蛋白激酶抑制剂的制作方法

专利名称：：蛋白激酶抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明提供了一类新的化合物、包含这类化合物的药物组合物和使用这类化合物来治疗或预防与激酶活性异常或失控有关的疾病或紊乱、特别是涉及Lck、IR、IGF誦1R、JNKla、Flt3、Fes、EFGR(Her-l、erbB-l)、cSRC、CDKl/细胞周期蛋白B、c-RAF、BTK、Bmx、Axl、Aurora-A、Abl、BCR画Abl、TrkB、Tie2、Syk、SGK、SAPK2a、Rskl和Met激酶异常激活的疾病或紊乱的方法。背景蛋白激酶代表一大家族蛋白质，其在调节广泛多样的细胞过程和维持对细胞功能的控制方面起关键作用。这些激酶非限定性的部分列表包括受体酪氨酸激酶，例如血小板衍生生长因子受体激酶(PDGF-R)、神经生长因子受体trkB、Met和成纤维细胞生长因子受体FGFR3;非受体酪氨酸激酶如Abl和融合激酶BCR-Abl、Lck、Csk、Fes、Bmx和c-src;以及丝氨^/苏氨酸激酶，例如b-RAF、c-RAF、sgk、MAP激酶(如MKK4、MKK6等)和SAPK2a、SAPK2p和SAPK3。在许多疾病状态中已经观察到异常的激酶活性，包括良性和恶性增殖性紊乱以及免疫和神经系统不恰当的激活导致的疾病。本发明的新化合物抑制一种或多种蛋白激酶的活性，因此预期可用于治疗与激酶相关的疾病。发明概述在一个方面，本发明提供了式I化合物及其N-氧化物衍生物、前药衍生物、被保护的衍生物、单一异构体及异构体混合物以及这类化合物的可药用的盐和溶剂化物(例如7K合物)，其中n选白1、2和3;m选白1、2和3;X！选自价键、O、NH和N(CH3);X2选自O和NH;Y选自N和CH;R，选自卣素取代的CL4烷基、卣素取代的Cw烷氧基、d，4烷基、卤代基和C,，4烷氧基；R2选自卣素取代的Cw烷基、卣素取代的C^烷氧基、C"烷基、卣代基、Cw烷氧基和-NHC(0)R3;其中议3是(:3.12环烃基。在第二方面，本发明提供了含有式I化合物或其N-氧化物衍生物、单一异构体及异构体混合物或者它们的可药用盐以及一种或多种适宜赋形剂的药物组合物。在第三方面，本发明提供了治疗动物的其中抑制激酶活性、特别是抑制Lck、IR、IGF-1R、JNKla、Flt3、Fes、EFGR(Her-l、erbB-l)、cSRC、CDKl/细胞周期蛋白B、c-RAF、BTK、Bmx、Axl、Aurora-A、Abl、BCR画Abl、TrkB、Tie2、Syk、SGK、SAPK2a、Rskl和/或Met的活性可以预防、抑制或改善疾病的病理和/或症状的疾病的方法，该方法包括给动物施用治疗有效量的式I化合物或其N-氧化物衍生物、单一异构体及异构体混合物或者它们的可药用盐。在第四方面，本发明提供了式I化合物在制备药物中的用途，所述的药物用于在动物中治疗其中激酶的活性、特别是Lck、IR、IGF-lR、JNKla、Flt3、Fes、EFGR(Her画l、erbB曙l)、cSRC、CDKl/细胞周期蛋白B、c國RAF、BTK、Bmx、Axl、Aurora-A、Abl、BCR-Abl、TrkB、Tie2、Syk、SGK、SAPK2a、Rskl和/或Met的活性对该疾病的病理和/或症状起作用的疾病。在第五方面，本发明提供了制备式I化合物及其N-氧化物衍生物、前药衍生物、被保护的衍生物、单一异构体及异构体混合物以及它们的可药用盐的方法。发明详述定义"烷基"作为基团和作为其它基团(例如卣素取代的烷基和烷氧基)的结构元件，可以是直链的或支链的。d-4烷氧基包括甲氧基、乙氧基等等。卤素取代的烷基包括三氟曱基、五氟乙基等等。"芳基"表示含有六至十个环碳原子的单环或稠合双环芳香环系。例如，芳基可以是苯基或萘基，优选苯基。"亚芳基，，表示衍生自芳基的二价基团。"杂芳基"如上文芳基中定义，其中一个或多个环成员为杂原子。例如杂芳基包括吡淀基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并瘗喃基、苯并[1，3二氧杂环戊烯、咪唑基、苯并咪唑基、嘧咬基、呋喃基、嗜、唑基、异嗯峻基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。"环烃基"表示含有指定数目环原子的饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥连多环系。例如，Cwo环烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。"杂环烃基，，表示如本申请所定义的环烃基，条件是一个或多个指定的环原子被选自-O-、-N=、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)r的基团代替，其中R是氢、CL4烷基或氮保护基。例如，被用于本申请来描述本发明化合物的C3，8杂环烃基包括吗啉代基、吡咯烷基、吡咯烷基-2-酮、p/艮，秦基、哌咬基、哌啶酮基(piperidinylone)、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5j癸-8-基等。"闺素"(或卣代基)优选代表氯或氟，但也可以是溴或碘。"激酶名单，，是包括如下激酶的激酶名单Abl(人)、Abl(T3151)、JAK2、JAK3、ALK、JNKlal、ALK4、KDR、Aurora曙A、Lck、Blk、MAPK1、Bmx、MAPKAP-K2、BRK、MEK1、CaMKII(大鼠)、Met、CDKl/细月包周期蛋白B、p70S6K、CHK2、PAK2、CK1、PDGFRa、CK2、PDK1、c-kit、Pim-2、c画RAF、PKA(h)、CSK、PKBa、cSrc、PKCa、DYRK2、Plk3、EGFR、ROCK-I、Fes、Ron、FGFR3、Ros、Flt3、SAPK2a、Fms、SGK、Fyn、SIK、GSK3p、Syk、IGF-1R、Tie誦2、IKO、TrKB、IR、WNK3、IRAK4、ZAP-70、ITK、AMPK(大鼠)、LIMK1、RsK2、Axl、LKB1、SAPK2P、BrSK2、Lyn(h)、SAPK3、BTK、MAPKAP-K3、SAPK4、CaMKIV、MARK1、Snk、CDK2/细胞周期蛋白A、MINK、SRPK1、CDK3/细胞周期蛋白E、MKK4(m)、TAK1、CDK5/p25、MKK6(h)、TBK1、CDK6/细胞周期蛋白D3、MLCK、TrkA、CDK7/细胞周期蛋白H/MAT1、MRCKp、TSSK1、CHK1、MSK1、Yes、CKld、MST2、ZIPK、c-Kit(D816V)、MuSK、DAPK2、NEK2、DDR2、NEK6、DMPK、PAK4、DRAK1、PAR-lBa、EphAl、PDGFRp、EphA2、Pim-l、EphA5、PKBp、EphB2、PKC卩I、EphB4、PKC3、FGFR1、PKCij、FGFR2、PKC0、FGFR4、PKD2、Fgr、PKGip、Fltl、PRK2、Hck、PYK2、HIPK2、Ret、IKKa、RIPK2、IRR、ROCK画II(人)、JNK2a2、Rse、JNK3、Rskl(h)、PI3Ky、PI3K8和PI3-K卩。根据该激酶名单(野生型和/或其突变体)筛选出本发明化合物，其抑制至少一种所述名单成员的活性。"BCR-Abl突变体形式"表示野生型序列的单一或多个氨基酸改变。BCR-ABL的突变通过破坏蛋白质与抑制剂(例如Gleevec等)之间的关键接触点而发挥作用，更经常地通过诱导从无活性状态向活性状态、也就是BCR-ABL与Gleevec不能结合的构型的转变而发挥作用。根据临床样品的分析，净皮发现与抗性表型有关的突变的总数已经随时间的推移緩慢但不可抗拒地增加。突变似乎聚集在四个主要的区域。一组突变(G250E、Q252R、Y253F/H、E255K/V)包括构成ATP的磷酸-结合袢(也称为P-袢)的氨基酸。第二组(V289A、F311L、T315LF317L)可在Gleevec结合位点处发现，经由氢键或范德华力直接与抑制剂相互作用。第三组突变(M351T、E355G)聚集在催化结构域附近。第四组突变(H396R/P)位于活化袢中，它的构型是控制激酶活化/失活的分子开关。在CML和ALL患者中检测到的与Gleevec有关的BCR-ABL点突变包括M224V、L248V、G250E、G250R、Q252R、Q252H、Y253H、Y253F、E255K、E255V、D276G、T277A、V289A、F311L、T315I、T315N、F317L、M343T、M315T、E355G、F359V、F359A、V379I、F382L、L387M、L387F、H396P、H396R、A397P、S417Y、E459K和F486S(单个字母代码所示的氨基酸位置是用于基因库(GenBank)序列的那些，登录号AAB60394,相应于ABL型la;Martinelli等，Haematologica/TheHematologyJournal,2005年4月；90-4)。除非本发明另有规定，Bcr-Abl表示该酶的野生型和突变体形式。"治疗"涉及减轻或緩解疾病和/或其伴随症状的方法。优选实施方案的描述本发明提供了用于治疗与激酶相关的疾病、特别是与Lck、IR、IGF-1R、JNKla、Flt3、Fes、EFGR(Her-l、erbB-l)、cSRC、CDKl/细胞周期蛋白B、c画RAF、BTK、Bmx、Axl、Aurora-A、Abl、BCR-Abl、TrkB、Tie2、Syk、SGK、SAPK2a、Rskl和Met激酶相关的疾病的化合物、组合物和方法。例如，可以通过抑制Bcr-Abl的野生型和突变型来治疗与BCR-Abl相关的白血病和其它增殖性紊乱。在一项实施方案中，涉及如下定义的式I化合物，其中n选自l和2;m选自l和2;X，选自价键、O、NH和N(CH3);X2选自0和NH;Y选自N和CH;Ri选自卣素取代的d，4烷基、d，4烷基、鹵代基和Cw烷氧基；且R2选自卣素取代的Cw烷基、-]\11<:(0)议3和(:1.4烷氧基；其中R3是<:3.12环烃基。在另一项实施方案中，Ri选自环丙基-羰基-氨基、环己基-羰基-氨基、三氟甲基和甲氧基。在另一项实施方案中，R2选自三氟甲基、甲基、卤代基和甲氧基。优选的本发明化合物选自环丙烷曱酸{3-[6-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基-苯基}-酰胺；N,N'-双-(3-三氟曱基-苯基)-嘧啶-4，6-二胺；环丙烷曱酸{2-甲氧基-5-[6-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基-苯基}-酰胺；环己烷甲酸{2-甲氧基-5-[6-(3-三氟曱基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基1-苯基}-酰胺；环丙烷甲酸[3-(6-邻曱苯基氨基-嘧啶-4-基氨基)-苯基l-酰胺；环丙烷甲酸{3-[6-(2-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基1-苯基}-酰胺；环丙烷曱酸(3-{6-[曱基-(3-三氟甲基-苯基)-氨基1-嘧啶-4-基氨基}-苯基)-酰胺；环丙烷甲酸{3-[6-(3-三氟甲基-苯氧基)-嘧啶-4-基氨基-苯基}-酰胺；环丙烷曱酸{2-甲氧基-5-[6-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基-苯基}-酰胺；环丙烷甲酸{3-[6-(2，5-二甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基氨基-苯基}-酰胺；环丙烷曱酸{3-6-(5-氯-2-甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基氨基-苯基}-酰胺；环丙烷曱酸(3-{甲基-[6-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-氨基}-苯基)-酰胺；环丙烷甲酸{3-[2-(3-三氟曱基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基1-苯基}-酰胺；环丙烷甲酸{3-[4-(3-三氟曱基-苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-酰胺；4，6-双-(3-三氟甲基-苯氧基)-嘧啶；和N，N'-双-(3-三氟甲基-苯基)-吡啶-2，4-二胺。其它优选的本发明化合物在下文实施例和表I中详述。药理学和效用本发明的化合物调节激酶的活性，本身可用于治疗其中激酶对该疾病病理学和/或症候学有作用的疾病或紊乱。被本文所述的化合物和组合物抑Lck、IR、IGF-1R、JNKla、Flt3、Fes、EFGR(Her-l、erbB-l)、cSRC、CDKl/细胞周期蛋白B、c-RAF、BTK、Bmx、Axl、Aurora-A、Abl、BCR-Abl、TrkB、Tie2、Syk、SGK、SAPK2a、Rskl和Met激酶。Abelson酪氨酸激酶(即Abl，c-Abl)参与细胞周期的调控、对基因毒性应激的细胞应答,并通过整联蛋白发信号来参与有关细胞环境的信息传递。大体上，Abl蛋白作为这样一种细胞模块来起复杂作用该细胞模块整合多种胞外和胞内来源的信号并影响关于细胞周期和凋亡的决定。Abelson酪氨酸激酶包括多种亚型衍生物，例如具有失控的酪氨酸激酶活性的嵌合融合体(癌蛋白)BCR-Abl或v-Abl。BCR-Abl在95%的慢性髓性白血病(CML)和10。/。的急性淋巴细胞白血病的发病机制中是重要的。STI-571(Gleevec)是致癌的BCR-Abl酪氨酸激酶的抑制剂，可用于治疗慢性髓性白血病(CML)。但是，有些处于CML原始细胞危象期的患者由于BCR-Abl激酶中的突变而对STI-571有抗性。迄今为止，已报道了超过22种的突变体，最常见的是G250E、E255V、T315I、F317L和M351T。本发明的化合物抑制abl激酶、尤其是v-abl激酶。本发明的化合物还抑制野生型BCR-Abl激酶和BCR-Abl激酶的突变体，因此适于治疗BCR-Abl阳性癌症和胂瘤疾病，例如白血病(尤其是慢性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病，其中尤其发现有细胞凋亡的作用机制)，它们还表现出对白血病干细胞亚群的作用以及在抽取上述细胞(例如抽取骨髓)后体外纯化这些细胞和清除癌细胞后再移植这些细胞(例如经纯化骨髓细胞的再移植)的可能性。Ras-Raf-MEK-ERK信号通路介导了对生长信号的细胞应答。在约15%的人类癌症中，Ras突变为致癌形式。Raf家族属于丝氨^/苏氨酸蛋白激酶，它包括三个成员，A-Raf、B-Raf、C-Raf(或Raf-l)。Raf作为药物靼点的焦点集中于Raf作为Ras的下游效应子的关系上。但是，近来的数据显示，B-Raf可能在特定肿瘤的形成中具有重要地位，而不需要活化的Ras等位基因(Nature417，949-954(2002年7月1日))。特别是已经在很大比例的恶性黑素瘤中检测出B-Raf突变。对黑素瘤的现有医学治疗效力有限，尤其是对于晚期黑素瘤而言。本发明的化合物还抑制涉及b-Raf激酶的细胞过程，提供了治疗人类癌症、尤其是黑素瘤的新的治疗机会。本发明的化合物还抑制涉及c-Raf激酶的细胞过程。c-Raf由ras癌基因活化，其在大量的人类癌症中发生突变。因此，抑制c-Raf激酶活性能提供一条途径来防止ras介导的肿瘤生长[Campbell,S.L.，Oncogene,17，1395(1998)。PDGF(血小板衍生生长因子)是非常常见的生长因子，它在正常生长和病理细胞增殖中均起重要作用，例如致癌作用和在血管平滑肌细胞疾病中可见，例如动脉粥样硬化和血栓形成。本发明的化合物能够抑制PDGF受体(PDGFR)的活性，因此适于治疗胂瘤疾病，例如神经胶质瘤、肉瘤、前列腺肿瘤以及结肠、乳房、卵巢肿瘤。本发明的化合物不仅可用作肿瘤抑制物质(例如在小细胞肺癌中)，而且还可用作治疗非恶性增殖性紊乱(例如动脉粥样硬化、血栓形成、银屑病、硬皮病、纤维变性)、保护千细胞(例如抵抗化疗剂如5-氟尿嘧啶的血毒素作用)和治疗哞喘的药物。本发明的化合物尤其可用于治疗对抑制PDGF受体激酶有响应的疾病。本发明的化合物在治疗移植引起的紊乱中表现出有用效用，例如在同种异体移植、尤其是组织排斥中，例如尤其是闭塞性细支气管炎(OB),即同种异体肺移植的慢性排斥。与未患OB的人相比，OB患者的支气管肺泡灌洗液中的PDGF浓度较高。本发明的化合物还对与血管平滑肌细胞迁移和增殖相关的疾病(其中PDGF和PDGF-R通常也起作用)有效，例如再狭窄和动脉粥样硬化。这明化合物的施用得到证明，还可通过观察其对于体内血管内膜在机械损伤后的增厚的作用而得到证明。神经营养受体的trk家族(trkA、trkB、trkC)促进神经和非神经组织的存活、生长和分化。TrkB蛋白可以在下列细胞中有表达在小肠和结肠的神经内分泌型细胞中、在胰腺的oc细胞中、在淋巴结和脾脏的单核细胞和巨嗜细胞中以及表皮颗粒层中(Shibayama和Koizumi,1996)。TrkB蛋白的表达与Wilms肺瘤和成神经细胞瘤的不良发展有关。而且，TkrB可以在癌性前列腺细胞中有表达，但在正常细胞中不会表达。信号通路下游的trk受体通过Shc、活化的Ras、ERK-1和ERK-2基因参与了MAPK激活级联反应和PLC-gammal转导通路(Sugimoto等，2001)。激酶c-Src传导了许多受体的致癌基因信号。例如，肿瘤中EGFR或HER2/neu的过度表达导致c-Src的组成性激活，它是恶性细胞所特有的，而在正常细胞中没有。另一方面，小鼠c-Src表达的缺乏具有骨石化的表型，这说明c-Src在破骨细胞功能中起到了关键作用，并且可能与相关的疾病有关。Tec家族的激酶Bmx是一种非受体蛋白质-酪氨酸激酶，控制着乳房上皮癌细胞的增殖。成纤维细胞生长因子受体3对骨生长具有负面调节作用，并抑制软骨细胞增殖。导致死亡的发育异常是成纤维细胞生长因子受体3的不同突变导致的，一种突变型，TDIIFGFR3，具有组成性酪氨酸激酶活性，它能够激活转录因子Statl，导致细胞-循环抑制剂表达，生长停止和异常骨发育(Su等，Nature,1997，386,288-292)。FGFR3也经常在多种骨髓瘤型癌症中表达。FGFR3活性的抑制剂可用于治疗T-细胞介导的炎症或自身免疫性疾病，包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、胶原II型关节炎、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、银屑病、青少年型糖尿病、舍格伦病、甲状腺疾病、肉状瘤病、自身免疫性色素层炎、炎性肠病(节段性回肠炎和溃疡性结肠炎)、麸质过敏症(celiacdisease)和重症肌无力。血清和糖皮质激素-调节的激酶(SGK)的活性与紊乱的离子通道活性有关，特别是那些钠和/或钾通道，因此本发明化合物可以用于治疗高血压。Lin等人((1997)J.Clin.Invest.100，8:2072-2078)和P.Lin(1998，PNAS95，8829-8834)已经证明在腺病毒感染期间或对乳房肿瘤和黑素瘤异种移植物模型的Tie-2(Tek)细胞外结构域注射期间，肿瘤生长和血管形成受到抑制，并且肺转移降低。Tie2抑制剂可以在新血管形成不当时使用，即，在糖尿病性碎见网膜病、慢性炎症、4艮屑病、卡波西肉瘤、黄斑变性导致的慢性新血管形成、类风湿性关节炎、嬰儿血管瘤和癌症中。Lck在T-细胞信号中起作用。缺乏Lck基因的小鼠形成胸腺细胞的能力很差。作为T-细胞信号正向激活剂的Lck功能表明Lck抑制剂可以用于治疗自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎。JNK类及其它MAPK类在介导细胞对下列疾病的响应中起作用癌症、凝血酶诱导的血小板聚积、免疫缺陷性疾病、自身免疫性疾病、细胞凋亡、过敏症、骨质疏松症及心脏病。与JNK通路激活有关的治疗靶疾病包括慢性骨髓性白血病(CML)、类风湿性关节炎、哮喘、骨关节炎、局部缺血、癌症和神经退行性疾病。由于JNK激活的重要的结果是与肝病和肝缺血有关，所以本发明化合物也可以用于治疗各种肝脏疾病。JNK在心血管疾病(例如心肌梗塞或充血性心衰)中的作用已有报道，它表明JNK对各种形式的心脏应激都会介导较大的响应。已经证明JNK级联在T-细胞活化中也起作用，包括IL-2启动子的激活。所以，JNK抑制剂在改变病理性免疫响应中具有治疗价值。在各种癌症中，JNK活化的作用也已经被确定，从而提示了JNK抑制剂在癌症中的可能的应用。例如，组成性活化的JNK与HTLV-l介导的胂瘤发生有关Oncogene13:135-42(1996)。JNK可能在卡波西肉瘤(KS)中也起作用。与KS增殖有关的其它细胞因子的其它增殖作用可能也是由JNK介导的，例如，血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6及TNFa。另外，在p210BCR-ABL转化细胞中c-jun基因的调节相应于JNK活性，这表明JNK抑制剂在治疗慢性骨髓性白血病(CML)中的作用[Blood92:2450-60(1998)。据认为某些异常增殖病症与raf表达有关，所以认为应该对raf表达的抑制有响应。Raf蛋白的异常高水平表达也与转化及异常的细胞增殖有关。这些异常增殖病症也被认为对raf表达的抑制有响应。例如，因为已经报道所有肺癌细胞系中的60%表现出异常高水平的c-rafmRNA和蛋白，所以相信c-raf蛋白的表达在异常细胞增殖中起作用。异常增殖性病症的另外的实例为过度增殖性疾病，例如癌症、肿瘤、增生、肺纤维化、血管生成、银屑病；动脉粥样硬化和血管中平滑肌细胞增殖，例如狭窄或血管成形术后的再狭窄。Raf参与其中的细胞信号通路也与以T-细胞增殖(T-细胞活化和生长)为特征的炎性疾病有关，例如，如组织移植排斥、内毒素性休克和肾小球肾炎。应激活化蛋白激酶(SAPK)是蛋白激酶的一个家族，它代表了信号转导通路的倒数第二步，导致c-jun转录因子的活化和c-jun调节的基因的表达。c-jun尤其与基因的转录有关，该基因对参与DNA修复的蛋白进行编码，该DNA由于基因毒性损伤而被破坏。所以，在细胞中抑制SAPK活性的药物能够阻止DNA修复并使得细胞对导致DNA破坏或抑制DNA合成并诱导细胞凋亡的物质或抑制细胞增殖的物质敏感。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是保守信号转导通路的组成部分，它激活对各种细胞外信号有响应的转录因子、转译因子及其它靶分子。通过促分裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)，在具有Thr-X-Tyr序列的双磷酸化基序上，MAPK被磷酸化作用激活。在高级真核细胞中，MAPK信号的生理学作用与细胞事件有关，例如增殖、瘤形成、发展及分化。因此，通过这些通路(尤其是通过MKK4和MKK6)调节信号转导的能力能够使得与MAPK信号有关的人类疾病(例如炎性疾病、自身免疫性疾病和癌症)的治疗和预防性治疗得到发展。人核糖体S6蛋白激酶家族由至少8种成员组成(RSK1、RSK2、RSK3、RSK4、MSK1、MSK2、p70S6K和p70S6Kb)。核糖体S6蛋白激酶起重要的pleotropic功能，其中之一是在蛋白质生物合成期间mRNA翻译调节中的关键作用(Eur.J.Biochem2000年11月；267(21):6321-30，ExpCellRes.1999年11月25日；253(1):100-9，MolCellEndocrinol.1999年5月25日；151(1-2):65-77)。S6核糖体蛋白被p70S6的磷酸化也已在细胞游动性的调节(Immunol.CellBiol.2000年8日；78(4):447-51)和细胞生长(Prog.NucleicAcidRes.Mol.Biol.，2000;65:101-27)中有牵连，因此可以在肿瘤转移、免疫应答和組织修复以及其它疾病状态中有重要意义。SAPK's(也称为"jimN-末端激酶"或"JNK，s")是代表导致c-jun转录因子活化和受c-jun调节的基因的表达的信号转导途径中倒数第二步的蛋白激酶家族。确切而言，c-jun参与基因的转录，该基因编码参与因遗传毒性受损的DNA的修复的蛋白质。抑制细胞中SAPK活性的物质可防止DNA修复，使细胞对那些通过诱导DNA损伤发挥作用的癌症治疗模式敏感。BTK在自身免疫和/或炎性疾病中起作用，例如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、多发性血管炎(multiplevasculitides)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、重症肌无力和哮喘。由于BTK在B-细胞活化中的作用，所以BTK抑制剂可用作B-细胞介导的致病活性(如自身抗体产生)的抑制剂，并用于治疗B-细胞淋巴瘤和白血病。CHK2为丝氨^/苏氨酸蛋白激酶的关卡激酶家族的一员，参与了DNA损坏的监督机制，例如环境致突变原和内在的活性氧簇所导致的损坏。因此，它可以作为肿瘤抑制物和癌症治疗的靶物质。CSK影响了癌症细胞的转移能力，特别是结肠癌。Fes为非-受体蛋白酪氨酸激酶，它与各种细胞因子信号传导通路以及骨髓细胞的分化有关。Fes也是粒细胞分化机制的关键成分。Flt3受体酪氨酸激酶的活性与白血病和骨髓增生异常综合征有关。约25%的AML白血病细胞在细胞的表面上表达自磷酸化(p)FLT3酪氨酸激酶的组成性活性形式。p-FLT3的活性4吏得白血病细胞能够生长和存活。急性白血病患者(其白血病细胞表达p-FLT3激酶活性)具有较差的总体临床效果。p-FLT3激酶活性的抑制诱导了白血病细胞的细胞凋亡(编程性细胞死亡)。IKKa和IKKP的抑制剂(l和2)用于治疗下列疾病类风湿性关节炎、移植排斥反应、炎性肠病、骨关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、动脉粥样硬化、银屑病、多发性硬化症、中风、系统性红斑狼疮、阿尔茨海默病、脑缺血、外伤性脑损伤、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、蛛网膜下出血或其它与脑内和中枢神经系统内炎症介质的过量产生有关的疾病或紊乱。Met与主要的人类癌症的大多数类型有关，其表达通常与较差的预后和转移有关。Met抑制剂用于治疗包括癌症的疾病，例如肺癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、结肠癌、乳癌、妇科肿瘤(如子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌或外阴癌)、霍奇金病、食道癌症、小肠癌、内分泌系统癌症(例如曱状腺癌、甲状旁腺或肾上腺癌)、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌症、慢性或急性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌症(例如肾细胞癌、肾盂癌)、儿科恶性肺瘤、中枢神经系统瘤(例如原发性CNS淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤)、血癌(例如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病等)、Barrett食管(癌前综合征)、赘生性皮肤疾病、银屑病、萆样霉菌病(mycosesfungoides)和良性前列腺月巴大、糖尿病相关的疾病(例如糖尿病性视网膜病、视网膜缺血和视网膜新血管化)、肝硬化、心血管疾病(例如动脉粥样》更化)、免疫性疾病(例如自身免疫性疾病)和肾脏疾病。优选疾病为癌症(例如急性骨髓性白血病)和结肠直肠癌。Nima-相关的激酶2(Nek2)为细胞循环调节的蛋白激酶，当位于细胞中心体的有丝分裂开始时它具有最大活性。功能研究表明Nek2调节细胞中心体的分离和纺锤体的形成。在衍生自一系列人类肿瘤(包括子宫颈、卵巢、前列腺肿瘤，尤其是乳房肿瘤)的细胞系中，Nek2蛋白提高了2-5倍。p70S6K介导的疾病或病症包括但不限于增殖性疾病，例如癌症和结节性硬化症。根据前述，本发明还提供了在需要这类治疗的受治疗者中预防或治疗上面所述的任何疾病或紊乱的方法，该方法包括对所述受治疗者给予治疗有效量的式I化合物或其可药用盐(见"给药和药物组合物")。对于任何一种上述用途，所需剂量根据给药方式、所治疗的具体病症和预期效果而变化。给药和药物组合物一般而言，可以采用任何本领域众所周知的常用和可接受的给药方式(单独或与一种或多种治疗药组合)来施用治疗有效量的本发明化合物。治疗有效量可根据疾病的严重性、受治疗者的年龄和相关健康状况、所用化合物的效力和其它因素而有较大改变。一般而言，以约0.03至2.5mg/kg体重的日剂量全身施用可获得满意的结果。较大型哺乳动物(例如人类)的指示日剂量范围为约0.5mg至约100mg，方便地以例如一天至多四次的分开剂量或以緩释的形式施用。适于口服给药的单位剂量形式包含约lmg至50mg活4生成分。本发明的化合物可以作为药物组合物通过任何常规的途径来给药，具体而言，经肠内给药，例如口服(如以片剂或胶嚢形式)；或胃肠道外给药，例如以注射用溶液或混悬液的形式；局部给药，例如以洗液、凝胶、软膏或乳膏剂的形式，或以经鼻施用或栓剂的形式。包含游离形式或可药用盐形式的本发明化合物与至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可用常规的方式通过混合、制粒或包衣的方法进行制备。例如，口服组合物可以是片剂或明胶胶嚢，包含活性成分与a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁或钙和/或聚乙二醇；对于片剂还包含c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧曱基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果期望的话，还包含d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或泡腾合剂；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。注射用組合物可以是水性等张溶液或混悬液，栓剂可以由含脂肪的乳剂或混悬剂来制备。该组合物可以是无菌的和/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或緩冲剂。此外，它们还可含有其它有治疗价值的物质。适于透皮应用的制剂包含有效量的本发明化合物和载体。载体包含可吸收的药理学可接受的溶剂以帮助穿过宿主皮肤。例如，透皮装置是包含背衬膜、储库和确保装置在皮肤上的手段的绷带剂形式，其中储库含有化合物，任选含有载体，任选有控速屏障以在延长时间内向宿主皮肤以控制和可预定的速率传送化合物。还可以使用基质透皮制剂。适于局部应用、例如用于皮肤和眼的制剂优选是本领域众所周知的水性溶液、软膏、乳膏剂或凝胶。这些制剂可含有助溶剂、稳定剂、张力增强剂、緩沖剂和防腐剂。本发明的化合物可以以治疗有效量与一种或多种治疗剂组合(药物组合物)施用。例如，与其它免疫调节或抗炎物质组合可产生协同作用，例如当与以下药物组合时环孢霉素、雷帕霉素或子嚢霉素，或其免疫抑制类似物，例如环孢素A(CsA)、环孢素G、FK-506、雷帕霉素或相当的化合物、皮质类固醇、环磷酰胺、咪唑嘌呤、甲氨蝶呤、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、麦考酚酸、麦考酚酸吗乙酯、15-脱氧精胍菌素，免疫抑制抗体、尤其是白细胞受体的单克隆抗体，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或它们的配体，或其它免疫调节化合物，例如CTLA41g。当本发明的化合物与其它疗法组合施用时，共同给药的化合物的剂量自然要取决于所共用药物的类型、所用具体药物以及所治疗病症等而变化。本发明还提供了药物组合，例如药盒，包含a)第一种药物，它是如本文所公开的游离形式或可药用盐形式的本发明化合物，和b)至少一种共用药物。该药盒可以包含其施用说明书。如本文所用的术语"共同施用，，或"组合施用，，等意欲嚢括对单独患者施用所选择的治疗药物，并且意欲包括其中药物不一定以同一施用途径或在同一时间施用的治疗方案。如本文所用的术语"药物组合，，指将多于一种活性成分混合或合并所得的产品，包括活性成分的固定和非固定组合。术语"固定组合"指活性成分，例如式I化合物和共用药物，以单一实体或剂量同时施用于患者。术语"非固定组合，，指活性成分，例如式I化合物和共用药物，以单独的实体同时、共同或无特定时间限制地依次施用于患者，其中这种施用为患者体内提供了两种化合物的治疗有效水平。后者还用于鸡尾酒疗法，例如给予3种或3种以上的活性成分。制备本发明化合物的方法
技术领域：
：本发明还包括本发明化合物的制备方法。在所述反应中，有必要保护在终产物中期望存在的官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、硫代或羧基，从而避免它们不被期望地参与反应。常规的保护基团可以按照标准惯例来使用，例如参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts的"有机化学中的保护基团"(尸wte"/veG>o"/w/mC^g"w/cC^e附is^j，约翰.威利公司(JohnWileyandSons),1991)。其中X2为NH或NCH3的式I化合物可以通过如下反应流程I来制备反应流程I<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(2)其中n、m、XpY、！^和R2如发明概述中所定义。式I化合物可以通过使式2化合物与式3化合物在适宜溶剂(例如正丁醇等)、适宜酸(例如浓盐酸等)的存在下反应来合成。该反应在约80°C至约180°C的温度下进行，并且可以进行一直到约1小时以完成反应(基于微波照射；常规的加热将具有适宜的温度范围和时间，并且是本领域已知的)。合成式I化合物的详细实例可以在下文实施例中找到。制造本发明化合物的其它方法
技术领域：
：本发明化合物的可药用酸加成盐可以通过使化合物的游离碱形式与可药用的无机或有机酸反应来制备。或者，本发明化合物的可药用碱加成盐可以通过使化合物的游离酸形式与可药用的无机或有机碱反应来制备。或者，本发明化合物的盐形式可以使用起始原料或中间体的盐来制备。本发明化合物的游离酸或游离碱形式可以分别由相应的碱加成盐或酸加成盐来制备。例如酸加成盐形式的本发明化合物可以通过用适宜的碱(如氢氧化铵溶液、氢氧化钠等等)处理转化成相应的游离碱。碱加成盐形式的本发明化合物可以通过用适宜的酸(如盐酸等)处理转化成相应的游离酸。未氧化形式的本发明化合物可以由本发明化合物的N-氧化物在0。C至80。C下在适宜惰性有机溶剂(如乙腈、乙醇、二哺烷水溶液等)中通过用还原剂(如》克、二氧化-琉、三苯膦、硼氢化锂、硼氬化钠、三氯化磷、三溴化磷等等)处理来制备。本发明化合物的前药衍生物可以通过本领域普通技术人员已知的方法来制备(如，进一步的细节参见Saulnier等人，(1994)，祝^rg朋,cflm/AfeWdwa/C7^附/"o^e故rs，第4巻，第1985页)。例如，适当的前药可以通过使非衍生化的本发明化合物与适宜的氨曱酰化剂(如l，l-酰氧基烷基羰基氯(carbanochloridate)、对硝基苯基碳酸酯等)反应来制备。方法来制备。可用于建立保护基团以及除去它们的技术的详细描述可参见T.W.Greene的《有机化学中的保护基》("尸/vte"/"g/wC7ie附ZW/y，，第三版，约翰.威利公司(JohnWileyandSons,Inc.),1999)。(如水合物)。本发明化合物的水合物可通过采用有机溶剂如二氧芑、四氢呋喃或甲醇在水/有机溶剂混合物中重结晶来方便地制备。还可如下制备本发明化合物的单一立体异构体使化合物的外消旋混合物与旋光活性的拆分试剂反应，形成一对非对映异构化合物，分离非对映异构体并回收旋光纯的对映异构体。当对映异构体的拆分可采用本发明化合物的共价非对映异构衍生物进行时，优选可解离的复合物(如非对映异构的盐结晶)。非对映异构体具有不同的物理性质(如熔点、沸点、溶解性、反应活性等)，可以利用这些不同点来容易地加以分离。非对映异构体可以通过色语法来分离，或优选通过基于溶解性差异的分离/拆分技术来分离。分试剂。可用于从化合物的外消旋混合物中拆分其立体异构体的技术在JeanJacques、AndreCollet和SamuelH.Wilen的《对映异构体、夕卜消4t物和拆分》("￡>i/iftV7wera,及ace附atesffwt/ieso/MftV/is"，约翰.威利公司(JohnWileyandSons,Inc.),1981)中有更详细的描述。总的来说，式I化合物可以通过涉及以下步骤的方法来制备(a)反应流程图I的步骤；及(b)任选将本发明的化合物转化为可药用盐；(c)任选将本发明化合物的盐形式转化为非盐形式；(d)任选将本发明化合物的非氧化形式转化为可药用的N-氧化物；(e)任选将本发明化合物的N-氧化物形式转化为其非氧化形式。(f)任选从异构体混合物中拆分出本发明化合物的单一异构体；(g)任选将非衍生化的本发明化合物转化为可药用的前药衍生物；和(h)任选将本发明化合物的前药衍生物转化为其非衍生化形式。关于起始原料的生产没有具体描述，这些化合物是已知的，或者可类似于本领域公知的方法或在下文实施例中公开的方法来制备。本领域技术人员可以理解上述转化仅仅是本发明化合物的制备方法的代表性方法，也可类似地使用其它熟知的方法。实施例本发明还通过下列阐述本发明的式I化合物的制备的实施例进一步被举例，但不局限于此。通用考虑化合物的纯度通过具有UV检测器(k=255nm，参比在360mn)和API-ES电离源的反相液相色谱-质镨光谱仪(安捷伦(Agilent)系列IIOOLC-MS)来评估。LC洗脱方法(釆用Betabasic-18柱)历经3分钟，由10%至90%乙腈水溶液的线性梯度，流速lml/min。釆用具有Ultra1205jimC18Q柱的Waters2487系列以如下线性梯度通过高压液相色i普法纯化化合物7.5分钟由在溶剂B(含有0.05%三氟乙酸的水)中的10%溶剂A(含有0.035%三氟乙酸的乙腈)至卯％A,然后用卯％A洗脱2.5分钟。NMR光谱在Bruker-400MHz仪器上记录，并采用剩余的未氘化溶剂作为内标进行定标。使用以下缩写来表峰裂数s=单峰，d=双峰，,=三重峰，《=四重峰，附=多重峰，A=宽峰，W=双峰-双峰。微波照射反应在来自PersonalChemistry的EmrysOptimizer上进行。所用的试剂等级化学品和溶剂购自奥尔德里奇(Aldrich)化学公司。实施例1环丙烷甲酸{3-6-(3-三氟曱基-苯基氨基)-嗜啶-4-基氨基1-苯基卜酰胺<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>通过在乙醇中回流使4，6-二氯嘧啶用3-三氟甲基苯胺进行单取代。采用微波照射来用环丙烷甲酸(3-氨基-苯基)-酰胺取代6-氯，其中环丙烷甲酸(3-氨基-苯基)-酰胺本身由3-硝基苯胺分两步制得。类似地合成另外的4,6-二苯胺基嘧啶。4，6-二苯胺基嘧咬衍生物的合成方法和表征可以如下获得(6-氯-嘧啶-4-基W3-三氟曱基-苯基)-胺:将4，6-二氯嘧啶(卯0mg,6mmo1)、3-三氟甲基苯胺(742jU，6mmol)和AyV-二异丙基乙基胺(DIEA)(1.26ml，7.2mmol)在乙醇(5ml)中混合。将所得均质溶液于80°C加热12小时，然后LC-MS分析显示完全转化为产物。真空除去溶剂，将所得粘稠的油用水(2x5ml)洗涤，并用二氯曱烷(5ml)萃取。用无水Na2S04处理后，真空除去二氯甲烷，得到褐色固体CuHsClF3N3LC-MS保留时间2.511分钟。准确质量274.04。实测值MSm/z275.0(M+l)。7V-(3-硝基苯基)环丙烷甲酰胺:将3-硝基苯胺(6卯mg，5mmo1)、环丙烷羰基氯(504nl，5.5mmol)和碳酸钾(760mg，5.5mmoI)在二氯甲烷(5ml)中合并。将反应混合物于室温搅拌2小时，然后TLC(1:1，WvEtOAc-己烷)和LC-MS显示反应完全。通过添加水(5ml)将产物从反应混合物中沉淀出，然后将水用二氯甲烷(2x5ml)萃取。将所合并的有机萃取液用饱和氯化钠水溶液洗涤，然后采用无水MgS04干燥。真空除去二氯甲烷，得到黄色粉末d。HmN203LC-MS保留时间1.868分钟。准确质量206.07。实测值MSm/z207.1(M+l)。7V-(3-氨基苯基V环丙烷-甲酰胺:将A43-硝基苯基)环丙烷甲酰胺(l.lg，5mmol)溶于添加有10。/。披钯炭(50mg，5mol。/。)的乙醇(5ml)中。将反应物用N2净化，然后充入H2并于室温和在H2球压力下搅拌12小时。滤除催化剂。将滤液真空除去，得到所需产物C1()H12N20LC-MS保留时间1.611分钟。准确质量176.09。实测值MSm/z177.1(M+l)。环丙烷曱酸{3-6-(3-三氟曱基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基l-苯基V酰胺(1):将6-氯-嘧咬-4-基)-(3-三氟甲基-苯基)-胺(50mg，0.18mmo1)、7V-(3-氨基苯基)-环丙烷甲酰胺(64.4mg，0.36mmo1)、浓HC1(30jU，0.36mmol)和正丁醇(2ml)在微波反应容器中合并。将混合物采用微波照射于160。C加热10分钟。LC-MS分析显示完全转化为产物。真空除去溶剂，将产物溶于DMSO中，经制备型-质量触发(masstriggered)LC-MS纯化，得到所需产物C21H18F3NsOLC-MS保留时间:1.943分钟。确切时间413.15。实测值MS一414.2(M+l)。醒R(DMSO母.810,23(s，IH)，9.71(s，IH)，9.46(s，IH)，8.38(y，1H)，8.08(附，1H)，7.81(附，2H)，7.53"1H，/=8Hz)，7.32(</，1H，/=8Hz)，7.24(附，3H)，6.19(s，1H)，l'73(附，1H)，0.79(附，4H)。重复以上实施例中所描述的操作，使用合适的起始原料，获得如表1中所确定的下列式I化合物。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>5tSd艾HV，HNMR(CE>C13):S8.100，m)，7.63(s，1H),7.48(j，1H)，7.18^7.04(/n,5H)，7.02(g，1H)，6.81(,"，1H)，2,，，3H)，l-14(w，1H)，1,01(/w，2H)，t),82(w，2H;'MSw/z360.2(M+l).6)HNMR(DMSO-卿S10.23(5，1H),9.63(6，1H),9.32(6，1H)，8,29(>，1H)，7.78(w,1H)，7.62(W，1H，J产8Hz，.6Hz)，7.57讽1H，/尸8Hz，/产1.6Hz)，7.38(w，1H)，7，26(m,2H)，7,20(m，'1H)，6,01(s，1H)，1,80(m,1H),0.79(/n,4H).MSw/z(M+l).7F3C^^^^>1^\~7"3HV，HNMR(CDC13):Sl'l辟，1H)，8.08(s，1H)，7,56(j，1H)，7,50(m，3H)，7.38("!，2H)，7.1l(m，2H)，6.77(rf，1H，/=6.8Hz),5.83(6,1H)，3.44(s，3H)，1.44(m'1H)，0,97(w，2H),0.80(m，2H).MSm/2428,2(M+l).8^NMR(DMSO-兆)510.21(s，1H)，9.66(j，1H)，8.35(y，1H)，7.89(s，1H)，7.72~7,62(m，3H),7.55—7.53(rf，1H，/-8Hz)，7.33~7，3K"《1H，力-6.8取J产2Hz),7,24(m，2H)，6.26(j，1H),1.80(/w,1H)，0.78(m,4H).MSm/z415.1(M+l).<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>分析对本发明的化合物进行分析，以测定它们抑制Lck、IR、IGF-1R、JNKla、Flt3、Fes、EFGR(Her-1、erbB-l)、cSRC、CDKl/细胞周期蛋白B、c画RAF、BTK、Bmx、Axl、Aurora-A、Abl、BCR-Abl、TrkB、Tie2、Syk、SGK、SAPK2a、Rskl和Met激酶的能力。EGFR(酶测定法)利用纯化EGFR(阿普斯特公司(Upstate))进行激酶活性测定，最终体积为10fiL，其中含有在激酶緩冲溶液(30mMTris-HClpH7.5，15mMMgCl2，4.5mMMnCl2，15nMNa3V04和50fig/mLBSA)中的0.25ng/mL酶和底物(5ftg/mL生物素-聚-EY(Glu，Tyr)(CIS-US公司)和3nMATP)含有。制备两种溶液将5nL第一种溶液(含有在激酶緩沖液中的EGFR酶)首先分配在384-格式ProxiPlate(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))中，然后加入50nL化合物的DMSO溶液，然后向每孔加入5pL第二种溶液，其中含有在激酶緩冲液中的底物(聚-EY)和ATP。将反应物于室温温育1小时，加入10nLHTRF检测混合物终止反应，所述混合物含有30mMTris-HClpH7.5、0.5MKF、50mMETDA、0.2mg/mLBSA、15ng/mL链霉抗生物素-XL665(CIS-US公司)和l50ng/mL穴状化合物缀合的抗-磷酸酪氨酸抗体(CIS-US公司)。于室温温育1小时以允许链霉抗生物素-生物素相互作用后，在AnalystGT(分子装置公司(MolecularDevicesCorp.))上读取时间分辨荧光信号。通过对每种化合物在12种浓度(从50jiM按1:3稀释至0.28nM)下的抑制百分比进行线性回归分析，计算得ICs。值。在本测定法中，本发明化合物的IC5。范围为10nM至2fiM。EGFIU细胞测定法)将增殖性U-20S细胞铺在标准生长培养基10%FBS-DMEM中。24小时后，将细胞用表达野生型EGFR或T766M突变体的构建物转染。转染后24小时时，将细胞转入无血清培养基中达4小时。然后将血清饥饿的细胞用10nM本发明的化合物或lnM吉非替尼(gefitinib)处理(或未处理)60分钟，然后用EGF(16nM)刺激30分钟。然后将细胞用RIPA緩沖液溶解，将溶解物用单克隆抗-EGFR抗体(癌基因公司(Oncogene),Ab-l)和蛋白A陽琼脂糖进行免疫沉淀。将免疫复合物进行电泳移动、印迹和用p-TyrMAb(酶德/>司(Zymed)，PY20)或抗-EGFR抗体(圣克鲁斯公司(SantaCruz)，SC-03)作为探针进行探测，以检测总的和激活的(磷酸化)EGFR。UpstateKinaseProfiler-》文射酶滤膜结合分析评价本发明的化合物抑制激酶名单中单个成员的能力。按这类方案以终浓度为10jiM对化合物进行测试，一式两份。注意，激酶緩沖组合物和底物对于"UpstateKinaseProfiler"名单中所包括的不同激酶是不同的。在水上，将激酶緩沖液(2.5ji1，10x，需要时含有MnCl2)、活性激酶(0.001-0.01单位；2.5pL)、在激酶緩沖液中的特异性或聚(Glu4-Tyr)肽(5画500pM或0.1mg/ml)以及激酶緩冲液(50nM;5jil)在艾本德(eppendorf)管中混合。加入Mg/ATP混合液(10pL;67.5(或33.75)mMMgCl2,450(或225)pMATP和ljaCi/nl[Y-32P-ATP(3000Ci/mmol))，反应物在30。C孵育约10分钟。将反应混合物在2cmx2cmP81(磷酸纤维素，用于带正电荷的肽底物)或Whatman1号(用于聚(G1"-Tyr)肽底物)的正方形纸上点样。用于分析的正方形纸用0.75%磷酸洗涤4次，每次5分钟，并用丙酮冲洗一次(5分钟)。将正方形紙移入闪烁小瓶中，加入5ml闪烁合剂，掺入肽底物的32P(cpm)用Beckman闪烁计数器进行定量。计算每个反应的抑制百分率。游离形式或可药用盐形式的式I化合物显示出有价值的药理性质，例如在本申请中所描迷的体外试验所显示的那样。例如，10jiM浓度的式I化合物优选显示出高于50%、优选高于约70。/。的对抗Lck、IR、IGF-1R、JNKla、Flt3、Fes、EFGR(Her-1、erbB-l)、cSRC、CDKl/细胞周期蛋白B、c-RAF、BTK、Bmx、Axl、Aurora-A、Abl、BCR-Abl、TrkB、Tie2、Syk、SGK、SAPK2a、Rskl和Met激酶的抑制百分比。例如，环丙烷曱酸{3-6"3-三氟曱基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基l-苯基}-酰胺(实施例l)是选择性EGFR抑制剂。在10jiM浓度的实施例1下，就Lck、Flt3、EGFR、Bmx和SAPK2a而言的激酶活性低于50%，并且EGFR激酶活性损失99。/。。应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅仅用于解释说明的目的，它们的各种变通或变化方法将提示给本领域技术人员，并且被包括在本申请的宗旨和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请引入本文作为所有目的的参考。权利要求1.式I化合物，id="icf0001"file="S2006800404475C00011.gif"wi="81"he="20"top="50"left="74"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中n选自1、2和3；m选自1、2和3；X1选自价键、O、NH和N(CH3)；X2选自O和NH；Y选自N和CH；R1选自卤素取代的C1-4烷基、卤素取代的C1-4烷氧基、C1-4烷基、卤代基和C1-4烷氧基；R2选自卤素取代的C1-4烷基、卤素取代的C1-4烷氧基、C1-4烷基、卤代基、C1-4烷氧基和-NHC(O)R3；其中R3是C3-12环烃基；及其可药用的盐、水合物、溶剂化物和异构体。2.权利要求l的化合物，其中n选自1和2;m选白1和2;X,选自价键、O、NH和N(CH;j);X2选自O和NH;Y选自N和CH;Ri选自囟素取代的Cw烷基、Cw烷基、卣代基和Cw烷氧基；R2选自囟素取代的CV4烷基、-NHC(0)R3和烷氧基；其中R3是Cw环烃基。3.权利要求2的化合物，其中R，选自环丙基-羰基-氨基、环己基-羰基-氨基、三氟曱基和甲氧基；且R2选自三氟甲基、甲基、卤代基和甲氧基。4.权利要求1的化合物，选自环丙烷甲酸{3-[6-(3-三氟曱基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基1-苯基}-酰胺；N，N'-双-(3-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4，6-二胺；环丙烷曱酸{2-甲氧基-5-[6-(3-三氟曱基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基卜苯基}-酰胺；环己烷甲酸{2-甲氧基-5-[6-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基1-苯基}-酰胺；环丙烷曱酸[3-(6-邻甲苯基氨基-嘧啶-4-基氨基)-苯基-酰胺；环丙烷甲酸{3-[6-(2-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基卜苯基}-酰胺；环丙烷甲酸(3-{6-[甲基-(3-三氟甲基-苯基)-氨基-嘧啶-4-基氨基}-苯基)-酰胺；环丙烷甲酸{3-[6-(3-三氟甲基-苯氧基)-嘧啶-4-基氨基1-苯基}-酰胺；环丙烷曱酸{2-曱氧基-5-[6-(3-三氟曱基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基1-苯基}-酰胺；环丙烷曱酸{3-[6-(2，5-二甲氧基-苯基)-嘧咬-4-基氨基-苯基}-酰胺；环丙烷曱酸{3-[6-(5-氯-2-甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基氨基-苯基}-酰胺；环丙烷甲酸(3-{曱基-[6-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基1-氨基}-苯基)-酰胺；环丙烷曱酸{3-[2-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧咬-4-基氨基]-苯基}-酰胺；环丙烷甲酸{3-[4-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基卜苯基}-酰胺；4，6-双-(3-三氟甲基-苯氧基)-嘧啶；和N，N'-双-(3-三氟甲基-苯基)-吡啶-2,4-二胺。5.药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1的化合物和可药用的赋形剂。6.治疗动物疾病的方法，其中抑制激酶活性可预防、抑制或改善该疾病的病理和/或症状，该方法包括给所述动物施用治疗有效量的权利要求1的化合物。7.权利要求6的方法，其中的激酶选自Lck、IR、IGF-1R、JNKla、Flt3、Fes、EFGR(Her画l、erbB-l)、cSRC、CDKl/细胞周期蛋白B、c画RAF、BTK、Bmx、Axl、Aurora-A、Abl、BCR-Abl、TrkB、Tie2、Syk、SGK、SAPK2a、Rskl和Met。8.权利要求l的化合物在制备用于治疗动物疾病的药物中的用途，其中激酶Lck、IR、IGF-1R、JNKla、Flt3、Fes、EFGR(Her-l、erbB曙l)、cSRC、CDKl/细胞周期蛋白B、c-RAF、BTK、Bmx、Axl、A訓ra-A、Abl、BCR-Abl、TrkB、Tie2、Syk、SGK、SAPK2a、Rskl和/或Met的活性对该疾病的病理和/或症状起作用。全文摘要本发明提供了二取代的嘧啶或吡啶化合物、包含这类化合物的药物组合物和使用这类化合物来治疗或预防与激酶活性异常或失控有关的疾病或紊乱、特别是涉及Lck、IR、IGF-1R、JNK1α、Flt3、Fes、EFGR(Her-1、erbB-1)、cSRC、CDK1/细胞周期蛋白B、c-RAF、BTK、Bmx、Axl、Aurora-A、Abl、BCR-Abl、TrkB、Tie2、Syk、SGK、SAPK2a、Rsk1和Met激酶异常激活的疾病或紊乱的方法。文档编号C07D213/74GK101300234SQ200680040447公开日2008年11月5日申请日期2006年11月3日优先权日2005年11月3日发明者N·S·格雷,Q·张,Y·刘,强丁,宇野哲郎申请人:Irm责任有限公司