专利名称：一种bodipy类荧光试剂在生物大分子标记中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物大分子的标记，具体地说是一种BODIPY类荧光试剂在生物大分子标记中的应用。
背景技术：
现有的标记蛋白的荧光染料如荧光素异硫氰酯(FITC)、4-氟-7-硝基苯并噁二唑(NBD-F)、3-呋喃甲酰喹啉-2-羰醛(FQ)、丹磺酰氯、荧光胺、和邻苯二甲醛(OPA)。这些试剂虽然也可以对蛋白质进行荧光标记，但是标记反应大都缺少选择性，过多的标记位点造成对蛋白质分子量有较大的变化，给蛋白的分离、定性带来困难。另外有些荧光试剂对溶液的pH值十分敏感如荧光素异硫氰酯(FITC)，而有些荧光试剂标记反应需要避光进行如丹磺酰氯。
BODIPY类染料由于开发较晚，现在应用不是很广泛，但是由于其荧光量子产率高，其荧光范围随取代基的不同变化很大，并且其荧光不受环境pH的影响，它的性能受到普遍公认。环氧基官能团能与亲核试剂发生开环反应生成稳定的共价键，可用于标记反应的活性反应基团。目前，尚未有以环氧环为活性反应基团的BODIPY类荧光标记试剂出现，来应用于蛋白质等大分子物质的荧光标记。
发明内容
本发明的目的在于提供一种BODIPY类荧光试剂在生物大分子标记中的应用，其为以环氧环为活性反应基团的新型BODIPY类荧光标记试剂，利用BODIPY母体分子中的活性环氧基团，在缓冲溶液中实现了对蛋白质大分子物质的荧光标记。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种BODIPY类荧光试剂在生物大分子标记中的应用，所述试剂化合物由1，3，5，7-四甲基-二氟化硼-二吡咯甲烷骨架，及带有可与被标识物质结合的活性环氧基团的取代基形成，其结构如通式[1]所示， [1]式中R表示带有环氧基的芳基、杂环基或烃基等取代基。
如所述荧光试剂为1，3，5，7-四甲基-8-苯基-(4-氧基-(3-环氧丙基))-二氟化硼-二吡咯甲烷(TMEPBODIPY)，其结构式为 或荧光试剂化合物中的R基为3-环氧丙基苯醚基的化合物。
所述荧光试剂可以作为柱前或泳前荧光标记试剂应用于高效液相色谱、平板电泳(SDS-PAGE)、毛细管电泳、电色谱、微流控芯片或荧光免疫分析实验等领域中，对生物大分子进行分离检测。本发明的荧光试剂可作为一般的荧光试剂使用，也可作为柱前或泳前荧光衍生化试剂，通过荧光标记可以大大提高被分析物的检测灵敏度。
本发明新型BODIPY类荧光试剂利用环氧基活性基团与不同环境下氨基等官能团的反应活性不同，可通过改变标记反应各种缓冲体系中的各种条件(如时间、温度、pH等条件)来实现选择性的对蛋白质、多肽、DNA或细胞等生物大分子物质的荧光标记。
下面以TMEPBODIPY(1，3，5，7-四甲基-8-苯基-(4-氧基-(3-环氧丙基))-二氟化硼-二吡咯甲烷)为例说明本发明新型荧光试剂的制备，其可按下述步骤进行a)以路易斯酸为催化剂，采用对羟基苯甲醛与2，4-二甲基吡咯在二氯甲烷溶剂中，常压下于氮气保护及水浴30-40℃条件下，搅拌反应10-12h，待反应完全后蒸干溶剂，将剩余物溶解在甲苯中，加入四氯苯醌，室温下搅拌反应2-3h，加入三乙胺搅拌5-10min，终止反应，并加入三氟化硼的乙醚溶液，搅拌反应10-30min。柱分离(洗脱液为10∶1～1∶10(v/v)的乙酸乙酯-石油醚溶液)得到化合物羟基BODIPY(1，3，5，7-四甲基-8-苯基-(4-羟基)-二氟化硼-二吡咯甲烷)；其中对羟基苯甲醛、2，4-二甲基吡咯之间的质量比范围可为1∶1～10∶1。
b)以路易斯碱为催化剂，将步骤1产物羟基BODIPY与环氧氯丙烷，在乙醇溶液中，于氮气保护常压下，水浴40-60℃搅拌反应8-10h，蒸去溶剂，用硅胶柱色谱分离纯化(二氯甲烷和甲醇配比范围为从100％的二氯甲烷至二氯甲烷∶甲醇＝1∶100(v/v))，得产物TMEPBODIPY，即可用于衍生化或标记反应实验；其中羟基BODIPY、环氧氯丙烷之间的质量比范围为1∶1～1∶100。
c)标记反应可在磷酸盐、碳酸氢盐和硼酸盐等缓冲体系下进行(pH为7～12)避光反应1～12h。
本发明具有如下优点1、本发明利用了BODIPY染料良好的荧光性能及环氧基官能团与氨基等官能团在温和条件下即能发生亲核加成反应的性质，合成了以环氧环为活性反应基团的新型BODIPY类荧光标记试剂，荧光标记反应简单，标记产物性质稳定。可应用于高效液相色谱、平板电泳(SDS-PAGE)、毛细管电泳、电色谱、微流控芯片、荧光免疫分析实验中对蛋白质等生物大分子物质的荧光标记。
2、本发明由于利用环氧基活性基团与不同缓冲环境下氨基等官能团的反应活性不同，实现了选择性标记，反应选择性的深入研究将在蛋白质组的研究工作中具有重要的意义。
TMEPBODIPY的优点1.标记反应位点可根据缓冲pH不同进行调节，标记产物性质稳定、在酶解条件下不会破坏环氧基团与标记位点的氨基酸残基间形成的共价键。
2.检测波长与常用的激光诱导荧光检测器的匹配。
3.标记反应条件温和，荧光检测下对蛋白和多肽检测灵敏度均远高于紫外和质谱。
4.选择性荧光标记和检测可以大大简化分离的难度，可以对特定的肽段进行有目的的检测、富集，从而实现对一些特殊的、低丰度蛋白的鉴定。
总之，本发明通过化学修饰反应，首次在BODIPY母体分子中引入新型的活性环氧基团，制备得到了以环氧环为活性反应基团的新型BODIPY类荧光标记试剂。通过环氧基官能团与氨基的亲核加成反应，可使试剂与目标分子间形成非常稳定的共价键，从而实现对目标分子的荧光标记，标记完成后可使目标分子检测灵敏度得以大大提高，通过对比TMEPBODIPY和荧光素异硫氰酯(FITC)荧光标记BSA的酶解产物说明了标记反应选择性的差别。对标记反应选择性的深入研究将在选择性的标记检测蛋白质和多肽的研究工作中具有重要的意义。
图1(a)为BSA高效液相色谱图(荧光检测)；图1(b)为TMEPBODIPY标记牛血清白蛋白BSA高效液相色谱图(荧光检测)；图2为TMEPBODIPY标记牛血清白蛋白BSA SDS-PAGE电泳图；图3(a)为FITC标记牛血清白蛋白BSA酶解产物高效液相色谱图；图3(b)为TMEPBODIPY标记牛血清白蛋白BSA酶解产物高效液相色谱图；图4环氧基与氨基酸标记反应示意图。
具体实施例方式
实施例1(一)所述荧光试剂TMEPBODIPY的合成与标记方法具体步骤如下(1)首先以2，4-二甲基吡咯、对羟基苯甲醛为原料，生成羟基BODIPY(1，3，5，7-四甲基-8-苯基-(4-羟基)-二氟化硼-二吡咯甲烷)。在装有100mL二氯甲烷的500mL的圆底烧瓶中加入对羟基苯甲醛200mg，2，4-二甲基吡咯115mg和1mg三氟乙酸(路易斯酸)，于氮气保护常压下，水浴35～40℃电磁搅拌反应10-12h。待反应完全后蒸干溶剂，将剩余物溶解在甲苯中，加入110mg的四氯苯醌，室温下搅拌反应2h，溶液变成黑褐色，然后加入242mg三乙胺搅拌反应5min后，并立即加入0.5mL的三氟化硼(其中三氟化硼263mg)乙醚溶液(47％，w/w)，室温下搅拌反应25～35min后停止反应，将溶剂减压蒸干；(2)剩余物再经过用柱色谱(200～300目)硅胶分离纯化应用下一步合成反应，洗脱液为7∶3(v/v)的乙酸乙酯-石油醚溶液；(3)在圆底烧瓶中加入66.4mg的碘化钾，58mg环氧氯丙烷和100mL乙醇，于50℃搅拌反应20min。然后加入溶有34mg的羟基BODIPY和41.5mg K2CO3的乙醇溶液，在氮气氛围下于50℃下搅拌反应9h；(4)蒸去溶剂，剩余物以二氯甲烷作淋洗液，用柱色谱(200～300目)硅胶分离纯化，得到产物6mg，用1mL二甲亚砜溶解，应用于下一步标记反应；(5)环氧基官能团能与目标分子发生开环反应生成稳定的共价键，从而实现荧光标记。
与蛋白的标记反应可在磷酸盐、碳酸氢盐和硼酸盐等缓冲体系下进行(pH为7～12)。称取10mg的BSA，加入1mL的磷酸氢二钠的缓冲溶液(100mM，pH为8.0)，取100μL此BSA溶液加入到1mL的离心管中，然后加入50μL TMEPBODIPY二甲亚砜溶液，然后再加入50μL磷酸氢二钠的缓冲溶液(100mM，pH为8.0)，避光反应12h。
(6)TMEPBODIPY标记BSA的纯化，将上述BSA标记反应液加入到装有1×9cm、SephacrylTMS-200的柱子中进行纯化。洗脱液为磷酸氢二钠的缓冲溶液(100mM，pH为8.0)。然后将主成分收集，经超滤浓缩后即可用于液相和SDS-PAGE电泳分析。
(二)如图1(a)和(b)所示，通过对比BSA和TMEPBODIPY标记BSA产物色谱图，可以确认TMEPBODIPY标记BSA产物的色谱峰。说明TMEPBODIPY可以对蛋白质进行柱前荧光标记，对比检测响应可以看出BSA经TMEPBODIPY标记后检测灵敏度获得大大提高。
图1(a)和(b)的色谱分离条件Column 250×4.6mm Vydac C18(5μm)；flow rate＝1.0mL min-1；流动相A水含0.1％TFA，流动相B乙腈含0.1％TFA；梯度条件0min＝80％A，40min＝0％A；流速1mL/min；柱温室温；荧光激发和发射波长为λex/λem＝500/510nm；(三)采用SDS-不连续凝胶电泳，按下述电泳条件，对TMEPBODIPY标记纯化后的BSA进行分离，分离结果见图2；在样品孔I中加入了TMEPBODIPY标记纯化后的BSA，在样品孔II中分别加入了TMEPBODIPY试剂的空白对照，在样品孔III中加入了蛋白质标准。电泳结束后，在紫外灯(300nm)下对分离胶照相，然后用考马斯亮蓝染色4-5小时，再用脱色液进行脱色。如图2所示，经与相应试剂空白对照，在1分离通道中出现被荧光标记的产物的条带，再与考马斯亮蓝染色后的右3号分离通道中蛋白质标准相对照，与牛血清白蛋白(66，200)的带位置相一致，说明应为荧光标记的BSA的带。
因此，TMEPBODIPY可以作为泳前荧光标记试剂对蛋白质等生物大分子进行荧光标记，然后采用平板电泳进行分离检测。
SDS-PAGE电泳条件2倍上样缓冲液0.5M Tris-HCl，pH 6.8(2.0mL)，甘油(2.0mL)，20％(w/v)SDS(2.0mL)，0.1(w/v)溴酚蓝(0.5mL)，2-巯基乙醇(1.0mL)，重蒸馏水(2.0mL)；SDS-PAGE条件分离胶浓度12％；浓缩胶浓度5％；图2中I为TMEPBODIPY标记牛血清白BSA的SDS-PAGE电泳图；II为TMEPBODIPY的试剂空白SDS-PAGE电泳图；III为六种标准蛋白SDS-PAGE电泳图经考马斯亮蓝染色；其中1为兔磷酸化酶B(97400)，2为牛血清白蛋白(66200)，3为兔肌动蛋白(43000)，4为牛碳酸酐酶(31000)，5为胰蛋白酶拟制剂(20100)，6为鸡蛋清溶菌酶(14400)。
(四)活性环氧基官能团可以在不同的pH条件下分别与-SH、-NH2、-OH进行反应，反应示意图见图4。在相同酶解条件，分别对FITC、和TMEPBODIPY标记纯化后的BSA进行了酶解，并对各自酶解产物进行了HPLC分析。
酶解条件取100μL TMEPBODIPY或FITC标记的BSA溶液，加入50μL Tris-HCl缓冲液中(100mM，pH为8.0)，50μL CaCl2(20mM)，100μL尿素(8M)，然后加入50μL二硫苏糖醇(11.8g/L)，氮气吹20min，然后加入50μL碘乙酸(22g/L)，室温反应15min，稀释样品使尿素浓度达到2M。然后加入20μL胰蛋白酶溶液(6g/L)，在37℃水浴下反应12h。
如图3(a)和(b)所示，FITC标记纯化后BSA的酶解产物在出峰数上明显多于TMEPBODIPY所标记纯化后BSA的酶解产物。将峰数大致标出后比较，FITC标记纯化后BSA的酶解产物在出峰数大约分别是TMEPBODIPY所标记纯化后BSA的酶解产物出峰数的三倍，这说明了TMEPBODIPY与FITC在蛋白质上标记位点选择性上的不同。因为我们选择的缓冲pH为8.0，理论上只有蛋白质的组氨酸咪唑环氨基和半胱氨酸的巯基可与标记试剂的活性环氧基进行反应。
色谱条件Column 250×4.6mm Vydac C18(5μm)；flow rate＝1.0mLmin-1流动相A水含0.1％TFA，流动相B含0.1％TFA乙腈；梯度条件0～5min＝80％A，5～50min＝80％A～60％A，50～70min＝60％A～0％A；流速1mL/min；柱温室温；荧光激发和发射波长为λex/λem＝492/520nm(a)，λex/λem＝500/510nm(b)实施例2通式[1]中R表示带有环氧基的芳基所示化合物的制备方法，此类化合物的制备可采用芳基甲醛类化合物(如对羟基苯甲醛)与2，4-二甲基吡咯，于氮气水浴加热下进行，以四氯苯醌作为脱氢剂，以三乙胺反应终止剂，最后加入三氟化硼的乙醚溶液，完成络合反应。
反应式如下 式中R2表示芳基。
权利要求
1.一种BODIPY类荧光试剂在生物大分子标记中的应用，其特征在于所述试剂化合物由1，3，5，7-四甲基-二氟化硼-二吡咯甲烷骨架，及带有可与被标识物质结合的活性环氧基团的取代基形成，其结构如通式[1]所示， [1]式中R表示带有环氧基的芳基、杂环基或烃基。
2.按照权利要求1所述荧光试剂在生物大分子标记中的应用，其特征在于所述荧光试剂为1，3，5，7-四甲基-8-苯基-(4-氧基-(3-环氧丙基))-二氟化硼-二吡咯甲烷，其结构式为
3.按照权利要求1所述荧光试剂在生物大分子标记中的应用，其特征在于所述荧光试剂化合物中的R基为3-环氧丙基苯醚基的化合物。
4.按照权利要求1所述荧光试剂在生物大分子标记中的应用，其特征在于所述荧光试剂可以作为柱前或泳前荧光标记试剂应用于高效液相色谱、平板电泳(SDS-PAGE)、毛细管电泳、电色谱、微流控芯片或荧光免疫分析实验中，对生物大分子进行分离检测。
5.按照权利要求1、2、3或4所述荧光试剂在生物大分子标记中的应用，其特征在于所述生物大分子为蛋白质、多肽、DNA或细胞。
全文摘要
本发明涉及生物大分子的标记，具体地说是一种BODIPY类荧光试剂在生物大分子标记中的应用，所述试剂化合物由1，3，5，7－四甲基－二氟化硼－二吡咯甲烷骨架，及带有可与被标识物质结合的活性环氧基团的取代基形成，其结构如通式[1]所示，[1]式中R表示带有环氧基的芳基、杂环基或烃基。本发明利用BODIPY母体分子中的活性环氧基团，在缓冲溶液中实现了对蛋白质的荧光标记；可以作为柱前或泳前荧光标记试剂应用于高效液相色谱、平板电泳(SDS－PAGE)、毛细管电泳、电色谱、微流控芯片或荧光免疫分析实验中，对生物大分子进行分离检测。
文档编号C07F5/00GK101059507SQ20061004634
公开日2007年10月24日 申请日期2006年4月18日 优先权日2006年4月18日
发明者张玉奎, 张琳, 张维冰, 张丽华, 乔晓强 申请人:中国科学院大连化学物理研究所