专利名称：血竭素酶联免疫检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小分子物质抗体及其制备方法与应用，特别是涉及血竭素抗体及其制
备方法与应用。
背景技术：
血竭素系常用中药血竭的主要有效成分之一，血竭系由麒麟竭树的果实鳞片所分 泌的一种红色树脂，经加工而成。血竭素对金黄色葡萄球菌、包皮垢分歧杆菌和白色念珠菌 均有抗菌活性。中医用于跌打损伤，瘀血作痛，产后瘀阻等。由于目前市场上所售的血竭质 量参差不齐，有的混入其他树脂，所以急需发展一种能够快速有效的检测血竭质量的方法。 目前常用的方法为紫外分光光度测定法和薄层层析法。由于酶联免疫测定技术具有高通 量、快速及灵敏度高等特点，在中药材的品质鉴定等方面已经获得了广泛的应用，但血竭素 的免疫检测方法还未见报道，所以建立一种血竭素的免疫检测方法具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供血竭素抗体及其制备方法与应用。 本发明所提供的血竭素抗体，是用血竭素抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血 清中分离得到的；所述血竭素抗原按如下过程制备先将血竭素溶解在甲醇中，然后加入 适量的对氨基苯甲酰肼，TLC跟踪血竭素反应完全，生成化合物l，然后将化合物1重氮化后 与载体蛋白连接，得到血竭素抗原。 制备血竭素抗体的方法，是用血竭素抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清中 分离得到血竭素抗体，其特征在于所述血竭素抗原按如下过程制备所述血竭素抗原按 如下过程制备先将血竭素溶解在甲醇中，然后加入适量的对氨基苯甲酰肼，TLC跟踪血竭 素反应完全，生成化合物l，然后将化合物1重氮化后与载体蛋白连接，得到血竭素抗原。
为了使效果更好，载体蛋白需先在0-l(TC条件下溶解于pH9-10的碳酸盐缓冲液 中，常用的载体蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、兰素蛋白(KLH)、卵清白 蛋白(OVA)等。 血竭素抗原制备反应结束后，通常需要经过透析或过s印hadex G_25柱以除去未
联结的血竭素及有机溶剂，然后冷冻干燥以浓縮制备得到血竭素抗原。 应用所制备的血竭素抗原对实验动物经过基础免疫和加强免疫后，取样测定效
价，当效价达到要求时，可以开始采血，分离出抗血清，即可以得到血竭素抗体。 本发明的另一个目的是提供血竭素抗体在鉴定中药材血竭真伪上的应用。 在应用血竭素抗体进行鉴定中药材血竭真伪时，其鉴定过程包括如下步骤 (1)血竭和待测药材经95%的甲醇提取，提取液经氮气吹干后，加适量样品稀释
液成样品液； (2)应用血竭素抗体采用ELISA方法检测样品液； (3)通过观察孔颜色，鉴别样品的真伪，颜色浅为真品，颜色深为假品。
步骤(2)中的ELISA方法用常规的间接法和直接法，其中，间接法可以按如下步骤 进行操作 (1)用血竭素包被抗原包被酶联板； (2)向酶联板上同时加入血竭素样品、血竭素抗体，反应过后加入酶标二抗进行反应；
(3)加入0PD-H2(^溶液底物后终止反应。也可以根据上述原理，利用本发明的血 竭素抗体制备各种检测血竭真伪的试剂盒，以便于现场快速检测。 血竭素是小分子物质，不具备免疫原性，不能直接剌激动物产生抗体，要想制备血 竭素的抗体，就必须把血竭素与相应大分子载体蛋白偶联构建人工抗原，并用合成的人工 抗原免疫动物产生特异性抗体。利用本发明的方法可以方便快捷地获得血竭素人工抗原， 成本低，效果好，利用合成的血竭素免疫抗原通过免疫动物，可以快速高效地获得血竭素抗 体。利用血竭素抗体鉴定中药材血竭的真伪，具有快速、灵敏的优点。
试验材料
1、材料和试剂
血竭素购于中国药" 完全佐剂均购于Sigma公司。
,生物制品检定所；对氨基苯甲酰肼、BSA、 OVA、弗氏完全和不 i和试剂均购于北京化学试剂公司。
美国Costar公司 芬兰Thermo公司
芬兰Thermo公司
芬兰Thermo公司 天津市中环实验电炉有限公司
其他常规药f 2、仪器设备 96孔可拆酶标板 二氧化碳培养箱 自动洗板机(Wellwash 4MK2) 酶联免疫检测仪(Multiskan MK3) 电热恒温培养箱 3、缓冲液 (1)包被缓冲液0. 05M的碳酸盐缓冲液，pH 9. 6 ; (2)PBS :含0. 9% NaCl的0. 1M磷酸盐缓冲液，pH 7. 5 ; (3) PBST :含有0. 1 % (v/v)吐温-20的PBS ; (4)样品稀释液含有0. 5% (w/v)明胶的PBST ; (5)底物缓冲液含0. 01M的柠檬酸三钠和0. 03M的Na2HP04， pH 5. 5 ; (6)显色液在10mL含有2mg/mL OPD的底物缓冲液中加入4 y L的30% H202 (7)终止缓冲液2M的硫酸溶液。
具体实施例方式
实施例1、血竭素抗原的合成(图1)
1、化合物1的合成 血竭素20mg，对氨基苯甲酰肼80mg，溶于95%甲醇，充氮气5(TC加热反应24小
时，TLC跟踪原料反应消失(氯仿甲醇氨水=95 : 5 : 2) ，PTix初步分离纯化合成的
半抗原，甲醇洗脱，旋转蒸干。 2、血竭素-BSA免疫原和血竭素-OVA包被原的合成 0. 02mmol合成的化合物1溶于5ml的0. lmol/L的盐酸溶液中，滴加过量的1 % 亚硝酸钠溶液，4t:避光持续搅拌反应，(亚硝酸钠的加入量可用淀粉碘化钾试纸进行监控，当试纸变为蓝黑色，说明亚硝酸钠过量)，溶液变成蓝黑色后，继续反应15min，用ra9. 0， 0. 2mol/L的硼酸缓冲液溶解20mgBSA或15mg0VA，边搅拌边加入重氮化的半抗原，调节ffl 至9.0左右，4t:搅拌反应过夜，PBS中透析3天。
实施例2、制备血竭素抗体 (1)取8-10周龄的Balb/C小白鼠为实验动物。 (2)实验免疫剂量基础免疫为0. lmg每只，加强免疫剂量为0. 15mg每只，用无菌 水稀释实施例1中得到的血竭素-BSA免疫抗原，无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐 剂，充分乳化，直到滴入水中不扩散。 (3)用乳化好的免疫抗原免疫小鼠，初免腹腔注射，加强免疫采用背部皮下多点注 射，注射O. 2-0. 3ml。 (4)基础免疫后，采用不完全弗氏佐剂乳化免疫抗原，方法同(2)，每隔2周进行加 强免疫，三免后开始，每次面以后7天从小鼠眼眶采血，测效价，待效价大于1 : IOOOO后， 采血，分离出抗血清，即得抗体。
实施例3 、小鼠血清效价的检测 第五免后7天小鼠眼眶采血，室温静置1小时后，放于4t:冰箱静置过夜。5000rpm 离心5min，收集血清，用间接非竞争ELISA检测血清效价(表1)。 (1)包被抗原用包被缓冲液将血竭素-OVA倍比稀释成适当的倍数，每孔加入
100iil，放入湿盒，于37t:温箱中包被3小时后，甩干孔内包被液，PBST洗涤5次。 (2)加入待测血清用样品稀释液将血清按照500， 1000， 2000， 4000， 8000倍稀释
后，每孔加入100ul，放入湿盒，于37。C温育30min后，PBST洗涤5次。 (3)加酶标二抗用样品稀释液对酶标二抗做适当稀释后，每孔加入100ul，于
37。C温育30min后，PBST洗涤5次。 (4)显色20mgOPD溶解于10ml底物缓冲液，加入4ul双氧水，混匀后每孔加入 100ul。 (5)终止反应用2M的硫酸溶液终止显色反应。 (6)判定结果血清效价定义为0D值为1时的小鼠血清稀释倍数。 表1小鼠血清效价检测结果
抗原 血清4000訓01600032000
4002.2161.5381.0590.670
8001.7561.1360.7980.496
16001.3050.8260.5100.401
32000.8680.5620.4220.208 实施例4、血清特异性检测 用间接竞争ELISA(图2)对小鼠血清进行特异性检测，根据竞争抑制率的大小判
定血清的特异性。 (1)包被同实施例3 (2)竞争抑制孔加入预先配置好的标准品50ul，空白孔加入50ul样品稀释液，将血清用样品稀释液按照500， 1000， 2000， 4000倍稀释后，每孔加入50ul，于37。C温育30min
后，PBST洗涤5次。 (3-5)同实施例3 (6)判定结果根据竞争抑制率判定小鼠血清的特异性。竞争抑制率=(阳性对 照孔OD值-抑制孔OD值)/阳性对照孔OD值X 100% 。如果竞争抑制率大于10%即可初 步判定血清具有特异性。(表2)(见图2)
表2血竭素小鼠的血清特异性检测结果
血清
2000 40008000 16000
Antiserum
抗原
I C I CI C I C
Immunogen
4001.7882.015 1.048 1.2280.6040.7470.370 0.452
8001.2611.6670.8420.9620.4650.5890.2310.370
16000.858U370.5460.6740.3350.4250.2090.274
32000.5670.7100.3630.4390.2120.2750.1650.208 注1为有血竭素时的OD值，C为没有血竭素时的OD值。
实施例5、标准曲线的建立 将血竭素标样按照100ug/ml ， 50ug/ml ， 25ug/ml ， 12. 5ug/ml ， 6. 25ug/ml ， 3. 125ug/ml ， 1.5625ug/ml稀释成不同浓度，选定包被抗原1 : 800，抗体1 : 2000作为建立标准曲线的 抗原抗体组合。所得结果经0rigin7.0软件计算并作图(图3)，根据曲线确定抑制中浓度 IC50为50-60ug/ml。 实施例6、中药材血竭真伪的鉴定 (1)将血竭和甘草lg于研钵中，研磨后，95X甲醇提取过夜，经氮气吹干后，加样 品稀释液稀释。 (2)取血竭素-OVA抗原，用包被液按1 : 800稀释，将96孔酶联板用蒸馏水洗涤
后，每孔加入所配血竭素-OVA抗原稀释液100 iU，于37。C保温3h ; (3)取小鼠抗血清，用样品稀释液l : 2000稀释，得抗血清稀释液； (4)取出酶联板，弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干，加入样品液50iil，再加
入50 iil抗血清稀释液，对照加入100 ii 1水，放37t:保温箱中保温30min ; (5)弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干后，每孔加入经1 : 2000稀释的HRP-山
羊抗小鼠IgG100iil，放入37。C保温箱中保温30min ; (6)酶联板用洗涤液洗涤4次甩干后，每孔加入底物OPD_H202溶液100 iU， 37。C保 温箱中保温10min后用50 iil 2M H2S04终止反应。 结果显示，血竭提取液的孔与甘草粉提取液的孔颜色有明显不同，含有血竭素的 颜色浅，不含有的颜色深，由此可鉴定血竭的真伪。
图1 :血竭素全抗原合成全过程示意图
6
图2 :血竭素间接竞争ELISA检测方法操作步骤示意图 图3 :基于血清建立的50%加样量icELISA标准曲线(BO和B分别为没有血竭素 和有血竭素时的OD值)。 表2血竭素小鼠的血清特异性检测结果 血清
2000 4000 8000 16000 Antiserum_
抗原
ImmunogenICICICIC
4001.7882.0151.0481.2280.6040.7470.3700.452
8001.2611.6670.8420.9620.4650.5890.2310.370
16000.8581.1370.5460.6740.3350.4250.2090.274
32000.5670.7100.3630.4390.2120.2750.1650.208 注1为有血竭素时的OD值，C为没有血竭素时的OD值。
实施例5、标准曲线的建立将血竭素标样按照100ug/ml ， 50ug/ml ， 25ug/ml ， 12. 5ug/ml ， 6. 25ug/ml ， 3. 125ug/ ml，l. 5625ug/ml稀释成不同浓度，选定包被抗原1 : 800，抗体1 : 2000作为建立标准曲 线的抗原抗体组合。所得结果经0rigin7.0软件计算并作图(图3)，根据曲线确定抑制中 浓度IC50为50-60ug/ml。
ug/ml 图3基于血清建立的50%加样量icELISA标准曲线(BO和B分别为没有血竭素和 有血竭素时的OD值) 实施例6、中药材血竭真伪的鉴定 (1)将血竭和甘草lg于研钵中，研磨后，95X甲醇提取过夜，经氮气吹干后，加样 品稀释液稀释。 (2)取血竭素-OVA抗原，用包被液按1 : 800稀释，将96孔酶联板用蒸馏水洗涤
后，每孔加入所配血竭素-OVA抗原稀释液100 iU，于37。C保温3h ; (3)取小鼠抗血清，用样品稀释液l : 2000稀释，得抗血清稀释液；
(4)取出酶联板，弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干，加入样品液50iil，再加 入50 ill抗血清稀释液，对照加入100 ii 1水，放37t:保温箱中保温30min ;
(5)弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干后，每孔加入经1 : 2000稀释的HRP-山 羊抗小鼠IgG100iil，放入37。C保温箱中保温30min ; (6)酶联板用洗涤液洗涤4次甩干后，每孔加入底物OPD_H202溶液100 iU， 37"C保 温箱中保温10min后用50 iil 2M H2S04终止反应。 结果显示，血竭提取液的孔与甘草粉提取液的孔颜色有明显不同，含有血竭素的 颜色浅，不含有的颜色深，由此可鉴定血竭的真伪。
权利要求
血竭素抗体，是用血竭素抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清中分离得到的；所述血竭素抗原按如下过程制备先将血竭素溶解在甲醇中，然后加入适量的对氨基苯甲酰肼，TLC跟踪血竭素反应完全，生成化合物1，然后将化合物1重氮化后与载体蛋白连接，得到血竭素抗原。
2. —种制备血竭素抗体的方法，是用血竭素抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清 中分离得到血竭素抗体，其特征在于先将血竭素溶解在甲醇中，然后加入适量的对氨基苯 甲酰肼，TLC跟踪血竭素反应完全，生成化合物l，然后将化合物1重氮化后与载体蛋白连 接，得到血竭素抗原。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述载体蛋白需先在O-l(TC条件下溶解 于pH9-10的碳酸盐缓冲液中。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清 白蛋白、兰素蛋白或卵清白蛋白。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述得到血竭素抗原后，对其进行透析或 过s印hadex G-25柱以除去未联结的血竭素及有机溶剂，然后冷冻干燥以浓縮制备得到血 竭素抗原。
6. 血竭素抗体在鉴定中药材血竭真伪中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于鉴定过程包括如下步骤(1) 血竭和待测药材经95 %的甲醇提取，提取液经氮气吹干后，加适量样品稀释液成 样品液；(2) 应用血竭素抗体采用ELISA方法检测样品液；(3) 通过观察样品液的颜色，鉴别样品的真伪。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于步骤(2)所述应用血竭素抗体采用ELISA 方法检测样品液按如下步骤进行(1) 用血竭素包被抗原包被酶联板；(2) 向酶联板上同时加入血竭素样品和血竭素抗体，反应过后加入酶标二抗进行反应；(3) 加入0PD-H202溶液底物后终止反应。
9. 包括权利要求1所述血竭素抗体的试剂盒。
全文摘要
本发明公开了血竭素抗体及其制备方法与应用，涉及小分子抗体及其制备与应用领域。本发明的目的是提供血竭素抗体及其制备方法，以及血竭素抗体在鉴定中药材血竭素真伪上的应用。本发明所提供的血竭素抗体，是用血竭素抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清中分离得到的；所述血竭素抗原按如下过程制备先将血竭素溶解在甲醇中，然后加入适量的对氨基苯甲酰肼，TLC跟踪血竭素反应完全，生成化合物1，然后将化合物1重氮化后与载体蛋白连接，得到血竭素抗原。应用血竭素抗体采用ELISA方法检测中药材样品，可以鉴定血竭真伪。
文档编号C07K14/435GK101747433SQ20081018260
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者付梅红, 何素平, 南铁贵, 方婧, 林小玲, 王保民, 谭桂玉, 赵洪伟, 黄燕颜, 黄璐琦 申请人:中国中医科学院中药研究所;灏川生物科技有限公司