专利名称：草甘膦诱导高表达的对逆境具有抗性的棉花ag2基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种棉花ag2基因序列。该基因对水杨酸、NaCl以及枯萎病菌具有一定的抗性。该基因可用于棉花抗逆性表达研究。
背景技术：
植物在自然界生长过程中，经常会遇到恶劣的环境条件，如强光、高温、干旱、水涝和高盐等。这些逆境信号通过转导和传递，调节植物相关基因表达，最终合成或终止合成某些蛋白质(韦朝领等，安徽农业大学学报，27(2)204-208，2000；王关林等，植物基因工程原理与技术，351-353，1998)。以使逆境对植物的影响减弱，起到保护植物自身的作用(向文胜，东北农业大学学报，29(1)92-98，1998)。
逆境下植物会发生一系列的生理生化反应来适应不良环境，在分子水平上包括对逆境信号的感应和传导，特异转录因子的激活和下游控制生理生化应答的响应基因的表达。例如水杨酸作为植物信号传导链中的一个重要分子在基因的表达调控中发挥重要作用，然而，水杨酸的诱导效应与所使用的水杨酸溶液的浓度有密切关系。当水杨酸的浓度不足时，难以起到应有的诱导效应，而水杨酸浓度偏高时又易引起植物中毒，过高时还会导致植物死亡。因此，高浓度的水杨酸对植物也将是一种逆境，这可能是由于信号太强，打乱了正常细胞的新陈代谢，导致植物发生病变或死亡；盐渗透和淹水则不同于水杨酸处理，将会诱导特异蛋白质或多肽的表达，如盐诱导表达的20KD、26KD、和32KD蛋白，均对植物具有保护特性(何迎春，生物技术，11(4)38-41，2001；刘家尧，植物学通报，16(1)1-10，1999)。
草甘膦作为一种优秀的广谱灭生性、内吸传导型除草剂，大量使用已经几十年，而杂草的抗药性却几乎没有发展，因而其在清除植物杂草方面具有广泛的使用市场。但是，由于草甘膦对植物体具有广谱灭生性作用，限制了它做为逆境胁迫诱导基因表达的研究。随着抗草甘膦转基因植物的发展，草甘膦的灭生性作用已不再是其成为诱导剂的主要障碍。草甘膦诱导表达的基因及启动子对于抗草甘膦植物基因工程可能具有重要意义，然而，目前以较低浓度草甘膦同时做为化学诱导剂及逆境，对植物体的胁迫诱导作用研究还未见相关报道。
本发明以草甘膦作为诱导剂，通过DDRT-PCR技术分离了草甘膦诱导棉花高表达ag2基因，RT-PCR及Northern Blot进一步证明该基因为草甘膦诱导高表达基因。利用RACE技术获得了ag2基因全长cDNA序列。在NCBI EST数据库中对ag2基因进行B1ast比对发现棉花抗细菌枯萎病抑制差减杂交库中的一条EST序列(GenBank登录号CF932119)与其同源性达93％(337/360)，且这条序列与茉莉酸诱导表达的蛋白相似。进一步对ag2 cDNA序列blastx比对发现ag2与一个23kDa的茉莉酸诱导表达的大麦蛋白同源性为26％(24/92)。因此推测，ag2基因可能为一个与诱导表达相关的未知功能基因。茉莉酸做为一种信号物质，在植物的生长发育和对生物胁迫的抗性中起重要作用。由此可以推测茉莉酸诱导表达的蛋白可能与抗逆性有关，因而，草甘膦诱导高表达的ag2基因的表达也有可能与对逆境的抗性的诱导具有重要关系。同时ag2基因与棉花抗枯萎病抑制差减杂交库中的某EST序列有较高同源性，也可能参与棉花抗枯萎病的生理过程。
为了消除草甘膦对植物体灭生性影响，本发明最初是以抗草甘膦大豆为材料进行研究的，草甘膦诱导大豆差异表达基因序列的BLAST结果表明所获得的EST序列与其它逆境胁迫例如热、水杨酸、茉莉酸、冷、缺磷、NaCl、射线、干旱、水等胁迫作用诱导表达的EST序列有高于82％的同源性。
根据以上试验结果可以推论草甘膦做为一种逆境，和其它逆境胁迫一样，也会诱发植物体的抗逆反应，草甘膦诱导高表达的ag2基因产物可能是诱导反应过程中的一个信号传递成员，也可能是诱导反应的终产物，总之，ag2的高表达产物对植物体而言可能与抗性过程的发生有关，或者本身就具有缓解胁迫压力的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种草甘膦诱导高表达的来源于棉花的与抗逆相关的基因ag2基因。
本发明提供的的ag2基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQ ID NO2由853个碱基组成，具有2个外显子和1个内含子，其中SEQ IDNO1由760个碱基组成。该基因的读码框为SEQ ID NO1自5’端第55位到第510位碱基，其表达主要受草甘膦等逆境诱导。
本发明的再一个目的是提供一种草甘膦诱导高表达的ag2基因编码的具有抗逆功能的蛋白质，是序列表中SEQ ID NO3的氨基酸残基序列，或将SEQ ID NO3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO3的氨基酸残基序列相同活性的由序列SEQ ID NO3衍生的蛋白质。
序列表中的SEQ ID NO3是由152个氨基酸组成的蛋白质。其表达主要受草甘膦、水杨酸、高盐等逆境诱导。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
可以将本发明的ag2基因导入棉花等植物中，以期获得对水杨酸、高盐、枯萎病等逆境具有抗性的转基因棉花。本发明的基因对培育抗逆植物品种，特别是培育耐盐、抗枯萎病的植物品种，提高作物产量和品质具有重要意义。
下面结合附图对本发明做进一步说明附图表说明
图1DDRT-PCR及RT-PCR电泳图谱(a中箭头所指为差异条带)。aDDRT-PCR电泳图谱，图中1、2、3分别代表三株不同的棉花植株；bRT-PCR电泳图谱；a、b图中的0、6、12、24、36h分别是指草甘膦诱导后的不同时间(小时)。
图2ag2基因Northern blot结果(0、6、12、24、36h分别指喷施草甘膦后的不同时间)。
图3ag2基因cDNA扩增电泳及流程示意图(M代表Marker，GeneRulertmDNA Ladder Mix)。a.3′RACE电泳结果；b.5′RACE电泳结果，其中1、2、3所用的反向引物分别为5R3、5R2、5R1；c.ag2 cDNA全长。
图4ag2基因在基因组中的扩增结果对棉花基因组DNA中进行扩增，电泳后得到一条长度为856bp的特异条带。
图5ag2基因的Southern Blot结果C1、C2和C3是棉花正义转基因植株基因组杂交结果，C4棉花反义转基因植株基因组杂交结果，Y18是非转基因对照；T1-T4是烟草基因组，NC89是非转基因烟草对照。
具体实施例方式
实施例1草甘膦诱导棉花高表达ag2基因的克隆1.DNA和RNA模板的制备用改良的CTAB法提取陆地棉品种L14基因组DNA，要求DNA片段大于50Kb，OD260/OD280大于1.8。采用改良的热硼酸法提取陆地棉品种L14的总RNA，用于DDRT-PCR、RT-PCR、RACE及cDNA序列的扩增。
2.用DDRT-PCR分离草甘膦诱导棉花差异表达EST序列利用DDRT-PCR方法，通过筛选40对引物组合(4个锚定引物T7T12AG/T7T12GC/T7T12CA/T7T12CT，例如T7T12AG5′-ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAG-3′；10个随机引物M13RP1-10，例如M13RP25′-ACAATTTCACACAGGAGCTAGCATGG-3′；组合成40对引物)，获得草甘膦诱导后在棉花中差异表达片段26个。草甘膦诱导棉花差异表达EST序列比对结果表明棉花中诱导表达的EST序列与茉莉酸诱导、防卫相关、马铃薯非生物胁迫等的EST序列有高达89％以上的同源性。同时通过分析发现棉花中引物组合AG2(T7T12AG与M13RP2的引物组合)(图1a)扩增出387bp的诱导表达片段与引物组合CA2扩增出391bp诱导表达片段同源性为96.6％，由于这2个片段都是双引物的扩增结果，因而认为该基因在两组引物中都有扩增的原因是该基因在诱导后有较强表达，暂时将该基因命名为ag2。
3.用RT-PCR和Northern Rlot分离草甘膦诱导后表达量最显著增加的EST序列设计差异表达EST序列的特异引物(F5′-ATAGATGCATTGTAACCAAACTTTG-3′，R5′-CAATTTCACACAGGAGCTAGCATG-3′)，用RT-PCR进行诱导特异性验证。RT-PCR筛选结果表明(图1b)ag2基因为草甘膦诱导后在棉花中表达量增加最显著的基因。为了排除DDRT-PCR中的假阳性，进一步验证ag2基因在草甘膦喷施前后表达的差异性，本发明根据ag2两端序列设计引物扩增探针(TF5′-CTAATTTTCAAATGAAAAGAGCTC-3′，TR5′-CCTATCATTTCCGGTAAAACAAAA-3′)，利用地高辛试剂盒标记探针与草甘膦诱导后不同时间材料的总RNA进行杂交。Northernblot结果表明(图2)，ag2确实为草甘膦诱导后高表达的基因。诱导表达从草甘膦喷施处理后6小时开始，持续到36小时。其表达的高峰期在24小时。这说明用生产使用的草甘膦浓度(2‰)，喷施棉苗后很快就可以诱导该基因的表达。
4.利用RACE技术分离ag2基因全长cDNA序列序列分析表明，最初差异显示得到的368bp的ag2基因的EST序列并非基因全长。于是根据获得的ag2基因的EST序列设计特异引物(正向引物GSP315′CTAATTTTCAAATGAAAAGAGCTC-3′，GSP325′-ATGCATTGTAACCAAACTTTGTAA-3′；反向引物APR 15′-CCCCCGGGTTTTTATCTTCGCTGACACCA-3′，APR25′-CCCTCTAGACGTTGCGATGCCCTTTGATTAG-3′)，利用3′RACE技术从草甘膦处理的棉花叶片中扩增得到了702bp的特异片段(图3a)。序列分析发现该片段包含2个加尾信号AATAAA、并有polyA尾巴结构，可以判断3′RACE扩增已经获得了该基因3′端全长序列。进一步分析发现，3′端扩增在ag2基因cDNA序列的3′端延伸了315bp的片段。将该基因序列进行BLAST比对，结果在GenBank中未发现明显与该基因同源的序列，因此，推测该基因是一个功能未知的新基因。
然后，利用5′RACE技术，在ag2基因不同位置分别设计了3对巢式引物(正向引物NPF15′-ACTCACCCCCGCCTCCA-3′；反向引物5R15′-GATTTGCCCCCAGTGAACAGGTTGT-3′，5R1N5′-GTGAACAGGTTGTCTCTGGATATCAG 3′，5R25′-GCTGTTCTCATCTAGTGGGTTGCT-3′，5R2N5′-GTGGGTTGCTCCAGGCAACAACC-3′，5R35′-CAGCATCATCAGTCACTGATTC-3′，5R3N5′-CAGTCACTGATTCATGTGTAAAC-3′)，扩增得到了3条特异条带(图3b)，回收测序分析发现，在ag2基因cDNA序列的5′端延伸了62bp，根据引物在基因上的位置分布可以判断5′RACE扩增获得了该基因5′端全长序列。根据所得到的序列进一步设计引物(TF5′-ATAACACAACCAAAACAAACTTTAGC-3′，TR5′-CCTATCATTTCCGGTAAAACAAAA-3′)，进行RT-PCR，扩增得到约750bp的电泳条带(图3c)。测序分析证明该片段为ag2基因的全长cDNA序列，其全长为760bp，其中包含一个456bp的完整读码框，54bp的5′端非翻译区和250bp的3′端非翻译区。
将全长ag2基因进行BLAST比对，结果发现，ag2基因在GenBank中已经有了较多的序列注册信息，但本研究得到的序列依然是最长的序列。利用DNAStar的Genequest软件对760bp的cDNA序列分析发现，其含有一个456bp的开放阅读框，编码152个氨基酸。5′端在开放阅读框架的第一个ATG上游有同框架的终止密码；3′端在编码框架的下游有终止密码，有一个以上的polyA加尾信号以及polyA尾。并且根据所获5′序列特征预测出转录起始位点。在预测的转录起始位点上游及起始位点处分别设计引物，与以polyA尾上游序列为依据设计引物配组扩增，结果只有预测的转录起始位点处设计的引物才能与polyA尾上游引物配组扩增出目的产物，说明预测的转录起始位点正确。由此可以推测本发明得到的cDNA序列即ag2基因的全长cDNA序列。
5.ag2基因内含子的获得在获得cDNA全长序列后，以转录起始位点和3′端PolyA尾上游序列为依据设计引物。对棉花基因组DNA中进行扩增，电泳后得到一条长度为856bp的特异条带(图4)。序列分析发现，除其中108bp的序列与已获得的ag2基因无同源性外，其余序列与ag2基因全长cDNA序列一致。
进一步在NCBI EST数据库和nr数据库进行检索发现，目前还没有与其同源的序列。因此推测该108bp片段为ag2的内含子。由此表明ag2基因全长(748+108)bp，包含2个外显子和1个内含子，编码区全长456bp，编码152个氨基酸残基。
实施例2棉花ag2基因序列分析1在NCBI EST数据库中对ag2基因进行Blast比对发现棉花抗细菌枯萎病抑制差减杂交库中的一条EST序列(GenBank登录号CF932119)与其同源性达93％(337/360)，且这条序列与茉莉酸诱导表达的蛋白相似。对ag2 cDNA序列blastx比对发现5个蛋白序列与ag2具有同源性，均为25％左右，其中一个23kDa的茉莉酸诱导表达的大麦蛋白与其同源性为26％(24/92)。因此推测，ag2基因可能为一个与诱导表达相关的未知功能基因。
2通过以上分析可知，ag2与茉莉酸诱导表达的蛋白有部分同源性。茉莉酸做为一种信号物质，在植物的生长发育和对生物胁迫的抗性中起重要作用。由此可以推测茉莉酸诱导表达的蛋白可能与抗逆性有关，因而，草甘膦诱导高表达的ag2基因的表达也有可能与对逆境的抗性的诱导具有重要关系。同时ag2基因与棉花抗枯萎病抑制差减杂交库中的某EST序列有较高同源性，也可能参与棉花抗枯萎病的生理过程。为了消除草甘膦对植物体灭生性影响，本发明最初是以抗草甘膦大豆为材料进行研究的，序列分析表明，草甘膦诱导大豆差异表达基因的序列与其它逆境胁迫例如热、水杨酸、茉莉酸、冷、缺磷、NaCl、射线、干旱、水等胁迫作用有很高的同源性。
3根据以上试验结果可以推论草甘膦做为一种逆境，和其它逆境胁迫一样，也会诱发植物体的抗逆反应，草甘膦诱导高表达的ag2基因产物可能是诱导反应过程中的一个信号传递成员，也可能是诱导反应的终产物，总之，ag2的高表达产物对植物体而言可能与抗性过程的发生有关，或者本身就具有缓解胁迫压力的作用。综上所述，本研究推测ag2基因可能为一个重要的抗性基因，因而有必要通过分子生物学手段对其功能进行鉴定。
实施例3棉花ag2基因植物表达载体的构建1鉴定基因功能的方法通常有两种，一是构建正义表达载体转化植株，在基因过量表达的情况下研究其功能；二是构建反义表达载体转化植株，在基因沉默的情况下研究其功能。通过分析ag2ORF及植物表达载体pBI121上的酶切位点，确定在pBI121上使用XbaI和SacI酶切位点，将GUS基因置换为正义或反义ag2基因。由于ag2上具有SacI酶切位点，因而在pBI121载体上使用SacI的同位酶Ecl136II代替SacI；对ag2基因的ORF，正义表达载体是在正向引物5′端设计XbaI酶切位点，在反向引物5′端则设计6碱基平末端内切酶NruI位点(SF5′-GCATCTAGAATGGCTAATTTTCAAATGAAAAGAGC-3′，SR5′-ATATCGCGATTATGCCTCTAACTCAAATGATGCCT-3′)；反义表达载体酶切位点的设计与正义表达载体正好相反(AF5′-GCCTCGCGAATGGCTAATTTTCAAATGAAAAGAGC-3′，AR5′-ATTTCTAGATTATGCCTCTAACTCAAATGATGCCT-3′)。
2采用高保真Taq酶，分别利用SF-SR和AF-AR引物组合，从克隆到T载体上的ag2 cDNA中扩增出带有不同酶切位点的ag2 ORF。再分别用相应的酶消化PCR产物和pUCm-T载体，连接克隆后，测序验证其正确性。检验ag2 ORF无误后，克隆到酶切消化好的pBI121载体上，分别构建成pBIag2S(正义)和pBIag2A(反义)植物表达载体。通过PCR鉴定证明，ag2ORF已克隆到了pBI121上。
实施例4棉花ag2基因转化棉花与烟草1分别将构建好的ag2正义和反义植物表达载体通过花粉管通道法导入棉花中。收获种子后，通过卡那霉素筛选和PCR检测(正向引物CF5′-ATGGCTAATTTTCAAATGAAAAGAGC-3′；反向引物CR5′-CCCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3′，TR5′-TTATGCCTCTAACTCAAATGATGCCT-3′)，获得转ag2基因正义表达载体植株33株，反义表达载体植株18株。对PCR阳性植株通过Southern Blot(图5)检测发现在棉花中是以多拷贝整合的。
2将ag2正义植物表达载体通过农杆菌转化烟草。分别经过共培养、选择培养及生根培养获得转化烟草植株。通过PCR检测筛选获得29株转基因植株，对部分PCR阳性植株经过Southern Blot(图5)检测发现ag2基因在烟草中是以单拷贝整合的。
实施例5棉花ag2基因的功能初步鉴定1前面发现认为ag2基因可能是一个抗逆相关基因，因此以PCR及Southern Blot检测的转基因阳性植株为试验材料，通过水杨酸处理、盐胁迫处理、淹水处理对ag2基因进行功能的初步鉴定。
2分别采用2mM、20mM、50mM水杨酸处理烟草叶片，观察发现(a)用2mM水杨酸(SA)溶液喷施烟草叶片，12小时、24小时、48小时后非转基因烟草植株与转基因烟草均无明显变化。(b)用20mM SA溶液喷施的烟草叶片，非转基因植株在处理后12小时就出现明显的灼烧斑，随着时间的延长，到24小时灼烧斑由青色变为白色，表现出受害症状。48h后灼烧斑点无扩散，受害症状与24小时后的表现相同。而转ag2烟草植株则表现出明显的抗性，只有很少很浅的灼烧斑，受害症状较对照烟草轻很多。(c)用50mM水杨酸溶液喷施烟草叶片后，6小时后转基因和非转基因烟草叶片都出现明显的枯萎现象，表现出受害症状，两者没有明显区别。以上结果说明转ag2的转基因烟草植株对20mM SA具有一定的抗性，这可能是ag2基因表达过程参与了水杨酸信号传导，使这一信号减弱来抵抗这一逆境。
3对T0代卡那酶素和PCR阳性的转基因种子，进行耐涝及0.6％NaCl、0.8％NaCl、1.0％NaCl的耐盐试验。其中转ag2正义表达载体的植株33株，反义表达载体的植株18株，对照为非转基因棉花Y18。试验结果表明在0.6％NaCl处理下，种子萌发差异不大；在0.8％的NaCl处理下转ag2正义种子较对照Y18明显具有萌发优势，正义种子有5株萌发，反义种子有1株萌发，而Y18全未萌发。在1.0％的NaCl处理下转ag2正义种子有3株萌发，而其余全未萌发。说明有9％的转ag2正义种子对1.0％的NaCl有明显抗性。由以上结果可知转正义ag2基因种子比对照Y18在高盐条件下有明显萌发优势；而反义种子与Y18相比，效果并不明显。这可能是ag2反义表达载体对棉花体内的ag2基因作用不明显，未能沉默或完全沉默ag2基因。由于种子量较少，而且T1代的基因整合和表达并不稳定，因此本试验仅是一个初步的检测，还有待进一步对这一基因的作用机理等方面进行鉴定。
权利要求
1.一种来源于棉花的草甘膦诱导的ag2基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的草甘膦诱导高表达的棉花ag2基因，其特征在于所述基因为序列表中的SEQ ID NO1。
3.根据权利要求1所述的草甘膦诱导高表达的棉花ag2基因，其特征在于所述基因为草甘膦生产使用浓度诱导高表达基因。
4.根据权利要求1所述的基因，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的蛋白质，或将SEQ ID NO2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO2的氨基酸残基序列相同活性的由序列SEQ ID NO2衍生的蛋白质。
5.根据权利要求1所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自5’端第55位到第510位碱基。
6.含有权利要求1所述基因的表达载体。
7.含有权利要求1所述基因的细胞系。
8.权利要求1所述基因在培养抗逆植物品种中的应用。
全文摘要
本发明从棉花基因组中克隆到一个ag2基因序列。初步功能鉴定结果表明该基因对水杨酸、NaCl、枯萎病菌等具有一定的抗性。该基因可进一步用于棉花对各种非生物胁迫逆境抗性的研究。
文档编号C07K14/415GK1727485SQ20051008863
公开日2006年2月1日 申请日期2005年7月29日 优先权日2005年7月29日
发明者郭三堆, 尉万聪, 张锐 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 郭三堆