性质。因此在这个步骤中制备样品的方案非常重要，但可以根据所述文库产物所携带的化学官能团而变化。例如，在膦假肽的情况中，在用含有0.1％TFA的H2O冲洗后，所述文库的所有膦假肽均可以用50％CH3CN洗脱，而在80％CH3CN，许多可干扰随后的分析的内源产物被洗脱。
b)衍生自已经通过i.p.注射给予了膦肽文库的动物的器官提取物的质谱分析从多个器官和组织(肾、肝、肺、心、脑、肿瘤)中制备的多种提取物的质谱分析表明，除了肾之外，在这些提取物的质谱中无特异于膦肽的信号出现。
这些结果在图6-8中例证。
图6代表肾提取物的质谱，其中观测到存在膦肽的许多特征性峰(与图2相对比)。
图7代表肺提取物的质谱，其中观测到无膦肽的特征性峰。
图8代表心提取物的质谱，其中观测到无膦肽的特征性峰。
然而，发现通过质谱分析和通过HPLC获得的结果是不同的；事实上，膦肽的特征性峰的存在是通过HPLC在源自肺和源自心的提取物中检测到的。这种分歧来自这样的事实，即在质谱分析中，相应于被探寻的产物的质量峰可能被在提取步骤后仍存在的源自器官中所含有的内源化合物的质量峰所掩盖。基于这些结果，系统进行串联MS/MS片段化质谱分析以证明在多种提取物中膦肽的存在。
这个MS/MS质谱分析使得可以将一种肽以给定质量片段化并因此在MS/MS谱中仅揭示这种肽的片段(光谱特征(spectralsignature))。因此证明这些实验对证明一种产物的存在是更有效的，即使这个产物在MS谱中不出现。
这种MS/MS质谱使得可以鉴别肺和心中一种膦肽的存在情况，所述膦肽即丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2，这个肽也存在于肾和肝中；然而，在这些器官中也观测到其它膦肽。图9和10代表当对丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2这一个肽进行MS/MS谱分析时获得的片段。在肾(图11)、肺(图12)和心(图13)提取物中观测到丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽特有的片段化峰使得可以推断这个肽存在于这些器官中。
利用筛选肽文库的这种方法选择产物丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2导致这个肽以纯形式制备，以详细确定其组织分布性质。
对以纯形式注射的放射标记的丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽的组织分布进行研究示出这种化合物能有效分布于小鼠的多个组织中(20mg/kg，100μCi，在经I.P.注射所述产物后1小时处死该小鼠)，通过放射自显影术获得的多个器官成像而证实；这个产物在心、脑、肝、肺和肾中观测到。非常有利地，观测到这个肽能经过血脑屏障，因为其在脑中被观测到。相同的提取和结构分析程序表明通过放射自显影观测到的所有放射性相应于存在完整形式的丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽(图20)。
图14-19代表检测放射性的HPLC谱，相应于纯的含氚产物丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2，及相应于源自小鼠的多个器官提取物，所述小鼠被给予了丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽(20mg/kg，100μCi)并在注射该产物后1小时处死。
为表明丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽首先靶向于某些器官，如心和肺及其次在这些器官中聚集的能力，在相同条件下使用另一种分子作为阴性对照，这是上述文库的另一种分子，即丙基-Tyr-Phe(PO2-CH2)Leu-Pro-NH2。
在与化合物丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2使用的条件相同的实验条件下对其组织分布进行研究示出，可以将化合物丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2非常清晰地与丙基-Tyr-Phe(PO2-CH2)Leu-Pro-NH2这一肽相区分，根据其在心和肺内聚集的能力及其在脑中出现的能力。
图21代表从小鼠中制备的多个器官切片的放射自显影图，所述小鼠被给予丙基-Tyr-Phe(PO2-CH2)Leu-Pro-NH2肽(20mg/kg，100μCi)并在注射该产物后1小时处死。
实施例2膦肽丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2的潜在靶位的性质及鉴别膦肽丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2的特异性组织分布，尤其在脑部中，提出这样的假设，即这种化合物可以与血管紧张肽I-转换酶(ACE)和/或中性内肽酶(NEP，脑啡肽酶)的锌肽相互作用。事实上，一般而言，膦肽具有与锌蛋白酶或肽酶特异性相互作用的能力(见法国专利申请No.9808464所述)；另外，已知这两种锌肽酶具有与膦产物丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2相一致的组织分布(Cadwell et al.，Science，1975，191，1050-1051；Roques et al.，Tips，1990，11，245-249)。
为此，评价膦肽丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2对纯形式的这两种肽酶的抑制能力(根据Dive et al.，PNAS，1999，96，4330-4335所述测定Ki值)。如图22和23所示，这种肽对血管紧张肽转换酶和NEP的IC50值分别等于30nM和100nM，相应于抑制常数Ki值分别为15nM和30nM。这种化合物因此表现为是这两种肽酶的极强力抑制剂。
由于这两种肽酶被认为是相对非选择性的，因此在体内筛选后惊人地出现通过这种筛选方法只鉴别了丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2这一个肽。
为更好的了解起始文库中含有的不同分子对ACE和NEP的抑制性质，评价含有通式为丙基-NH-Aaa-Phe(PO2-CH2)Leu-Yaa-NH2的不连续混合物的子文库的抑制能力，其中以Aaa标示的位置含有一个特异的氨基酸，而在Yaa位置出现一种20个天然氨基酸的混合物。
图24示出了根据在Aaa位置的残基的性质，相应于上述通式的膦肽混合物对ACE的抑制百分比。这个图中报道的结果非常清晰地表明这些子文库中存在的许多膦肽看起来是ACE的强力抑制剂。有利地，可以看出在Aaa位置的残基中使所述化合物对ACE的抑制能力最佳的残基是His、Arg和Tyr。
当对NEP测试相同的子文库时(图25)，也发现这个子文库中含有的许多肽应该是NEP的非常强力的抑制剂。注意在Aaa位置的一些类型的氨基酸可以使酶-抑制剂相互作用最佳化。
基于这些体外数据，可以明了文库中含有的产物丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2不属于这两种肽的体外的最强力抑制剂。
这清晰地示出本发明方法的优势；事实上，仅基于体外筛选不可能仅选择，例如事实上有效的化合物；特别地，使用体外测试可以选择具有作为抑制剂能力的文库的许多化合物，而本发明的方法包括体内步骤，在仅选择能在体内作用的化合物范围内更加有效。
基于化合物丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2在体内强力抑制ACE和NEP肽酶的能力，可以期望这种产物用于心血管病变中。
化合物丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2的代谢稳定性及其极佳的组织分布，特别是在已知表达这两种锌肽酶的区域中，导致预期这种产物具有极佳的在体内抑制这两种肽酶的能力。因此，发现这种产物在人体心血管病变中将具有重要应用价值。
实施例3本发明方法中组合步骤(2)及(3)-(5)的重要性-本发明方法的提示在将用氚放射性标记的化合物文库注射入动物后，本发明的方法包括分析施用的分子的放射性组织分布，使用生物学样品，特别是从中取样的组织或器官的切片，利用适当的放射成像装置检测所述冷冻组织或器官切片上的放射性信号进行。
随后仅分析呈现放射性信号的组织或器官以确定所考虑的组织中存在的化合物的相同性，用于检测放射性信号的方法的灵敏性在此起重要作用。
-氚放射成像与质谱分析的相对灵敏性的对比为进行这种对比，将500μg氚放射性标记的膦化合物丙基-Arg-Phe(PO2-CH2)Ala-Ala-NH2(pro-Arg)(比放射性68mCi/mmol)注射入小鼠体内。在注射该产物后1小时，通过使用冷冻组织切片检测放射性研究其组织分布。将含有放射性的器官进行处理以制备可以通过质谱分析的组织提取物，根据图26所例证的提取方案进行。使用不同的放射性分子的文库对比这两种方法检测注射入动物体内的膦化合物的存在情况，可以示出本发明的方法的步骤组合可以解决器官或组织中存在的放射性化合物的检测和鉴别问题。
*肾(图27)β-成像仪放射显影图表明这个器官中存在放射性标记的化合物(在这些成像中，表示了放射性的最大和最小强度，分别以深灰色和浅灰色表示)。
基于信号及产物的特异性放射性的整合(68mCi/mmol)，可以确定每mm2肾组织存在的产物量。
在切片上，观测到的放射性信号为14.5pCi/mm2，代表0.2pmol/mm2的产物(127pg/mm2)。通过将这个量与整个肾的体积相整合，可以确定肾中存在的产物总量相应于注射剂量的15％(75μg)。
质量从源自上述相同条件下处理的动物的经研磨的肾材料中提取产物(如图26中所述提取方案)，随后浓缩部分至干燥并将产物置于100μl溶剂(水/甲酸，50∶50)中，如果提取是定量的，则理论上样品的浓度应是1.5mM级别。基于这种工作假说，可以估计注射1μl这种100倍稀释的溶液(15μM)表示15pmol产物导入质谱分析仪中(Electrospray，Quatro，Micromass)。
这个量与质谱分析技术的灵敏性完全一致。
图27证实事实上完全可能在这个样品中观测到所述产物的存在，特征在于一个相应于596道尔顿分子量的质量峰(M+H)。在这个质谱上，与其它信号相比，在596Da的峰具有最高的强度，这使得可以推断注射的膦肽跟与这个产物共同提取的内源产物相比占大多数。当将所述样品转变为MS/MS模式，使得这种化合物被片段化时，所述产物的化学相同性通过观测片段A、B和C加以证实。当所述纯产物被片段化时观测到相同的峰A、B和C。
肺(图28)β-成像仪放射自显影图示出在肺中有较少量的产物与在肾中放射性为14.5pCi/mm2相比，在这个器官中放射性为2.6pCi/mm2，即注射剂量的2.2％。
质量将理论浓度为22μM的一种肺样品溶液进行质量分析。与在肾中进行的实验相比，注射1μl这种样品可以暗示对产物pro-Arg的一种非常好的观测结果。图28的MS质谱表明这位于检测限制内，相应于pro-Arg的信号是在这个质谱中观测到的噪声级别。然而，通过片段化(MS/MS实验)，可以推断该产物存在，在MS/MS谱中清楚地观测到预期的片段(A、B和C)。
脑(图29)β-成像仪放射自显影图表明在脑的非常局限的区域内有非常弱的放射性标记与在肾中的14.5pCi/mm2相比，在脑中为0.35pCi/mm2。这次由于未精确确定涉及放射标记的脑体积，因此更难以估计脑中存在的所述产物总量。
质量在从脑部提取所述产物之后，将有含有所述产物倾向的全部部分均注射入质谱仪中，未能观测到在596的峰。片段化实验使得可以检测A、B和C峰，并因此证实脑中完整产物的存在。然而这些实验在检测阈值的限度内。
图27-29中所例证的结果证明了放射成像装置/质谱分析的组合在检测组织中放射性标记的膦肽中的作用。事实上，在脑的情况中(图29)，注意到单独的质谱分析检测受限，而膦肽的存在是通过放射成像装置揭示的；这些数据示出需要组合使用放射成像装置在器官或组织中检测放射性产物以最灵敏地检测所述放射性产物的步骤，随后通过质谱分析进行分析的步骤，使得可以确定利用放射成像在脑部检测到的产物的化学相同性。
事实上，尽管质谱分析非常有效，但其根据组织的性质需要绝对纯化的非常少量的产物，假定多个器官中含有非常大量的内源产物，则这种技术非常难以完成。在注射的产物的质量范围内(200-800Da)，内源性产物的存在对质谱分析的相对灵敏性具有另一个非常重要的影响。质谱分析的灵敏性事实上取决于所分析的样品的纯度。分析的样品中存在盐或其它杂质可以使质谱分析的理论灵敏性降低几个数量级。
利用适当的放射成像装置，检测放射性信号的步骤针对分离希望鉴别的产物而言不需要任何处理，这样可以以最佳方式检测这些产物，将这个步骤与精细分析由此选择的放射性产物的步骤组合，使得可以在多个器官或组织中检测所述产物的灵敏性方面获得希望的效力水平。
实施例4通过正电子发射断层照相术对用氟18放射件标记的化合物的混合物的组织分布进行的分析(存在本发明的步骤(1’))材料和方法动物该实验动物是重量为200g的Wistar大鼠(Janvier)，该大鼠随意喂食并圈养于常规动物房中(受控空气，白天/夜晚周期为12/12)。将该大鼠在诱导期用于O2气体混合物中的3.5％异氟烷(isoflurane)麻醉，并在整个采集期间保持2％的麻醉。不同示踪物的混合物(就共同注射而言)的注射是针对4只动物在少于30秒的时间内以300μl丸剂形式经静脉内注射。
PET将4只大鼠定位于一个EXACT HR+照相机中(Siemens)(63个同时连续截面，横向4.5mm，纵向4.1mm，从距中心1cm以二维方式分辨)。组织及支持物对511keV的γ射线的弱化校正利用68Ge-68Ga源的发射扫描获得(15分钟)。在注射示踪物后的动态分析利用102框架(25×0.2分钟；19×0.3分钟；20×0.5分钟；38×1分钟)的采集物进行。
示踪物[18F]FDG是针对葡萄糖消耗的一种代谢性标记；[18F]F-A85380是一种α2β4烟碱兴奋剂。为两只大鼠给予这两种示踪物的混合物(1∶1)，另两只大鼠仅给予这两种示踪物之一。就所有动物而言，通过快速IV给予的(丸剂)总剂量是于400μl水溶液中1.4×107Bq。
数据分析感兴趣的区域利用CAPP软件进行追踪，放射性的浓度以Bq/ml组织表示。
结果在将放射性产物的混合物注射入动物体内之后正电子发射断层照相术可以快速搜索这种混合物中能例如到达脑或者甚至心的产物的存在；基于这种标准，可以快速分选混合物以只选择满足所选择的组织分布标准的那些。
这个步骤，组合所述方法的其它步骤可以检测具有非常低的检测阈值的放射标记的产物。
权利要求
1.一种筛选分子文库的方法，特征在于其包括至少如下步骤(1)将所述分子文库给予至少一种动物，其中每个分子用一种适当的放射性同位素预先标记，(2)处死至少一只动物，并使用取样组织或器官的切片利用适当的成像装置分析所给予的分子的放射性组织分布，(3)选择检测到放射性信号的组织或器官的切片，(4)通过适当的技术，如提取和/或层析技术从在步骤(3)中选择的所述组织或器官切片中分离放射性部分，及(5)通过适当的分析技术，如层析和/或质谱分析使用在步骤(4)中获得的放射性部分鉴定所述分子。
2.一种筛选分子文库的方法，特征在于其包括至少如下步骤(1)将所述分子文库给予至少一种动物，其中每个分子用一种适当的放射性同位素预先标记，(2)利用适当的成像装置，在体外使用预先从组织或器官的细胞和切片中提取和选择的生物学样品分析所给予的分子的放射性组织分布，(3)选择检测到放射性信号的组织或器官的细胞或切片，(4)通过适当的技术，如提取和/或层析技术从在步骤(3)中选择的所述组织或器官的细胞或切片中分离放射性部分，及(5)通过适当的分析技术，如层析和/或质谱分析使用在步骤(4)中获得的放射性部分鉴定所述分子。
3.一种使用分子文库鉴别和研究在一个器官或组织中选择性表达的靶分子的方法，包括(1)将所述分子文库给予至少一种动物，其中每个分子用一种适当的放射性同位素预先标记，(2)处死至少一只动物，并使用适当的成像装置，通过对动物的多个组织取样并分析切片而分析所给予的分子的放射性组织分布，(3)选择检测到放射性的组织或器官的切片，(4)通过适当的技术，如提取和/或层析技术从步骤(3)中选择的所述组织或器官的切片中分离放射性部分，(5)通过适当的分析技术，如层析和/或质谱分析使用步骤(4)中获得的放射性部分鉴定所述分子，(6)将步骤(5)中获得的所述分子与根据步骤(2)选择并获取的组织或器官样品在使得步骤(4)中分离的分子与所述靶分子结合并形成一种复合物的条件下接触，及(7)从所述复合物中分离所述靶分子。
4.一种使用分子文库鉴别并研究在一个器官或组织中选择性表达的靶分子(或受体)的方法，包括(1)将所述分子文库给予至少一种动物，其中每个分子通过用一个原子的放射性同位素之一置换所述分子中存在的该原子而预先标记，(2)利用适当的成像装置，在体外使用预先从组织或器官的细胞和切片中提取和选择的生物学样品分析所给予的分子的放射性组织分布，(3)选择检测到放射性的组织或器官的细胞或切片，(4)通过适当的技术，如提取和/或层析技术从步骤(3)中选择的所述组织或器官的细胞或切片中分离放射性部分，(5)通过适当的分析技术，如层析和/或质谱分析使用步骤(4)中获得的放射性部分鉴定所述分子，(6)将步骤(5)中获得的所述分子与根据步骤(2)选择并获取的组织或器官样品在使得步骤(4)中分离的分子与所述靶分子结合并形成一种复合物的条件下接触，及(7)从所述复合物中分离所述靶分子。
5.权利要求1-4任一项的方法，特征在于在步骤(1)中，将放射性分子的文库注射入动物体内，优选腹膜内注射(I.P.)或静脉内注射(I.V.)。
6.权利要求1-5任一项的方法，特征在于在进行步骤(2)之前，所述方法包括一个步骤(1’)以分析所给予的分子的放射性组织分布，该步骤通过将至少一只动物进行外部成像，特别是利用适于检测所选择的放射性同位素发射的粒子的性质的检测装置结合照相机而进行。
7.权利要求1-6任一项的方法，特征在于所述放射性同位素选自氚(3H)，碳14(14C)，碳11(11C)，碘131(131I)，碘125(125I)，碘124(124I)，碘123(123I)，磷32(32P)，氟18(18F)，硫35(35S)，锝99(99mTc)，铟113(113In)，铜64(64Cu)，溴76(76Br)，氮13(13N)和氧15(15O)。
8.权利要求1-7任一项的方法，特征在于在步骤(2)中，放射性的组织分布利用适于检测所选择的放射性同位素发射的粒子的性质的检测装置结合成像装置进行观测。
9.权利要求1-8任一项的方法，特征在于所述放射性分子以一种混合物的形式注射。
10.权利要求1-9任一项的方法，特征在于在步骤(1)之前，所述标记的分子文库通过如下方法制备-通过化学或酶促途径合成所述分子的一种混合物，及-用所述放射性同位素标记所述分子。
11.权利要求1-10任一项的方法，特征在于步骤(1)至(5)在几个动物上同时进行，所述动物在步骤(1)中被给予分子文库的量不同，而且步骤(2)中分析分子的放射性分布根据动物在不同时间进行。
12.权利要求1-11任一项的方法，特征在于步骤(4)中与所述器官相关的放射性分子的分离根据如下步骤进行-切下检测到放射性的组织或器官，-在适当的缓冲液中研磨所述组织或器官，-离心每种研磨的材料并回收溶液，-过滤该溶液，-调节pH，及-分级分离并回收放射性部分。
13.权利要求1-12任一项的方法，特征在于在步骤(5)中，质谱分析与串联质谱分析(MS/MS)组合。
14.权利要求1-13任一项的方法，特征在于步骤(1)的文库的分子具有如下通式丙基-3H-NH-Yaa-(R，S)Phe(PO2-CH2)(R，S)Leu-Yaa’-NH2，其中Yaa和Yaa’代表出现20个天然氨基酸的位置。
15.一种进行权利要求1-14任一项的方法的试剂盒，特征在于其包含-至少一种分子文库，其中每个分子均预先用一种适当的放射性同位素标记，-检测放射标记的产物的手段，-分析所检测的放射标记的产物的手段。
16.一种可通过权利要求1或2的方法获得的产物，特征在于其相应于具有下式的肽丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2。
17.权利要求16的肽，特征在于其是用一种放射性同位素标记的。
18.一种将一个感兴趣的分子靶向于一个特异性位点的载体，特征在于其包含通过权利要求1-14任一项的筛选分子文库的方法选择的分子，而且对所述特异性位点的组织分布已经使用这种方法鉴别。
19.权利要求18中的靶向载体，特征在于所述分子是权利要求16所述的肽丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2。
20.一种位点特异性组合物，特征在于其包含(i)待被靶向于所述位点的一种感兴趣的分子，其与特异于所述位点的一种分子偶联，其组织分布已经通过权利要求1-14任一项的筛选分子文库的方法鉴别，及(ii)至少一种药物可接受的赋形剂。
21.权利要求20的组合物，特征在于特异于所述位点的所述分子是权利要求16所述的肽丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2。
22.经权利要求1-14任一项的筛选分子文库的方法选择的标记的分子在制备用于医学成像的组合物中的应用。
23.权利要求22的应用，特征在于所述标记的分子是权利要求17所述的肽。
24.权利要求22或23的应用，特征在于所述标记的分子与一种适当的造影剂相结合。
25.一种鉴别感兴趣的分子的至少一个靶位的方法，特征在于其包括至少(1)将感兴趣的分子与通过权利要求1-14任一项的筛选分子文库的方法选择的一种特异于所述靶位的放射标记的分子偶联，获得一种放射性缀合物，(2)给予至少一种动物在步骤(1)中获得的缀合物，及(3)使用生物学样品在体外分析所述生物学样品的至少一个靶位与所述放射标记的分子偶联的感兴趣的分子的结合。
26.权利要求25的方法，特征在于所述标记的分子是权利要求17所述的肽。
27.一种通过竞争在体内筛选未标记的分子的方法，该方法特征在于其包括(1)将一种标记的分子给予至少一种动物，该标记的分子的组织分布已经通过权利要求1-14任一项的筛选分子文库的方法鉴别，(2)第一次分析在步骤(1)中所给予的放射性分子的组织分布，这通过将至少一只所述动物进行外部成像，特别是利用适于检测所选择的放射性同位素放射的粒子的性质的检测装置结合照相机进行，(3)给予未标记的分子的文库，(4)第二次分析所述放射性分子的组织分布，这通过将至少一只所述动物进行外部成像，特别是利用适于检测所选择的放射性同位素放射的粒子的性质的检测装置结合照相机进行，(5)通过与第一次分析所述放射性分子的分布相对比而确定由至少一种未标记的分子置换标记的分子的动力学，及(6)检测使放射性标记的分子的动力学发生改变的至少一种未标记的分子，所述检测通过适当的分析技术，如层析和/或质谱分析重复分级分离及鉴定所述分子而进行。
28.一种通过竞争在体内筛选未标记的分子的方法，该方法特征在于其包括(1)将一种标记的分子给予至少一种动物，所述标记的分子的组织分布已经通过权利要求1-14任一项的筛选分子文库的方法鉴别，(2)利用适当的成像装置，在体外使用预先从组织或器官的细胞和切片中提取和选择的生物学样品而第一次分析在步骤(1)中所给予的放射性分子的组织分布，(3)给予未标记的分子的文库，(4)利用适当的成像装置，在体外使用预先从组织或器官的细胞和切片中提取和选择的生物学样品而第二次分析放射性分子的组织分布，(5)通过与第一次分析放射性分子的分布相对比而确定由至少一种未标记的分子置换标记的分子的动力学，及(6)检测使放射性标记的分子的动力学发生改变的至少一种未标记的分子，这种检测通过适当的分析技术，如层析和/或质谱分析而重复分级分离及鉴定所述分子而进行。
29.权利要求27或28的方法，特征在于步骤(1)中的标记的分子是权利要求17所述的肽。
30.一种药物，特征在于其包含至少权利要求16所述的丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽及至少一种药物可接受的赋形剂。
31.权利要求16所述的丙基-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2肽在制备抗高血压药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种筛选放射性分子文库的非扩增方法，涉及获得的分子文库的产品及其应用于鉴别能选择性结合一特定组织或特定器官的分子。本发明方法可被用于开发新的治疗化合物及医学成像造影剂及筛选药物。所述筛选分子文库的方法的特征在于其包含至少如下步骤(1)将分子文库给予至少一种动物，每个分子预先通过适当的放射性同位素标记；(2)处死至少一个动物并使用适当的成像装置从组织或器官切片分析所给予的分子的放射性的组织分布；(3)选择检测到放射性信号的组织或器官切片；(4)使用适当的技术，如层析和/或提取技术从步骤3中选择的上述组织或器官切片中分离放射性部分；及(5)使用适当的分析技术，如层析/或质谱分析法定性步骤4中获得的放射性部分中的分子。按照该方法的一种改变的方法，在步骤2中，在可能的情况下，所述分子的放射性组织分布使用适当的体内成像装置对生物学样品进行分析，所述生物学样品预先提取并选自组织或器官的细胞和切片。结果，所述改变的方法不需要处死动物。
文档编号C07K5/10GK1703622SQ03818024
公开日2005年11月30日 申请日期2003年5月28日 优先权日2002年5月31日
发明者樊尚·迪夫, 安德烈·梅内斯, 雷托·斯托克林, 贝特朗·塔威蒂安, 法布里斯·博, 贝特朗·恰尔内, 若埃尔·戈登 申请人:原子能委员会