专利名称：Rtef-1变体及其用于抑制血管发生的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域并且特别是涉及血管形成中所涉及的过程(血管发 生)。
背景技术：
转录增强因子1相关(RTEF-I)基因是TEA DNA结合结构域基因家族成员。TEA DNA 结合结构域基因家族从构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、酵母、果蝇属(Drosophila)、小 鼠至人高度保守。TEA DNA结合家族蛋白质可参与不同基因的活化或阻抑，并且它们的这 些特定功能可以通过与其他蛋白质的结合而改变(Kaneko和DePamphilis，1998)。已经在 多种哺乳动物组织，包括心脏、骨骼肌、胰、胎盘、脑和肺中鉴定出这些基因特定成员的表达 (Stewart 等，1996 ；Yasunami 等，1996 ；Farrance 等，1996)。对于转录增强因子 _1 (TEF-I)， 已经在一种组织如胰中鉴定出源于一个基因的选择性剪接的同种型(Zuzarte等，2000 ； Jiang等，2000)。这些基因在哺乳动物眼中的表达谱尚未见报道。RTEF-I基因转录物从鸡组织中首次鉴定出来，并且证明在心肌和骨骼肌中富集 (Farrance等，1996)。鸡RTEF-I结合肌细胞特异性CAT(M-CAT)顺式DNA元件并且调节 肌肉特异性基因的表达，并且对于完全的转录活化需要肌肉特异性辅因子。随机筛选2166 个人结肠直肠癌cDNA文库鉴定出部分cDNA RTEF-I序列，这导致从心cDNA文库分离出禽 RTEF-I的全长人同系物(Stewart等，1996 ；Frigerio等，1995)。对人组织的Northern印迹 分析表明在骨骼肌和胰中表达水平最高，在心、肾和胎盘中表达水平较低，而在肝、肺或脑 中未检测到信使(Stewart等，1996)。对小鼠RTEF-I同系物的Northern印迹分析显示了与 人不同的组织表达方式。成年小鼠肺组织表达水平最高，在肾、心和骨骼肌中水平极低，在 肝、胸腺、脾和脑中未检测到，而RTEF-I信使在小鼠胚胎骨骼肌中丰富(Yockey等，1996)。 已经在小鼠骨骼肌细胞中鉴定出RTEF-I的小鼠选择性剪接同种型，与全长基因相比，该同 种型缺乏外显子5 (Yockey等，1996)。血管内皮生长因子(VEGF)是一种促血管生成因子，已知在视网膜组织中，低氧条 件将其上调(Young 等，1997 ；Pierce 等，1996 ；Donahue 等，1996 ；Pe' er 等，1995)。最近， 已经鉴定出全长RTEF-I蛋白质不但结合VEGF启动子，而且还上调VEGF表达，例如在低氧 条件下的牛主动脉内皮细胞中(BAEC) (Shie等，2004)。微列阵分析显示，低氧条件下的 BAEC中RTEF-I表达上调3倍。令人惊讶地，RTEF-I通过与VEGF启动子内的Spl元件，而 非M-CAT模体相互作用介导VEGF基因活化。而且，RTEF介导的VEGF表达的实现不依赖于 低氧诱导因子(HIF-I)和低氧应答元件(HRE)途径的活化(Shie等，2004)。VEGF过表达已经牵涉许多种血管生成性病症，如肿瘤血管发生和异常新血管形 成。例如，已经非常确定，VEGF在早产儿视网膜病变(ROP)和其他眼睛新血管形成疾病的发展和严重性中起着重要的作用(Lashkari等，2000 ；Miller, 1997 ；Vannay等，2005 ；Young 等，1997)。考虑到VEGF在此类病症中的突出作用，已经开发出用于抑制VEGF活性的许多 治疗策略。然而，当前的VEGF阻断治疗典型地引起抑制细胞外VEGF与相应细胞表面受体 的相互作用。因此，需要用于VEGF阻断的可替代的策略，例如用于抑制VEGF产生的方法。
发明内容
在第一个实施方案中，本发明提供分离的显性失活(DN)的RTEF-I多肽，包含具 有一个或一个以上内部缺失的RTEF-I氨基酸序列。如本文所使用的术语显性失活意思是 指RTEF-I变体抑制或降低如SEQ ID NO 1所例举的完整RTEF-I多肽的活性。例如，在某 些方面中，DN RTEF-I变体可以定义为当在细胞表达时抑制或者降低VEGF启动子活性的多 肽。此外，在一些情况下，DN RTEF-I可以定义为降低或抑制低氧诱导的或RTEF-I (例如SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4)诱导的VEGF启动子活性的多肽。在某些方面中， RTEF-I氨基酸序列可以是哺乳动物RTEF-I氨基酸序列，优选人RTEF-I氨基酸序列。因此，在某些方面中提供包含一个或一个以上内部氨基酸缺失的DNRTEF-I多肽。 例如，在某些情况下DN RTEF-I可以包含由外显子3、4、5、6、7、8、9或10编码的氨基酸的缺 失。例如，在某些特定实施方案中，DN RTEF-I可以包含由外显子4、5、6、7、8和/或9编码 的全部氨基酸序列的缺失。此外，在某些特定情况下，DN RTEF-I可以包含来自外显子3和 /或外显子10的氨基酸的部分缺失，例如由外显子3编码的大约最后5个氨基酸的缺失或 者由外显子10编码的大约最初11个氨基酸的缺失。此外，本领域技术人员将会理解，与野 生型RTEF-I序列，诸如人RTEF-I序列相比，DN RTEF-I可以包含氨基酸替代。因此，在某 些情况下，DN RTEF-I可以定义为包含一个或一个以上内部氨基酸缺失的RTEF-I多肽，其 中 DN RTEF-I 与野生型 RTEF-I 序列(例如 SEQID NO =USEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO 4)在 非缺失氨基酸区域范围内有大约或者至少大约70、75、80、85、90、95、98或99%相同。在一 些非常特别的方面中，RTEF-I显性失活多肽可以包含与SEQ ID N0:3(由651bp cDNA编码 的氨基酸序列)有大约或者至少大约70、75、80、85、90、95、98或99%相同的RTEF-I氨基 酸序列。在一些非常特别的方面中，DN RTEF-I多肽可以包含由SEQ ID NO :3给出的序列。 本发明考虑的DN RTEF-I多肽的更多实施方案在具体实施方式
中提供。在一些进一步的方面中，DN RTEF-I多肽可以包含细胞内化部分。在一些情况下， 细胞内化部分可以结合或缀合至DN RTEF-I多肽。例如，DN RTEF-I可以与脂质体囊泡的 复合体提供，由此使多肽穿过细胞膜成为可能。此外，在一些特定实施方案中，细胞内化部 分可以是肽、多肽、适体或高亲合性多聚体(avimer)(见例如美国申请号20060234299和 20060223114)序列。例如，细胞内化部分可以包含来自HIV tat、HSV-I间层蛋白VP22或 果蝇属触角蛋白(antermopedia)的氨基酸。在某些近一步的方面中，细胞内化部分可以是 工程化的内化部分，诸如由Wright等(2003)和Rothbard等(2000)等描述的聚精氨酸、聚 甲硫氨酸和聚甘氨酸肽。例如，细胞内化部分可以是此处例举的RMRRMRRMRR(SEQ ID NO 23)。因此，在一些情况下，多肽细胞内化部分和DN RTEF-I多肽可以包含融合蛋白。因此，在某些情况下，提供包含细胞内化部分和DN RTEF-I序列的DNRTEF-I融合 蛋白。技术人员会理解，此类融合蛋白可额外包含将细胞内化部分与DN RTEF-I多肽序列 分开的一个或一个以上氨基酸序列。例如，在一些情况下，连接体序列可分开这样的两个结
5构域。例如，连接体序列可以包含带有大量或者大程度构象自由的“挠性”氨基酸，诸如多 聚甘氨酸连接体。在一些情况下，连接体序列可以包含蛋白酶切割位点。例如，在某些方面 中，连接体序列可以包含被细胞内蛋白酶识别和切割的切割位点，因此一旦融合蛋白被内 化，则将DN RTEF-I序列从内化序列释放出来。在本发明的进一步的方面中，细胞内化部分可以进一步定义为细胞靶向部分，其 是仅仅被所选择细胞群体，诸如表达特定细胞受体的细胞结合或内化的部分。此类细胞靶 向可以包括例如结合细胞表面蛋白的抗体、生长因子、激素、细胞因子、适体或高亲合性多 聚体。如本文所使用的术语抗体可以指IgA、IgM、IgE、IgG、Fab、F(ab' )2、单链抗体或者 互补位肽。在某些情况下，本发明的细胞靶向部分可以靶向特定类型的细胞，诸如视网膜细 胞、内皮细胞、虹膜细胞或神经元细胞。在仍然进一步的方面中，本发明的细胞靶向部分可 以定义为癌细胞结合部分。例如，在一些非常特别的情况下，本发明的细胞靶向部分可靶向 癌细胞相关抗原，如gp240或Her-2/neu。在本发明的仍然进一步的方面中，DN RTEF-I多肽可以包含额外的氨基酸序列，诸 如细胞运输信号(例如细胞分泌信号、核定位信号或者细胞核输出信号)或者报告分子多 肽，诸如酶或荧光蛋白。在优选的方面中，例如，DN RTEF-I多肽包含细胞分泌信号。例如， 如本文所例举，DN RTEF-I多肽可以包含来自人基因的分泌序列，诸如IL-2分泌信号序列 (MYRMQLLSCIALSLALVTNS, SEQ ID NO :22)。因此，在某些情况下，DN RTEF-1多肽可以包含细 胞内化部分和细胞分泌信号，由此允许多肽被一种细胞分泌并被内化进入周围的细胞内。在本发明的进一步的实施方案中，提供包含编码如上所述DN RTEF-I多肽序列的 分离的核酸序列。因此，编码本文所述任何DN RTEF-I多肽或多肽融合蛋白的核酸序列也 作为本发明的部分包括在内。技术人员会理解，鉴于遗传密码子的简并性，许多种核酸序列 可用于编码相同的多肽。在某些情况下，例如编码任何特定氨基酸的密码子可以被改变以 改善细胞表达或者降低核酸在基因组RTEF-I位点重组的机会。在优选的方面中，编码DN RTEF-I多肽的核酸序列包含在表达盒内。如本文所使 用的术语“表达盒”意思是指使得DN RTEF-I在细胞、或更特别地在真核细胞内表达的所包 含的额外核酸序列。此类额外的序列可以包含例如启动子、增强子、内含子序列(例如在DN RTEF-I编码区之前、之后或者之内)或者多腺苷化信号序列。技术人员会认识到，表达盒中 包含的序列可以用于改变DNRTEF-I的表达特性。例如，细胞类型特异性、条件性或可诱导 启动子序列可用于将DN RTEF-I限制在所选择的细胞类型或生长条件下。例如，在某些情 况下，低氧可诱导启动子可用于本发明的RTEF-I表达盒中。此外，在一些情况下，在眼的癌 细胞或细胞中具有增强活性的启动子可以使用。此外，考虑了可对RTEF-I多肽序列做某些 改变以便增强表达盒，例如如本文所例举的表达盒的表达，DNRTEF-I的起始密码子可以改 变成ATG以促进高效翻译。在本发明的仍然进一步的方面中，DN RTEF-I编码序列可以包含在表达载体中， 诸如病毒表达载体。用于根据本发明使用的病毒表达载体包括但不限于腺病毒、腺伴随病 毒、疱疹病毒、SV-40、反转录病毒和痘苗病毒载体系统。在某些优选的方面中，反转录病毒 载体可以进一步定义为慢病毒载体。在一些情况下，此类慢病毒载体可以是自失活(SIN) 慢病毒载体，诸如美国申请号20030008374和20030082789中描述的那些，美国申请号 20030008374和20030082789并入本文作为参考。
在仍然进一步的实施方案中，本发明涉及用于降低或抑制RTEF-I依赖性转录活 性的方法。如本文所使用的术语RTEF-I依赖性转录活性指，被如SEQ IDNO =USEQ ID NO: 2或SEQ ID NO :4所例举的全长或者完全活性RTEF-I多肽的表达所介导或增强的转录。因 此，在一些方面，本发明提供用于抑制或降低VEGF启动子活性(并且由此抑制或降低VEGF 表达)的方法，包括在细胞中表达DN RTEF-I多肽。因此，在特定实施方案中，提供用于治疗 患有血管生成性病症的患者的方法，包括向患者施用有效量的治疗组合物，所述治疗组合 物包含如上所述的RTEF-I显性失活多肽或者编码RTEF-I显性失活多肽的核酸表达载体。 在优选的方面中，本文所描述的方法可用于治疗人患者。如本文所使用的术语血管生成性病症指涉及不良血管形成的病症，诸如眼新血管 形成、动静脉畸形、冠状动脉再狭窄、外周血管再狭窄、肾小球肾炎、风湿性关节炎或癌症 (例如肿瘤血管形成)。因此，在某些情况下，本发明方法可以用于治疗眼病，诸如黄斑变 性(例如年龄相关的黄斑变性(AMD))、角膜移植排斥、角膜新血管形成、早产儿视网膜病变 (ROP)和糖尿病视网膜病变。例如，本发明方法可以用于治疗湿性或干性AMD。因此，在某 些情况下，本发明方法可用于治疗多种AMD相关的眼病变，诸如典型为主性、微小典型性和 隐匿无典型性损害(Gragoudas等，2004)。技术人员会理解，额外的抗血管生成治疗可以与本发明方法组合或结合使用。此 种额外的治疗可以在本文所述方法之前、之后或者基本上同时施用。例如，额外的抗血管生 成治疗可以拮抗VEGF和/或FGF信号途径。因此，在一些情况下，额外的治疗可以包括施用 结合VEGF、VEGF受体、FGF或FGF受体的抗体。在某些特定方面中，本发明的方法和组合物 可以与AVASTIN (贝伐单抗)、LUCENTIS (兰尼单抗)、MACUGEN (哌加他尼 钠)或抗炎药结合使用。因此，在某些特定情况下，提供包含在可药用载体中的DN-RTEF-I 成分和贝伐单抗或哌加他尼钠的治疗组合物。在仍然进一步的方面中，调节血管发生的基 因可以与本发明方法结合递送。例如，在一些方面中，调节血管发生的基因可以是金属蛋白 酶组织抑制剂、内皮抑制素、血管抑制素、内皮抑制素XVIII、内皮抑制素XV、kringle 1_5、 PEX、基质金属蛋白酶-2的C末端血管素结合蛋白结构域、人纤维蛋白溶酶原的kringle 5 结构域、内皮抑制素和血管抑制素的融合蛋白、内皮抑制素和人纤维蛋白溶酶原kringle 5 结构域的融合蛋白、干扰素Y诱导的单核因子(Mig)、干扰素α可诱导蛋白IO(IPlO)、Mig 和IPlO的融合蛋白、可溶性FLT-I (鳍样酪氨酸激酶1受体)、和激酶插入结构域受体(KDR) 基因。在某些特定方面中，此类血管生成调节物基因可以可以在病毒载体，诸如美国专利 7，122，181中所述的慢病毒载体中递送，美国专利7，122，181通过参考并入本文。如上所述，在某些方面中，本发明提供用于治疗癌症的方法。因此，在某些情况下， 所述方法可以用于限制或者减少向肿瘤的血液流动，由此降低肿瘤生长或转移。在某些情 况下，本文的方法可以用于抑制或治疗转移癌。许多种癌症类型可以用本发明方法治疗，例 如治疗的癌症可以是膀胱癌、血癌、骨癌、骨髓癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、眼癌、肠胃 道癌、牙龈癌、头癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、颈癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸 癌、舌癌或子宫癌。此外，额外的抗癌治疗可以与本发明方法组合或结合使用。此类额外治 疗可以在本发明方法之前、之后或同时施用。例如，额外的抗癌治疗可以是化学疗法、手术 疗法、免疫疗法或放射疗法。考虑了本发明的DN RTEF-I组合物可以向患者局部性或者全身性施用。例如，本发明的方法可以包括局部、静脉内、真皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺 内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、球 囊内(intravesicularIy)、粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、经吸入、经注射、经灌注、经连续 灌注、经直接浸浴靶细胞的局部灌注、经导管或经灌洗施用DN RTEF-I组合物。如上所述，在 DNRTEF-I组合物向眼睛递送的一些情况下，施用可以是例如经局部、结膜下、眼周、眼球后、 筋膜囊、前房内、玻璃体内、眼内、视网膜下、后近巩膜或脉络膜上施用。在某些方面中，DN RTEF-I组合物可以通过眼内注射、局部施用而向眼睛局部性施用(例如以滴眼剂制剂)。在一些进一步的实施方案中提供包含在瓶中的本发明的药物组合物，所述瓶包含 能够使组合物点滴施用的出射口。在一些情况下，瓶中所包含的药物组合物包含多剂量，然 而在某些方面中，瓶包含用于向一只或两只眼睛施用的单一剂量单位，优选地在1-2滴制 剂中包含单一剂量单位。如本文所使用的术语“瓶”指任何流体容器，诸如安瓿、滴管或注 射器。在本发明方法和/或组合物背景下所讨论的实施方案可以用于本文所述的任何 其他方法或组合物。因此，关于一种方法或组合物的实施方案同样可以应用于本发明的其 他方法和组合物中。如本说明书所使用，“一”可以指一个或一个以上。如权利要求书中所使用，词“一” 与词“包含”结合使用时意思是指一个或一个以上。权利要求书中“或”的使用用于指“和/或”，除非明确指出是仅指替代物或者替代 物相互排斥，虽然本公开支持指仅仅替代物和“和/或”的定义。如本文所使用“另一”可 以指至少第二个或者更多。在本申请通篇中，术语“大约”用于指数值包括设备、被采用来测定数值的方法或 者研究受试者当中所存在变化的固有误差变动。不分明的其他目标、特征和优势根据下列详细描述会变得显而易见。然而，应当理 解，详细描述和指示本发明优选实施方案时的特定实例仅以例举的方式给出，因为根据该 详细描述，处于本发明精神和范围之内的各种改变和修改对本领域技术人员而言是显而易 见的。
下列附图是本说明书的一部分，并且内含着进一步说明本发明的某些方面。通过 参考附图并结合着本文所提出的特定实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。图IA-B =RTEF-ImRNA剪接在低氧时被改变。视网膜和虹膜内皮细胞置于低氧条 件下并且通过RT-PCR分析RTEF-I剪接。图1A，通过RT-PCR鉴定的RTEF-I剪接变体的示 意图。显示了每一剪接变体的非翻译区(斜影线)和氨基酸编码区(空柱)的外显子序 列。也图示了推定的RTEF-I功能结构域，方格框指示TEA DNA结合结构域(星号显示预测 的α "螺旋的位置)，实心框指示核定位信号(外显子4)，垂直影线指示活化结构域(脯氨 酸丰富结构域(PRD))并且水平影线指示外显子9和10内的两个STY结构域。图1Β，琼脂 糖凝胶电泳的再现，显示从人视网膜血管内皮细胞(RVEC)原代培养制备的RTEF-I特异性 RT-PCR产物。泳道1和4 =DNA梯带；泳道2 从正常含氧量条件下的RVEC制备的cDNA，得 到2个产物(1305和936bp大小)；泳道3 从低氧条件下的RVEC制备的cDNA,得到3个产物(1305,936 和 447bp 大小)。图2 =RTEF-I变体活化或抑制VEGF启动子。293T细胞以VEGF启动子报告分子 构建体(VEGF启动子驱动分泌的碱性磷酸酶)连同包含所标明RTEF-I变体的表达载体转 染。结果显示，以pSEAP-VEGF启动子加上包含1305bp (柱1)、936bp (柱2)、651bp (柱3)、 ss-651-RMR bp (柱6)或447bp (柱4) RTEF-I变体的pcDNA表达构建体转染6小时后的培 养基AP活性。柱5显示与无插入片段的pcDNA对照质粒共转染的对照VEGF启动子活性。图3 =RTEF-I对VEGF启动子活性的调节依赖于包含4个SPl结合位点的VEGF启 动子部分。如上所述，细胞以包含1305bp (柱l)、936bp (柱2)、651bp (柱3)、ss-651bp (柱 6)或447bp (柱4) RTEF-I变体的pcDNA表达构建体和包含完整VEGF启动子(实柱)或带 有从-113位核苷酸至-57位核苷酸缺失的VEGF启动子(空柱)的报告载体转染。柱5显 示与无插入片段的PcDNA对照质粒共转染的对照VEGF启动子活性。图4:651bp RTEF-I以显性失活起作用。如上所述，细胞以pSEAP_VEGF和单独的 (柱 1、3 和 5)或者外加 ss-651-RMR bp RTEF-1 变体(柱 2、4 和 6)的 1305bp (柱 1、2)、 936bp (柱 3、4)或 447bp (柱 5、6)RTEF-1 变体转染。图5A-C =RTEF-I多肽的检测。针对RTEF-1独特的、但每一天然存在变体共有的氨 基酸序列产生抗体。图5A是RTEF-I的一个区域与相关转录因子之间的氨基酸比对。用于 产生抗体的氨基酸序列加下划线。图5B，使用抗RTEF-I抗体的免疫印迹的再现。用于分析 的细胞裂解物来自转染有PcDNA空载体(泳道2和8)或1305bp (泳道3、9)、936bp (泳道 4、10)、651bp (泳道5、11)或447bp (泳道6、11) RTEF-1变体的pcDNA表达载体的细胞。对 每一 RTEF-I变体的检测通过椭圆形标明。泳道1和7为分子量标准。泳道1-6代表来自 泳道7-12的过曝光图像。图5C，使用抗RTEF-I抗体从转染有pcDNA 651bp RTEF-I表达载 体的细胞中检测RTEF-I变体的免疫印迹的再现。预期的 24KDa多肽通过箭头标明。图6A-B =RTEF-I变体在眼睛中表达。图6A，免疫印迹的再现，显示正常灵长类眼组 织中的RTEF-I表达。免疫印迹分析在来自视网膜(泳道1)、脉络膜(泳道2)和虹膜(泳 道3)组织裂解物的蛋白质上开展。M指示分子量标准。图6B，溴化乙锭染色的琼脂糖凝 胶的再现，用于显示使用RTEF-I特异性引物产生的半定量RT-PCR产物。泳道1显示来自 CRAO视网膜的结果而泳道2显示来自对照视网膜RNA的结果。图7A-D =RTEF-I在灵长类眼组织中表达的免疫组织化学分析。图7A-B，RTEF-I强 染色定位于虹膜(I)、睫状体(CB)、视神经(ON)和视网膜(R)。角膜(C)和晶状体(L)为 RTEF-I抗体杂交阴性。图7C-D，最强的RTEF-I染色出现在神经节细胞层(GCL)和内核层 (INL)。染色定位在细胞质和细胞核中。在外层缺乏染色。
具体实施例方式最近，已经开发出许多种抑制血管生成信号的策略，用于治疗癌症和血管生成性 病症诸如AMD目的的。具体而言，许多种策略集中于通过抑制VEGF与一种或两种其表面受 体的结合而阻断VEGF信号。然而，这些策略不能够解决启动异常血管发生的VEGF最初产 生。因此，抑制VEGF产生的新方法和组合物可以提供用于VEGF阻断的新方法和对所产生 的血管发生的治疗。为此目的，在某些方面中，本发明提供在VEGF活化中所必需的显性失 活转录因子。此外，由于本发明涉及靶向细胞内过程，因此本发明的治疗可以靶向特定细胞类型，由此减少不良的全身性副作用。因此，本发明提供治疗血管生成性病症的新方法和/ 或增强当前VEGF阻断策略有效性的途径。RTEF-I是多功能转录因子家族的成员，并且已经证明是VEGF转录、包括低氧诱导 的VEGF转录的激活剂。然而，如本文所显示，细胞中产生多种RTEF-I剪接变体并且从选择 性RNA剪接变体产生的RTEF-I多肽包含改变的转录功能(图1A，B)。具体而言，一种大约 651碱基对的RTEF-I转录物产生抑制VEGF启动子活性的多肽(图2，比较柱3和5)。此外， 已经证明，当该RTEF-I变体以与分泌信号和细胞内化多肽的融合蛋白提供时，它是VEGF启 动子的甚至更有效的抑制剂(图2，柱6)。重要的是，如图4中所示，来自651bp RTEF-I转 录物的多肽以显性失活方式作用。这就是说，多肽不但降低VEGF启动子活性，而且还阻断 其他RTEF-I蛋白质同种型对VEGF启动子的增强作用。此外，如图6和7中所示，RTEF表 达于眼组织中，由此暗示其在眼新血管形成病症发展中起重要作用。本文研究表明，RTEF-I 对VEGF产生的活化可能是促成新血管形成病症发展的因素之一。因此，本发明的方法和组 合物可以提供用于预防早期阶段新血管形成的手段。本发明提供新DN RTEF-I多肽及其预防或抑制血管生成性病症的用途。DNRTEF-I 多肽可以直接递送至细胞内环境中或者在所靶向细胞内表达以阻断VEGF产生。此类显性 失活多肽不但下调新生VEGF的产生，而且还下调在诸如低氧过程中常常被RTEF-I刺激的 VEGF的产生。因此，本发明的组合物可以用于降低所靶向细胞和组织募集新血管形成的能 力。这对于例如血管侵入与疾病发病机制直接相关的眼新血管形成病症，诸如AMD具有重 要意义。此外，DN RTEF-I可以用于通过降低肿瘤或肿瘤转移灶经新血管形成获得营养物 质的能力来治疗肿瘤或肿瘤转移灶。因此，还提供减慢肿瘤生长和/或引起肿瘤消退的方 法。此外，由于本发明的组合物靶向细胞内转录物，因此本发明的组合物可以用于通过使用 特异性细胞靶向/内化部分来靶向受累组织，由此降低在其他非靶向组织中的副作用。I.显性失活RTEF-I多肽许多RTEF-I变体在本文描述并表征了其功能。例如，本文特别研究的四个序列包 含下列氨基酸序列。由1305bp RTEF-I人cDNA编码的SEQ ID NO 1是具有下列序列的434个氨基酸 的蛋白质LEGTAGTITSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIILS DEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTRTRKQVSSHIQVLARRKAREIQAKLKDQAAKDKALQSMAAMSSAQIISATAFHS SMRLARGPGRPAVSGFWQGALPGQAETSHDVKPFSQQTYAQPPLPLPGFESPAGPAPSPSAPPAPPWQGRRRGSSKL WMLEFSAFLEQQQDPDTYNKHLFVHIGQSSPSYLRPYLEAVDIRQIYDKFPEKKGGLKDLFERGPSNAFFLVKFWAD LNTNIEDEGSSFYGVSSQYESPE匪IITCSTKVCSFGKQWEKVETEYARYENGHYSYRIHRSPLCEYMINFIHKLK HLPEKYMMNSVLENFTILQVVTNRDTQETLLCIAYVFEVSASEHGAQHHIYRLVKE由936bp人cDNA编码的SEQ ID NO 2是具有下列序列的311个氨基酸的蛋白质LEGTAGTITSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIIL SDEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTRTRKQVSSHIQVLARRKAREIQAKLKYNKHLFVHIGQSSPSYLRPYLEAVDI RQIYDKFPEKKGGLKDLFERGPSNAFFLVKFWADLNTNIEDEGSSFYGVSSQYESPENMIITCSTKVCSFGKQVV EKVETEYARYENGHYSYRIHRSPLCEYMINFIHKLKHLPEKYMMNSVLENFTILQVVTNRDTQETLLCIAYVFEV SASEHGAQHHIYRLVKE
由651bp人cDNA编码的SEQ ID NO 3是具有下列序列的216个氨基酸的蛋白质LEGTAGTTTSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIILS DEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTSSFYGVSSQYESPE匪IITCSTKVCSFGKQWEKVETEYARYENGHYSYRIHRS PLCEYMINFIHKLKHLPEKYMMNSVLENFTILQVVTNRDTQETLLCIAYVFEVSASEHGAQHHIYRLVKE由447bp人cDNA编码的SEQ ID NO 4是具有下列序列的148个氨基酸的蛋白质LEGTAGTITSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIIL SDEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTRTRKQVSSHIQVLARRKAREIQAKLKFWQGALPGQAETSHDVKPFSQHHIYR LVKE如上所述，在本发明的某些方面中，显性失活(DN)RTEF-I多肽可以包含一个或一 个以上内部氨基酸缺失。例如，在一些情况下，DN RTEF-I可以包含由外显子3、4、5、6、7、8、 9或10编码的氨基酸的缺失。例如，在某些方面中，DN-RTEFl包含SEQ ID NO 3氨基酸序 列或其衍生物。表1 由编码外显子编码的RTEF-I氨基酸序列
外显子编码的氨基酸序列1N/A2LEGTAGTITSNEffSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDAEGVffSPDIE QSFQEALAIYPPCGRRKIILSDEGKMYG* (SEQ ID NO 5)3RNELIARYIKLRTGKTRTRKQ(SEQ ID NO 6)4VSSHIQVLARRKAREIQAKLK(SEQ ID NO 7)5DQAAKDKALQSMAAMSSAQIISATAFHSSMALARGPGRPAVSG (SEQ ID NO 8)6FWQGALPGQAGTSHD* (SEQ ID NO 9)7VKPFSQQTYAVQPPLPLPG* (SEQ ID NO 10)8FESPAGPAPSPSAPPAPPWQGRSVASSKL WMLEFSAFLEQQQDPDT (SEQ ID NO 11)9YNKHLFVHIGQSSPSYSDPYLEAVDIRQIYDKFPEKKGGLKDLFERGP SNAFFLVKFff(SEQ ID NO 12)
权利要求
包含具有一个或一个以上内部缺失的RTEF 1氨基酸序列的分离的RTEF 1显性失活多肽，其中所述多肽降低VEGF启动子活性，RTEF 1氨基酸序列包含由RTEF 1外显子2、3、10、11和12编码的氨基酸并且缺失由RTEF 1外显子3、4、5、6、7、8、9和10编码的氨基酸。
2.权利要求1的分离的RTEF-I显性失活多肽，其中RTEF-I氨基酸序列包含至少16个 由外显子3编码的氨基酸。
3.权利要求1的分离的RTEF-I显性失活多肽，其中RTEF-I氨基酸序列包含至少36个 由外显子10编码的氨基酸。
4.权利要求1的分离的RTEF-I显性失活多肽，其中RTEF-I氨基酸序列与SEQID NO 3至少大约95%相同。
5.权利要求4的分离的RTEF-I显性失活多肽，其中多肽具有SEQID NO 3中给出的 序列。
6.权利要求1的分离的RTEF-I显性失活多肽，还包含分泌信号序列。
7.权利要求1的分离的RTEF-I显性失活多肽，还包含细胞内化部分。
8.权利要求7的分离的RTEF-I显性失活多肽，其中内化部分是肽、多肽、适体或者高亲 合性多聚体。
9.权利要求8的分离的RTEF-I显性失活多肽，其中内化部分包含来自HIVtat、HSV-I 间层蛋白VP22或果蝇属触角蛋白的内化序列。
10.权利要求8的分离的RTEF-I显性失活多肽，其中内化部分包含聚精氨酸、聚甲硫氨 酸和/或聚甘氨酸肽。
11.权利要求7的分离的RTEF-I显性失活多肽，其中内化部分包含氨基酸序列 RMRRMRRMRR(SEQ ID NO :23)。
12.权利要求7的分离的RTEF-I显性失活多肽，其中内化部分是抗体。
13.权利要求12的分离的RTEF-I显性失活多肽，其中抗体内化部分是IgA、IgM、IgE、 IgG、Fab、F(ab，)2、单链抗体或互补位肽。
14.权利要求1的分离的RTEF-I显性失活多肽，还包含细胞分泌信号和细胞内化部分。
15.权利要求14的分离的RTEF-I显性失活多肽，其中分泌信号序列包含人IL-2分泌 信号序列(SEQ ID NO 22)。
16.权利要求15的分离的RTEF-I显性失活多肽，进一步限定为具有SEQIDNO :3、SEQ ID NO 22 和 SEQ ID NO 23 的序列。
17.分离的核酸序列，包含编码权利要求1-16任意一项的RTEF-I显性失活多肽的序列。
18.权利要求17的分离的核酸序列，进一步限定为核酸表达盒。
19.权利要求18的分离的核酸序列，进一步限定为病毒表达载体。
20.权利要求19的分离的核酸序列，其中病毒表达载体是腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病 毒、SV-40、反转录病毒或痘苗病毒载体。
21.权利要求20的分离的核酸序列，其中病毒表达载体是腺伴随病毒。
22.权利要求20的分离的核酸序列，其中病毒表达载体是慢病毒表达载体。
23.权利要求22的分离的核酸序列，其中慢病毒表达载体是HIV载体。
24.权利要求23的分离的核酸序列，其中表达盒包含细胞类型特异性或可诱导启动子。
25.权利要求24的分离的核酸序列，其中可诱导启动子是低氧可诱导启动子。
26.权利要求24的分离的核酸序列，其中可诱导启动子是血管发生可诱导启动子。
27.权利要求17的分离的核酸序列，还包含第二抗血管发生基因。
28.用于治疗患有血管生成性病症患者的方法，包括向患者施用有效量的治疗组合物， 所述治疗组合物包含权利要求1-16任意一项的RTEF-I显性失活多肽或者权利要求17-27 任意一项的编码RTEF-I显性失活多肽的核酸表达载体。
29.权利要求28的方法，其中血管生成性病症是眼新血管形成、动静脉畸形、冠状动脉 再狭窄、外周血管再狭窄、肾小球肾炎或风湿性关节炎。
30.权利要求29的方法，其中血管生成性病症是眼新血管形成。
31.权利要求28的方法，其中病症是黄斑变性、角膜移植排斥、角膜新血管形成、早产 儿视网膜病变(ROP)或糖尿病视网膜病变。
32.权利要求31的方法，其中病症是年龄相关的黄斑变性(AMD)。
33.权利要求28的方法，还包括施用第二抗血管生成治疗。
34.权利要求33的方法，其中第二抗血管生成治疗是结合VEGF、VEGF受体、FGF、FGF受 体、贝伐单抗、兰尼单抗或哌加他尼钠的抗体。
35.权利要求28的方法，其中血管生成性病症是癌症。
36.权利要求35的方法，其中癌症是转移癌。
37.权利要求35的方法，其中癌症是膀胱癌、血液癌、骨癌、骨髓癌、脑癌、乳腺癌、结肠 癌、食道癌、眼睛癌、肠胃道癌、牙龈癌、头癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、颈癌、卵巢癌、前列 腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、舌癌或子宫癌。
38.权利要求37的方法，其中癌症是眼黑素瘤。
39.权利要求35的方法，还包括施用第二抗癌治疗。
40.权利要求39的方法，其中第二抗癌治疗是化学疗法、手术疗法、免疫疗法或放射疗法。
41.权利要求28的方法，其中患者是人。
42.权利要求28的方法，其中治疗组合物包含权利要求1-17任意一项的RTEF-I显性 失活多肽。
43.权利要求28的方法，其中治疗组合物包含权利要求18-27任意一项的编码RTEF-I 显性失活多肽的核酸表达载体。
44.权利要求28的方法，治疗组合物全身施用。
45.权利要求28的方法，其中治疗组合物局部施用。
46.权利要求28的方法，其中治疗组合物施用至眼睛。
47.权利要求46的方法，其中治疗组合物局部地或者眼内注射施用至眼睛。
48.权利要求47的方法，其中治疗组合物作为滴眼剂施用。
全文摘要
描述了转录增强因子1相关(RTEF-1)的显性失活(DN)变体。DN RTEF-1多肽可以直接靶向至细胞或者在核酸表达载体中递送，以改变细胞转录。描述了用于抑制VEGF产生并由此治疗血管生成性病症，诸如癌症的方法。例如，在某些方面中，DN RTEF-1可用于治疗眼睛的血管生成性病症，诸如年龄相关的黄斑变性(AMD)。
文档编号C07K14/435GK101970472SQ200880100483
公开日2011年2月9日 申请日期2008年6月6日 优先权日2007年6月6日
发明者J·蒂莫西·斯托特, 本诺伊·阿普库坦, 特雷弗·麦可法兰德 申请人:研究发展基金会