专利名称：一种增强肽段免疫活性的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用多肽合成的方法建立一种多肽结构，即将多拷贝抗原肽片段 与一个VKGFY多肽片段相连。按照这种方式制备而成的多肽分子具有提高机体免 疫系统对抗原肽片段的免疫反应。可作为免疫制剂用于对疾病的预防和对疾病的 生物(免疫)治疗，本发明属于生物医药领域。
背景技术：
生物体的遗传基因被存储在多聚核苷酸链上，遗传基因编码着执行生物学功 能的蛋白质。生物体内的蛋白质多种多样，它们行使着各种生物学功能维持生命 活动。蛋白质的种类虽然多不胜举，但它们都是由20个自然界存在的天然氨基 酸组成。由于氨基酸的组成和排列顺序的差异导致了蛋白质的千差万别。 一般来 说，含有50个以上氨基酸的分子被称为蛋白质，50个以下的被称为短肽。目前 发现最小的功能小肽是只含有3个氨基酸的3肽物质"促甲状腺素释放激素" (TRH)。
由于人类基因组计划的完成和人类蛋白组计划的开展，将会有越来越多的蛋 白质功能片段被发现并被作为药物应用到生物医药领域中来。现己开发并在临床 上得到应用的多肽药物有"催产素"、"胸腺肽ci 1"、"胸腺五肽"等，有在天 然肽链的基础上进行人工改构制备成为用于治疗消化道出血和肢端肥大症的多 肽药物"奥曲肽"等。蛋白质中的功能片段常常能筛选到含有几十个或小到只有 三个氨基酸组成的多肽片段，它们为人工合成蛋白质功能片段并将它们投入应用 奠定了基础。
按照人为的预先设计将具备特定生物学功能的短肽连接在一起，经过人为加 工改造而产生的多功能多肽片段达到预期的目的。这是继"基因工程"后时代拓展而出的又一项生物技术——"多肽工程"。"多肽工程"在应用领域中具备如下 的优势-
1. 多肽产物可企业话大规模地合成，产量高，纯度高。
2. 多肽药物的用量小，生物活性高，毒性低。
3. 生产多肽药物的企业占地小，设备简单，设备周转利用率高，企业属低能耗， 低排放、低污染的绿色环保型企业。
多肽制药是一个新兴的制药领域，随着人类基因组计划的完成和"多肽工 程"的深入发展，必将会有更多的多肽药物面市。
发明内容
人体的免疫器官主要有胸腺、骨髓、脾脏、淋巴结等。脾脏是人体最大的伊 疫器官，T淋巴细胞和B淋巴细胞都在脾脏内部发育成熟，如果脾脏被摘除会导 致机体的体液免疫和细胞免疫功能的紊乱，发生暴发性感染。
美国Tufts大学教授Najjara于1970年发现一种脾脏来源的四肽物质TKPR 具有显著的抗肿瘤、抗病毒的活性并被命名为Tuftsin,中文名为"促吞噬素"。 实验证实Tuftsin能使脾内脾小体增多，生发中心生长活跃。Tuftsin能够提高粒 细胞，单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞的趋化、游离、吞噬活性，提高免疫细胞 分泌细胞因子IL-1、IL-2、TNF- a 、IFN- y 、INF- e等，提高T淋巴细胞的TH1/Th2 平衡向TH1方向偏移，提高细胞毒的作用，增强机体淋巴系统的细胞免疫活性。
Tuftsin对肺癌、肝癌、胃癌、黑色素细胞瘤、胆管癌等多种恶性肿瘤具有较 明显的治疗效果。Tuftsin抗肿瘤的机制主要与它既能促进粒细胞和单核巨噬细胞 的游走、吞噬、抗原递呈和细胞毒功能外，又能增加白细胞的数目并刺激提高T 淋巴细胞的功能有关。Tuftsin作为一个参与免疫调节的体液因子具有显著的抗肿 瘤、抗感染和抗病毒的生物学活性。据报道国外已开始将Tuftsin用于对晚期恶 性肿瘤和AIDS的治疗。机体内的专职抗原递呈细胞，包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细 胞等都是从同一个始祖细胞分化发育而来，它们具有对外来抗原的胞饮吞噬，抗 原加工和递呈的功能。Tuftsin本身是一个仅含有4个氨基酸TKPR的小肽(4 肽)，无抗原性，它可以特异性的结合抗原递呈细胞表面的受体，促进细胞的吞 噬，抗原加工和递呈。已经发现以Tuftsin作为抗原肽载体共价连接人工合成的 抗原小肽能够增强机体对无抗原性，或抗原性很低的小肽的免疫反应，提高抗体 滴度和体内细胞因子N0、 TNF、 IL-1、 IL-2、 IFN-y的分泌水平，能够诱导T 淋巴细胞的扩增，激发CD4， Thl类型的免疫反应。因此Tuftsin不仅具有激发 T淋巴细胞的细胞毒作用，同时还有激发B淋巴细胞的体液免疫的活性。
以Tuftsin的功能为模板，经过筛选寻找到VKGFY是一个具有较强生物活性 的5肽分子。将多拷贝抗原肽片段以(抗原肽片段-Xn) 2-K-Xn-VKGFY，(抗原 肽片段-Xn) 4— (K-Xn) 2-K-Xn-VKGFY，或(抗原肽片段-Xn) 8— (K-Xn) 4— (K-Xn) 2-K-Xn-VKGFY的形式与一个VKGFY多肽片段连接，形成的产物优点为借助在C 端VKGFY的帮助把与之相连的多拷贝抗原肽片段带进抗原递呈细胞，通过在细胞 内的加工和递呈将抗原信息传递给淋巴细胞。增强抗原肽片段的抗原性，提升抗 体滴度，提高细胞免疫因子的分泌水平，提高T淋巴细胞和B淋巴细胞对抗原肽 片段产生的免疫反应。
按照本发明阐述的制备方式，合成产生的免疫制剂能够提高机体针对抗原 肽片段产生的免疫反应。合成产物可以作为药物或多肽疫苗应用在疾病预防或疾 病的生物(免疫)治疗。
具体设计方式
多肽合成常用的方法为固相合成法，多肽合成的原理是根据氨基酸两端的氨 基和羧基之间的缩合反应形成酰胺键(肽键)连接延长肽链。首先将多肽片段的 羧基端氨基酸的羧基与固相树脂共价相连，合成的顺序是从肽段的羧基端(c-端)向氨基端(N-端)方向延长，多肽合成完成后再将合成的多肽产物从固相树 脂由于一个赖氨酸(K)有两个氨基可供縮合联接氨基酸并延长肽链。所以在赖 氨酸的2个氨基上可以继续往下连接氨基酸或延长肽链形成分支肽，通过赖氨酸 的这个特性可将多拷贝的抗原肽片段并联起来形成如下结构序列的多肽产物
1 一种多肽分子结构，它由多拷贝抗原肽片段和一个VKGFY多肽片段两部分 组成，其中多拷贝并联的抗原肽片段的C端与一个VKGFY片段的N端相连。 抗原肽片段可以是任意一个需要激发机体免疫反应的抗原肽片段。
2 本多肽分子结构可以是由2个拷贝并联的抗原肽片段与一个VKGFY片段连 接组成，其结构为(抗原肽片段-Xn)2-K-Xn-VKGFY,其中n代表由n个天 然氨基酸(X)连接成的肽链，n为自然数，X代表任意L型或D型天然氨 基酸，以下各项多肽结构中的解释与此相同。
3 本多肽分子结构可以是由4个拷贝并联的抗原肽片段与一个VKGFY片段连 接组成，其结构为(抗原肽片段-Xn)4-(K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
4 本多肽分子结构可以是由8个拷贝并联的抗原肽片段与一个VKGFY片段连 接组成，其结构为(抗原肽片段-Xn)8-(K-Xn)4-(K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
5 按照以上权利要求的方式合成的多肽产物可制备成为药物原料或医药制 剂。
6 按照以上权利要求的方式合成的多肽产物可制成多肽疫苗或药品用于对疾 病的预防和对疾病的生物(免疫)治疗。
根据以上设计并通过多肽合成的方式制备而成的合成产物在体内具有显 著提高抗原肽片段的免疫学活性的作用。制备的合成产物可以作为多肽疫苗或药 物对疾病进行预防或治疗。
实施例1
按照(抗原肽片段-Xn)2-K-Xn-VKGFY的设计方式，将2个拷贝并联的癌胚抗 原肽CEA (YLSGADLNL) 9肽的C端与VKGFY片段的N端连接，合成产物为 (YLSGADLNL)2-K-VKGFY。经过分离纯化使得合成产物纯度达到98%以上用于制备 免疫制剂。一.剂型
注射用冻干粉针。规格
lmg/安瓿。
处方组成
原辅料 用量
制备工艺-
溶液配制:
合成产物lg
甘露醇50g
磷酸二氢钠(NaH2P04-2H20)0. 796g
磷酸氢二钠(Na2HP(V 12H20)1. 755g
注射用水加至1000ml
共制成1000瓶
在100级无菌室内操作。
磷酸缓冲液的配制
① 0.2mol/L NaH2P04:准确称取磷酸二氢钠(Na跳.2柳17.8g，加注射 用水溶解并定溶至500ml，摇匀，备用；
② 0. 2mol/L Na2HP04:准确称取磷酸氢二钠(Na2HP04.12H20 ) 35. 82g，加注 射用水溶解并定溶至500ml，摇匀，备用；
③ 10鹏ol/L磷酸缓冲液(p服.8 ):取51ml 0. 2mol/L NaH2P04溶液、 49ml0. 2mol/L化2冊04溶液混匀，并定溶至2000ml ，用磷酸调pH值至6. 8备用。
药液配制-
按照配方准确称取处方量的甘露醇和合成产物，用10ramol/L磷酸缓冲液 (pH6.8)溶解并定溶至lOOOtnl。准确称取配制液体积0. 2% (W/V)的活性碳，
加入上述溶液中，搅拌15分钟；取上述溶液粗滤两遍脱炭，再用0.2口m微孔滤膜进行正压无菌过滤，4'游放备用。 分装与冷冻
在无菌室内操作；取上述精滤液测定含量，调整装量，取lml分装于3ml 药用安瓿瓶中；制品2(TCX冷冻干燥机，预冻3小时使制品温度至-40'C(板温预
先冷至-20°0，保温1小时，制冷冷凝器温度至-55'G开启真空泵，使干燥箱内
真空度达到8.0xl(T2mBar左右，对板层加热升温，每小时升温5°G 6小时后板
温至-10Tg定，品温随板温约每小时升温3°C真空度维持在6.0x10—2mBar左右，
约干燥8小时，品温至共熔点-15T2E右，制品水层消失；而后对板层继续加热升
温，速率为每小时5°C 7小时后板温至25°C品温约经14小时至25°C保温3
小时，干燥箱极限真空度为6.0x10—2mBar左右；停机，将安瓿封口即得。
工艺验证
按照处方制备工艺，制备三批注射用冻干粉针，考察成品的合格率需大于
90%。随机抽样检测成品的理化性质、有关物质、含量、热源、细菌的含量。
要求不同批次的制剂含量与标示量基本一致，有关物质在制备前后无明显变 化，无菌、无热源、血管刺激性、溶血性及过敏性试验均为阴性。
原辅料的来源及质量规格:_
原辅料 质量规格 来源 用途
合成产物 符合暂定标准 自制 主药
甘露醇 CP. 2000 89页 北京制药厂 支撑剂
磷酸二氢钠 CP. 2000 1058页 苏州中化药品有限公司 缓冲盐
磷酸氢二钠 GB1263-86 苏州中化药品有限公司 缓冲盐
注射用水 CP. 2000 428页 北京制药厂 溶剂
针用活性炭 CP. 2000 465页 北京大力活性炭厂 吸附剂包装规格-储存
成品为白色冻干粉针，lmg/安瓿，10安瓿/盒 2-8'C避光保存，有效期3年。
二.剂型
注射用水针。
规格
lmg/ml/安瓿。
处方组成:
原辅料
用量
合成产物
注射用水加至
共制成
1000瓶
制备工艺
溶液配制在100级无菌室内操作。
精确称量合成产物，取无菌注射用水将其溶解并定溶在1000ml。用0.2ym微孔 滤膜进行正压无菌过滤后取lml分装于3ml药用安瓿瓶中封口。
成品在包装时目测封口是否整齐光滑，做内容物的外观、色泽、澄明度检查。 随机抽査成品的装量、含量、有关物质，细菌、热源的检査需达到质检标 准。局部刺激试验、溶血性及过敏性试验均需为阴性。
包装规格 lmg/ml/安瓿，10支安瓿/盒。 保存方式 4'C避光保存，有效期1年。
使用方式 取lmg/安瓿用注射用水溶解内容物，做皮下注射。每周1次，连 续6次一个疗程。 制备和使用方法可做适当变通而不必拘泥于此。
实施例2
合成产物可用于对病人外周血中分离提取的免疫细胞进行刺激，病人自身的 免疫细胞经过刺激能够提高识别和杀伤外来致病体或肿瘤细胞的能力，加强病人 抵抗疾病的能力。树突状细胞(Dendritic Cell,縮写DC)是唯一能够触发静息T淋巴细胞 并启动初始免疫反应的抗原提呈细胞(APC)。将分离培养的DC经过与合成产物 的共同孵育，将经过合成产物负载或冲击的DC细胞重新回输到肿瘤患者体内， 回输的DC能够提高机体对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。 1采集患者外周血细胞20ml，加入肝素20u/ml。 2用RPMI 1640培养液对血液进行对半稀释，混匀。
3在50ml离心管内加入10ml Ficoll淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，在其 上缓慢加入20ml血液稀释液。在4。C， 2000 rpm ， 20分钟离心分离外周单 核细胞(PBMCs)
4小心吸出层内的PBMCs，用5X体积的PBS洗涤细胞2次，再用RPMI 1640
培养液洗涤一次。洗涤条件为4 °C， 1500 rpm ， 5分钟。 5用无血清RPMI 1640培养液调整细胞浓度在2x107ml (用0. 2%台盘蓝进行活
细胞计数)然后种植在12孔板，2xl07孔，或种植在25ml塑料培养瓶内，
置37 °C ， 5% C02培养箱中孵育2小时。 6吸出未贴壁的细胞，用温的RPMI 1640培养液洗涤2次。而贴壁细胞体积小，
多为圆形。
7加入含有粒细胞集落刺激因子(rhGM-CSF ) 1000 U/ml (杭州九源公司， P印rotech公司)，白介素-4(rhlL-4 ) 1000U/ml (P印rotech公司)，20%FCC 的RPMI 1640完全培养液中连续培养6天，每3天换一次培养液。在倒置显 微镜下培养3天的细胞可见体积变大，有大突起。培养7天可见细胞已形成 毛刺状突起，第9天细胞突起变细，变为典型的DC细胞。
8免疫冲击刺激向细胞培养液中加入合成的多肽产物10ug/lxl(fcells/ml， 继续孵育24-48小时。
9收获细胞。
10回输给患者，回输的DCs细胞量在lxl06-l(f之间，治疗方式为1-3月1次。 经过合成产物负载或冲击处理过的患者自体DC细胞具有加快细胞增殖，提 高DC细胞特异性捕捉和杀伤肿瘤细胞的能力，具有提高患者对肿瘤细胞的免疫 抵抗能力。
以上方式仅供参考而不必拘泥于此。
权利要求
1.一种多肽分子结构，它由多拷贝抗原肽片段和一个VKGFY多肽片段两部分组成，其中多拷贝并联的抗原肽片段的C端与一个VKGFY多肽片段的N端相连。抗原肽片段可以是任意一个需要激发机体免疫反应的抗原肽片段。
2. 本多肽分子结构可以是由2个拷贝并联的抗原肽片段并联与一个VKGFY 片段连接组成，其结构为(抗原肽片段-Xn)2-K-Xn-VKGFY，其中n代表 由n个天然氨基酸(X)连接成的肽链，n为自然数，X代表任意L型或D 型天然氨基酸，以下各项多肽结构中的解释与此相同。
3. 本多肽分子结构可以是由4个拷贝并联的抗原肽片段与一个VKGFY片段连 接组成，其结构为(抗原肽片段-Xn)厂(K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
4. 本多肽分子结构可以是由8个拷贝并联的抗原肽片段与一个VKGFY片段连 接组成，其结构为(抗原肽片段-Xn)s-(K-Xn)f (K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
5. 按照以上权利要求的方式合成的多肽产物可制备成为药物原料或医药制 剂。
6. 按照以上权利要求的方式合成的多肽产物可制成多肽疫苗或药品用于对疾病的预防和对疾病的生物(免疫)治疗。
全文摘要
本发明的名称为一种增强肽段免疫活性的制备方法和用途，涉及应用多肽合成的方法建立一种多肽分子结构方式，将一种含有多拷贝并联的抗原肽分子的C端与一个VKGFY多肽片段的N端相连的结构产物。本方式制备的产物具有提高机体免疫系统对抗原肽片段的免疫反应的特点，按照此方式制备的合成产物可用于对疾病的预防和疾病的生物(免疫)治疗。
文档编号C07K14/005GK101307098SQ200710099348
公开日2008年11月19日 申请日期2007年5月17日 优先权日2007年5月17日
发明者苏 韩 申请人:北京中天康泰生物科技有限公司